Reconstruction of isobutanol pathways in recombinant Escherichia coli

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Isobutanol is one of the naturally occurring structural isomers of butanol in the fermentation process of carbohydrates. Isobutanol is a branched alcohol that is highly utilized in the biorefinery industry due to its attractive properties as a biofuel compared to bioethanol. In this study, five essential genes for isobutanol production were overexpressed: alsS gene from Bacillus subtilis, ilvC, ilvD and yqhD gene from E. coli, kivD gene from Lactococcus lactis. Moreover, for minimization of byproducts formation, a mutant E. coli strain without the frdA, ldhA, adhE, and pta genes in E. coli MG1655 (DE3) was used as the host bacteria. In a fed-batch fermentation with 10 g/L glucose and using a 2.5 L bioreactor, recombinant E. coli with plasmid pCDFDuet_alsS_ilvD_kivD and pETDuet_ilvC_yqhD produced up to 0.17 g/g isobutanol yield. Strain expressing als gene from Lactococcus lactis showed 1.71 g/L isobutanol production which was similar to alsS from Bacillus subtilis. That strain was not show a significant effect that the titer and yield of isobutanol. Fermentation with a dual cofactor system showed no significant difference in isobutanol yield compared to that without the system. noxE expression was effective to produce isobutanol in WT strain, but it wasn’t effective in K/O strain. Simultaneous expression of ilvCm, adhA and noxE genes, showed less isobutanol production than the WT strains.

국문 초록 (Abstract)

이소부탄올은 탄수화물의 발효 과정에서 자연적으로 발생하는 부탄올의 구조 이성질체 중 하나이다. 이소부탄올은 바이오 에탄올에 비해 바이오 연료로서 매력적인 특성 때문에 바이오 화학 산업에서 고도로 활용되는 분지 알코올이다. 본 연구에서는 이소 부탄올 생산을위한 5 가지 필수 유전자를 과발현하였다 : Bacillus subtilis의 alsS 유전자, 대장균의 ilvC, ilvD 및 yqhD 유전자, Lactococcus lactis의 kivD 유전자. 또한, 부산물 형성을 최소화하기 위해 E. coli MG1655 (DE3)에서 frdA, ldhA, adhE 및 pta 유전자가없는 돌연변이 대장균 균주를 사용하였다. 10 g/L 글루코오스 및 2.5 L 발효기를 이용한 유가식 발효에서, 플라스미드 pCDFDuet_alsS_ilvD_kivD 및 pETDuet_ilvC_yqhD를 갖는 재조합 대장균은 0.17g / g의 이소 부탄올 생산율을 나타냈다. Lactococcus lactis의 als 유전자를 발현하는 균주는 Bacillus subtilis 유래 alsS 유전자를 도입한 균주와 유사한 1.71g / L의 이소 부탄올 생산을 보였다. 그 균주는 이소 부탄올의 역가 및 수율이 유의 한 효과를 나타내지 않았다. 듀얼 코 팩터 시스템을 이용한 발효는 시스템이없는 경우와 비교하여 이소 부탄올 생산량에 큰 차이가 없음을 보여 주었다. noxE 발현은 WT 균주에서 이소 부탄올 생산에 효과적 이었으나 K/O 균주에서는 효과가 없었다. ilvCm, adhA 및 noxE 유전자의 동시 발현은 WT 균주보다 적은 이소부탄올 생산을 보였다.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION 1
• II. MATERIALS AND METHODS 6
• 2.1 Bacterial strains and plasmids 6
• 2.2 Medium and culture conditions in batch cultures 11
• 2.3 Genetic manipulation 12
• 2.4 Gas stripping process in fed-batch cultures 15
• 2.5 Analytic methods 18
• III. RESULTS 19
• 3.1 Characterization of designed recA gene knock-out strains 19
• 3.2 Production of isobutanol fermentation with different temperature 22
• 3.3 Fermentation of gas capturing process for isobutanol production 25
• 3.4 Dual-cofactor system 28
• 3.5 als gene from Lactococcus lactis 31
• 3.6 noxE gene effect 34
• IV. DISCUSSIONS 37
• REFERENCES 39
• FIGURE CAPTIONS 42