축산 퇴비 내 세균군집의 다양성 및 유용미생물 자원 탐색 = Biodiversity and Microbial Resources Collected from Livestock Compost

국문 초록 (Abstract)

충청남북도 12개 지역의 축산농가로부터 축산 폐기물을 이용하여 자가 발효한 퇴비를 수집하였다. 이들 축산 퇴비의 물리 화학적 특성 및 미생물학적 특성에 대해 조사한 결과, 우분 및 계분을 주성분으로 한 퇴비의 pH는 7.3∼9.4로 약알칼리성을 나타내었으며, 돈분을 주성분으로 한 퇴비는 pH6.5로 약산성을 나타내었다. 본 연구에서 수집된 축산 퇴비의 C/N율은 9.4∼26.3으로 ‘그린퇴비’의 기준인 40이하를 나타내었다. 이들 각 축산 퇴비의 미생물군집 밀도를 조사한 결과, 호기성 세균군은 2.3×107∼1.5×109cfu/g로 높은 밀도로 검출되었고, 방선균군은 1.0×106∼5.4×107cfu/g로 분포하여 축산 퇴비 내에 방선균군의 밀도가 높게 존재해 있음을 알 수 있었다. 곰팡이와 효모군은 2.3×104∼1.9×108cfu/g, 유산균군은 4.6×104∼7.3×105cfu/g 그리고 장내세균군은 2.3×104∼1.5×108cfu/g이 분포하였다.
방선균이 가장 높은 밀도로 분포하며 부숙이 충분히 이루어져 악취를 발생하지 않는 Com5 퇴비를 부숙 퇴비로 선발하고, 부숙이 충분히 이루어지지 않아 심한 악취를 발생하며 분원성 장내세균의 밀도가 가장 높게 검출된 Com4 퇴비를 미부숙 퇴비로 선발하였다. 이들 부숙 퇴비와 미부숙 퇴비 내 세균군집의 계통학적 특성을 비교 평가를 위하여 각 퇴비로부터 total DNA를 직접 추출하고 16S rDNA PCR에 대한 세균군집의 계통학적 해석을 수행하였다. 부숙 퇴비(Com5) 내에는 Firmicutes 계통군이 48%로 우점을 이루었고 그밖에 Bacteroidetes 계통군(18%), Proteobacteria 계통군(26%), Actinobacteria 계통군(6%), Chloroflexi 계통군(2%)이 분포하였다. 반면에 미부숙 퇴비(Com4) 내에는 Firmicutes 계통군이 16%에 불과하였으며, α-, β-, γ-, δ-proteobacteria 계통군을 포함한 Proteobacteria 계통군이 60%를 차지하여 우점 계통군으로 확인되었다. 그 외 Bacteroidetes 계통군(14%), Actinobacteria 계통군(6%), 그리고 Verrucomicrobia 계통군(4%)이 분포하였다.
부숙 퇴비(Com5)로부터 방선균 50균주를 순수분리하고 이들 방선균의 16S rDNA 염기서열을 기초로 계통학적 위치를 검토한 결과, 분리된 방선균은 모두 Streptomyces 속에 속하였으며, S. thermocoprophilus, S. diastaticus, S. goraiensis 등을 포함하는 clusterⅠ에 속하는 균주는 44균주, S. bikiniensis, S. showdoensis, S. lateritius 등이 포함된 clusterⅡ에 속하는 방선균은 3균주, S. thermolineatus, S. malaysiensis 등을 포함하는 clusterⅢ에 속하는 방선균은 3균주로 부숙 퇴비 내에는 다양한 방선균이 존재함을 알 수 있었다. 특히 clusterⅠ에 속하는 방선균은 전 분리균주의 88%로 부숙 퇴비 내 우점 방선균 계통군임이 확인되었다.
상기의 부숙 퇴비로부터 순수분리된 방선균을 대상으로 식물병원성 곰팡이 (Rhizoctonias olani, Collectotrichum glocosprioides, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Pythium ultimum, Phytophthora capsic, Alternaria panax)에 대해 항균 활성능을 검토하고 항균활성능이 가장 우수한 균주를 선발한 후 이들 균주의 분류ㆍ동정을 수행하였다.
인삼 탄저병원균에 대해 항균활성능을 나타내는 K-52균주는 갈색의 기균사를 형성하고 chain형의 포자를 형성하는 형태학적 특징을 나타내었으며, 주요 균체지방산으로는 anteiso-C15:0, anteiso-C17:0와 iso C16:0의 분지형 지방산을 포함하였으며, 주요 퀴논종으로는 MK-9(H4), MK-9(H6), MK-9(H8)를 함유하였다. 또한, total DNA 의 G＋C 함량은 74.3 mol%로 나타났고, 16S rDNA 염기서열 분석결과 Streptomyces rutgersensis로 동정되었다. 시들음병원균에 대해 항균활성능을 나타내는 K-13균주는 백색의 기균사와 갈색의 기질 균사체를 형성하였으며, 주요 균체지방산으로는 C16:0, anteiso-C15:0, anteiso-C17:0, iso-C15:0,을 포함하였으며 16S rDNA 염기서열 분석결과 Streptomyces flavus로 동정되었다. 모잘록병원균에 대해 항균활성능을 나타내는 K-35균주는 기균사를 형성하지 않고 배지 안쪽으로 백색의 기질 균사체를 형성하는 특징을 나타내었다. 주요 균체지방산으로는 C18:0, C18:1 W7C을 함유하며 16S rDNA 염기서열 분석결과 S. showdoensis로 동정되었다. 고추 역병균에 대해 항균활성능을 나타내는 KY-5균주는 백색의 기중균사와 흑갈색의 색소를 함유하고 coil형의 포자를 형성하는 특징을 나타내었다. 주요 균체지방산으로는 C16:0, anteiso-C15:0, anteiso -C17:0을 함유하였고 16S rDNA 염기서열 분석결과 S. tubercidicus 로 동정되었다.
잔디 예초물을 이용한 퇴비화 과정 중 온도변화에 따라 퇴비발효 초기(Ⅰ), 60℃이상의 고온을 유지하는 고온기(Ⅱ), 첫 뒤집기 실시 후 50∼60℃를 유지하는 중온기(Ⅲ), 두 번째 뒤집기 후 40∼55℃를 유지하면서 2차 발효과정을 가지는 후발효기(Ⅳ)로 나누어 각각 시료를 채취하고 퇴비화 미생물 677균주를 분리하였다. 이들 세균에 대해 고분자 화합물(단백질, 전분, 섬유소) 가수분해능을 조사한 후 ‘고온성 효소생성 균주(thermophilc enzyme producing bacteria)’를 선발하고 분류ㆍ동정을 실시하였다.
초고온성 단백질분해효소 생성균주 C-2는 Gram 양성, 간상 형태를 나타냈으며 유포자 세균으로 주요 지방산은 iso-C15:0, iso-C16:0, iso-C17:0을 함유하였으며 16S rDNA 염기서열 분석결과 Geobacillus kaustophilus로 동정되었다. 고온성 섬유소분해효소 생성균주의 경우 활성능이 강한 3균주가 최종 선발되었다. IIIC-1

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

We studied the biodiversity of microbial communities and resources in livestock compost. The fermented livestock compost samples were collected from different 12 areas in Chungcheong-do. A quantitative evaluation of the microbial population in the livestock compost samples was examined by using the plate count method. Aerobic bacteria numbers in livestock compost samples ranged from 2.3×107 to 1.5×109cfu g-1, actinomyces numbers ranged from 1.0×106 to 5.4×107cfu g-1, fungi and yeast numbers ranged from 2.3×104 to 1.9×108cfu g-1, lactobacillus numbers ranged from 4.6×104to 7.3×105cfu g-1, and coliform bacteria numbers ranged from 2.3×104 to 1.5×108cfu g-1.
Com5 was the label given to the ‘mature compost’in which the composting process was sufficiently accomplished and an offensive odor was not present. This compost contained the highest density figures for actinimycetes. Com4 on the other hand, is a compost in which the composting process were not sufficiently accomplished and had a serious offensive odor. The population of coliform bacteria was the highest in this 'immature compost'.
Biodiversity of bacterial populations in mature and immature compost samples were analyzed by direct extraction of DNA and 16S rDNA cloning method. Based on the 16S rDNA sequences, compositions of bacterial populations from matured compost (Com 5) was classified into 5 phylogenetic groups; Firmicutes (48%), Bacteroidetes(18%), Proteobacteria (26%), Actinobacteria (6%), and Chloroflexi (2%). Biodiversity of bacterial populations in immature compost (Com 4) were also classified into 5 phylogenetic groups; Firmicutes (16%), Proteobacteria (60%), Bacteroidetes (14%), Actinobacteria (6%), and Verrucomicrobia (4%). Phylogenetic characteristic of Com 5 revealed abundant bacterial populations in the Firmicutes and Actinobacteria phyla.
Fifty strains of bacteria were isolated as actinomycetes from the matured compost. These isolates were identified based on phylogeneticanalysis using 16S rDNA gene nucleotide sequences, and categorized in the group to which the Streptomyces species belong. In Streptomyces systematics, Benjamin was grouping streptomycetes using 16S-ITS RFLP fingerprinting. The fifty actinomycetes were found to fall within three Streptomyces clusters; cluster I (44 strains), cluster II (3 strains) and cluster III (3 strains). Antifungal effect against Alternaria panax, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Phytopthora capsici, Pythium ultimum and Rizoctonia solani of four Streptomyces species were investigated. Four strains were identified (Streptomyces rutgersensis K-52, S. flavus K-13, S. showdoensis K-35 and S. tubercidicus KY-5) by using chemotaxonomic and phylogenetic analysis.
The composting material used were three kinds of turf grass produced from a country club (C.C.) with chicken slurry added as nitrogen source. During the composting, the temperature was rapidly increased to 70ºC after four days and kept at that level for the duration of the thermophilic phase. The top layer's temperature was decreased to 40ºC. While the compost was fermenting, the temperature didn't change and became stabilized. Major enzyme activity occurred gradually after the thermophilic phase as a result of the turf grass degradation. We obtained 677 isolated from the turf grass clippings compost. In the course of screening for bioactive compounds from turf grass compost bacteria, 4 strains were selected for analysis of thermophilic enzyme producing bacteria. The four strains were identified (Geobacillus kaustophilus C-2, Bacillus subtilis IIIC-12, Serratia ureilytica IF-15 and Pseudomonas aeruginosa IF-22) using chemotaxonomic and phylogenetic analysis.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 5
• Ⅱ. 재료 및 방법 7
• 1. 축산 퇴비의 수집 및 잔디 예초물 퇴비화 공정 7
• (1) 축산 퇴비의 수집 7
• (2) 잔디 예초물 퇴비화 공정 7
• 2. 퇴비 시료의 물리ㆍ화학적ㆍ미생물학적 및 효소학적 특성 평가 9
• (1) 퇴비의 pH 9
• (2) 퇴비의 탄질율(C/N ratio) 9
• (3) 퇴비 내 미생물군집의 정량적 평가 9
• (4) 잔디 예초물 퇴비화 과정 중 온도측정 및 시료 채취 10
• (5)잔디 예초물 퇴비화 과정 중 고분자 화합물 분해 효소 활성측정 11
• ① 퇴비로부터 조효소 추출 11
• ② 단백질분해효소(protease) 활성 측정 11
• ③ 섬유소분해효소(cellulase) 활성 측정 11
• ④ 전분분해효소(amylase) 활성 측정 12
• 3. 분자 기법을 이용한 퇴비 내 세균군집의 계통학적 해석 12
• (1) 퇴비로부터 total DNA의 직접 추출 12
• (2) 16S rDNA의 PCR 증폭 13
• (3) 16S rDNA clone library 구축 14
• (4) 16S rDNA 염기서열 분석 및 계통도 작성 15
• 4. 퇴비의 생물학적 안전성 평가 16
• (1) IMVIC test를 이용한 퇴비의 생물학적 안전성 평가 16
• (2) 선택배지를 이용한 병원성 미생물 검출 17
• ① Salmonella sp.와 Shigella sp.검출 17
• ② E. coli O157:H7 및 E. coli 검출 17
• ③ Listeria monocytogenes 검출 17
• ④ Brucella sp. 검출 17
• ⑤ Staphylococcus aureus 검출 18
• ⑥ Yersinia enterocolitica 검출 18
• 5. 퇴비로부터 미생물의 순수분리 18
• (1) 부숙 퇴비로부터 방선균의 분리 18
• (2) 잔디 예초물 퇴비로부터 미생물의 순수분리 19
• 6. 유용미생물 유전자원 탐색 19
• (1) 식물병원균에 대한 항균활성 검정 19
• (2) 고분자 화합물 분해 효소 생성균주의 분리 20
• ① 단백질 분해 효소 생성균주의 분리 20
• ② 섬유소 분해 효소 생성균주의 분리 20
• ③ 전분 분해 효소 생성균주의 분리 21
• 7. 축산 퇴비로부터 분리된 방선균의 계통학적 해석 21
• (1) 방선균의 DNA 추출 21
• (2) 16S rDNA PCR 증폭 22
• (3) rpoB 유전자 PCR 증폭 22
• 8. 고온성 고분자 화합물 분해효소의 효소학적 특성 23
• (1) 단백질 분해 효소의 특징 평가 23
• ① 온도에 따른 기질 반응도 및 온도 안정성 평가 23
• ② pH에 따른 기질 반응도 및 pH 안정성 평가 24
• ③ 계면활성제 및 금속이온에 따른 효소 활성 변화 24
• (2) 섬유소 분해 효소의 특성 평가 24
• ① 온도에 따른 기질 반응도 측정 24
• ② 온도 안정성 평가 24
• 9. 유용미생물유전자원의 분류ㆍ동정 25
• (1) 주사형 전자현미경을 이용한 세포형태 관찰 25
• (2) 호기성 일반세균의 DNA 추출 및 16S rDNA 염기서열 분석 25
• (3) 균체지방산 조성 분석 26
• (4) Quinone 종 분석 26
• (5) DNA G+C 함량 측정 27
• (6) 생리학적 특성 평가 28
• (7) ARDRA와 RAPD 분석 28
• Ⅲ. 결과 및 고찰 30
• 제 1장. 축산 퇴비의 물리ㆍ화학적 및 미생물학적 특성 30
• 1. 축산 퇴비의 물리ㆍ화학적 특성 30
• 2. 축산 퇴비 내 미생물 군집 특성 33
• 제 2장. 부숙 퇴비와 미부숙 퇴비 내 세균군집의 계통학적 특성 및 생물학적 안전성 평가 37
• 1. 부숙 퇴비와 미부숙 퇴비로부터 핵산 추출 및 clone library 구축 38
• (1) 퇴비로부터 직접 DNA 추출 및 PCR 증폭 38
• (2) 16S rDNA clone library 구축 39
• (3) 16S rDNA clone의 colony PCR 40
• 2. 부숙 퇴비 및 미부숙 퇴비 내 세균군집의 계통학적 해석 41
• (1) 부숙 퇴비 내 세균군집의 계통학적 특성 평가 41
• (2) 미부숙 퇴비 내 세균군집의 계통학적 특성 평가 42
• 3. 부숙 퇴비와 미부숙 퇴비 내 세균군집의 계통학적 특성 비교 43
• (1) 주요 세균군집의 계통학적 특성 비교 43
• (2) Firmicutes 계통군과 Actinibacteria 계통군의 비교 44
• (3) Bacteroidetes 계통군의 비교 45
• (4) γ-proteobacteria 계통군의 비교 48
• (5) 부숙 퇴비와 미부숙 퇴비의 생물학적 안전성 평가 50
• 제 3장. 식물병원성 곰팡이에 대한 항균활성 균주의 탐색 53
• 1. 부숙 퇴비로부터 방선균의 분리 및 계통학적 특성 53
• (1) 부숙 퇴비로부터 방선균의 순수분리 53
• (2) 부숙 퇴비로부터 분리된 방선균의 16S rDNA의 계통학적 특성 55
• (3) rpoB 유전자를 이용한 계통학적 재해석 57
• 2. 식물병원성 곰팡이에 대한 항균활성 검정 60
• (1) 인삼 탄저병원균에 대한 항균활성 검정 60
• (2) 모잘록병원균에 대한 항균활성 62
• (3) 시들음병원균에 대한 항균활성 검정 64
• (4) 점무늬병원균에 대한 항균활성 검정 65
• (5) 고추역병균에 대한 항균활성 검정 66
• (6) 잿빛 곰팡이병원균에 대한 항균활성 검정 67
• 제 4장. 고분자 화합물 분해 효소 생성 균주의 탐색 70
• 1. 예초물 퇴비화 과정 중 물리 화학적 및 미생물학적 특성 71
• (1) 퇴비화 과정 중 온도 변화 71
• (2) 퇴비화 과정 중 pH의 변화 72
• (3) 퇴비화 과정 중 탄질율(C/N ratio)의 변화 73
• (4) 퇴비화 과정 중 미생물군집의 밀도 변화 74
• 2. 퇴비화 과정 중 효소학적 특성 77
• 3. 고분자 화합물 분해능 고온성균주의 분리 80
• 4. 고온성 고분자 화합물 분해 효소 활성균주의 선발 81
• (1) 고온성 protease 활성균주의 선발 및 계통학적 해석 81
• (2) 고온성 cellulase 활성균주의 선발 및 계통학적 해석 83