5탄당인산회로를 이용한 Streptomyces lividans의 균주 재설계

국문 초록 (Abstract)

다른 방선균에서처럼 Streptomyces lividans는 탄소 대사 경로로 glycolysis와 pentose phosphate pathway(PPP)를 이용하는데, 2차대사물질을 생합성 하는데 매우 중요한 1차대사 경로이다. 본 연구는 pentose phosphate pathway를 강화시킬 때 PPP 중간산물인 sedoheptulose 7-phosphate의 생산이 증가될 것이라는 가정 하에 실험을 진행했다. 왜냐하면 거의 모든 미생물 세포의 pentose phosphate pathway 에서 nicotinamide adenine dinucleotide 2'-phosphate (NADPH)가 생산이 되고 NADPH는 생합성 반응에 환원제로서 작용을 하고 있기 때문이다. 특히 NADPH는 pentose phosphate pathway(PPP)에 존재하는 두 개의 효소인 glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH)를 coding하는 zwf1,2 유전자와 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGDH)를 coding하는 zwf3 유전자에 의해서 생성이 된다. 그리고 zwf 유전자의 downstream에 존재하는 opc 유전자가 zwf 의 activity에 positive영향을 준다고 보고되어 있다. 따라서 본 논문에서는 zwf나 opc 유전자를 과 발현시킨 균주들에서 pentose phosphate pathway가 활성화 되는지와, 활성화된다면 NADPH 와 sedoheptulose 7-phosphate 농도와는 어떤 상관관계가 있는지를 규명하려고 하였다.
본 실험은 이미 밝혀진 Streptomyces coelicolor A3(2) 균주의 유전체 정보를 이용해서 PCR로 zwf1, zwf2, zwf3, opc1, opc2 유전자들을 획득 하고 이 유전자들을 9개의 다른 조합으로 pWHM3 vector를 이용해서 Streptomyces lividans TK24 균주에 도입했다. HPLC와 LC-MS analysis를 통해서 NADPH와 sedoheptulose 7-phosphate의 농도를 각각 측정 하였다. control 균주와 비교했을 때, 유전자를 도입한 균주들에서 NADPH 농도가 약 2-5배정도 증가되었고 sedoheptulose 7-phosphate 농도도 1.6배정도 증가되었다. 이런 결과들로부터 유전자가 도입된 transformants에서 pentose phosphate pathway가 보다 활성화된다는 것을 입증하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The biosynthesis of secondary metabolites are affected by the balance of redox metabolism in whith NADH is gererated and NADPH is confumed. Furthermore, pentose phosphate pathway (PPP) and glycolysis are the known major metabolic pathways for the primary metabolism of different carbon sources. Therefore, the present thesis was oriented to improve the biosynthesis of NADPH in actinomycetes Streptomyces lividans. I hypothesized that an increase of the primary intermediate product (sedoheptulose 7-phosphate) could result in the elevation of secondary metabolites concentration, due to the enhanced activities of pentose phosphate pathway. In most Streptomyces, the reduction reaction by NADPH is essential necessary steps and the majority of NADPH is produced by the activity of two enzymes in the pentose phosphate pathway. Glucose-6-phosphate dehydrogenase is encoded by either zwf1 or zwf2, and 6-phospho gluconate dehydrogenase is encoded by zwf3. According to the report (Sundaram et al., 1998), the two genes (zwf1 and zwf2) were translationally coupled with the downstream opc genes. That was regarded as an essential for Zwf activity in Cyanobacteria and Corynebacterium glutamicum. Therefore, enhancing the activity of reduction, in the metabolic pathway of the cell, could be an effective way to induce overproduction of secondary metabolites. On the basis of the rationale, firstly, I tried to overexpress zwf and opc genes for the purpose of increasing the performance of the PPP. Using genomic sequence data of S. coelicolor, the genes encoding the glucose-6-phosphate dehydrogenase and the 6-phosphogluconate dehydrogenase were cloned by PCR. Secondly, nine different combinations, using zwf1, zwf2, zwf3, opc1, and opc2 genes, were constructed in an E. coli-Streptomyces shuttle vector pWHM3, and introduced into Streptomyces lividans. Finally, the regulation of NADPH and sedoheptulose 7-phosphate was monitored by measuring the intracellular concentrations of NADPH from various transformants.
The concentrations of NADPH and sedoheptulose 7-phosphate were analyzed by HPLC and by LC-MS, respectively. In S. lividans, both NADPH and sedoheptulose 7-phosphate were noticeably increased by the induction of co-expressed zwf2+zwf3+opc2 gene products. Taken as a whole, the results clearly demonstrates that the pentose phosphate pathway could be exploited for the improved production of second ary metabolites in pharmaceutical industry.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 실험 재료 및 방법 = 5
• Ⅱ-1. 실험 재료 = 5
• Ⅱ-1-1. 사용균주 및 plasmids = 6
• Ⅱ-1-2. 사용시약 = 6
• Ⅱ-1-3. 사용배지 및 배양조건 = 6
• Ⅱ-2. 실험 방법 = 7
• Ⅱ-2-1. S.coelicolor A3(2) 로부터 zwf, opc 유전자의 획득 = 7
• Ⅱ-2-1-1. S.coelicolor A3(2) 로부터 유전자의 검색 = 7
• Ⅱ-2-1-2. Polymerase chain reaction(PCR) primer 제작 = 8
• Ⅱ-2-1-3. PCR 조건 = 8
• Ⅱ-2-2. vector 구축 = 8
• Ⅱ-2-3. 대장균에서의 DNA의 분리와 재조합 = 9
• Ⅱ-2-4. 방선균에서의 DNA의 분리 = 9
• Ⅱ-2-4-1. chromosomal DNA의 소량분리 = 9
• Ⅱ-2-4-2. plasmid DNA의 소량분리 = 10
• Ⅱ-2-5. 형질전환 = 10
• Ⅱ-2-5-1. 대장균의 competent cell 제조와 형질전환 = 11
• Ⅱ-2-5-2. 방선균의 protoplast 제조와 형질전환 = 11
• Ⅱ-2-6. protein sample 준비 및 단백질의 정량 = 12
• Ⅱ-2-7. SDS-PAGE 분석 = 13
• Ⅱ-2-8. cell growth curve = 13
• Ⅱ-2-9. 효소반응-NADPH 생성반응 = 13
• Ⅱ-2-10. HPLC 분석 = 14
• Ⅱ-2-11. LC-MS 분석 = 14
• Ⅲ. 결과 및 고찰 = 15
• Ⅲ-1. zwf coding gene cloning = 15
• Ⅲ-2. S. lividans TK24에서 zwf 의 overexpression = 15
• Ⅲ-3. S. lividans TK24 transformants의 성장곡선 = 16
• 1.1.11.Ⅲ-4. NADPH 농도 측정 = 16
• 1.1.15.Ⅲ-5. S. lividans TK24 transformants 형태와 생리분화 관찰 = 17
• Ⅲ-6. sedoheptulose 7-phosphate 분석 = 18
• Ⅳ. 결론 = 18
• Ⅴ. 참고문헌 = 44
• ABSTRACT = 47