무시래기 추출물이 인체 유방암세포 MDA-MB-231의 세포증식과 사멸, 전이과정에 미치는 영향

국문 초록 (Abstract)

유방암은 꾸준히 증가하여 현재 우리나라 여성의 암발생률 2위를 차지하고 있다. 아직 암의 발병 원인이 확실하게 밝혀지진 않았으나 여러 요인이 관여하는 것으로 알려져 있고, 그 중에서 식이에 의한 요인이 35% 정도를 차지한다고 보고된 바 있다. 암을 예방하기 위해서는 채소의 섭취가 중요하다고 알려져 있다. 예로부터 채소가 대량 생산되던 시기에 저장성 향상을 위해 채소를 건조시켜 섭취하였다. 천연물 소재의 항암작용에 대한 많은 연구가 진행되고 있으나 건조채소 및 과일의 유방암에 대한 연구가 미비한 실정이다. 그러므로 본 연구에서는 건조채소와 과일 추출물이 인체 유방암세포 MDA-MB-231의 세포증식과 사멸 그리고 전이과정에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다. 80% ethanol로 추출한 여러 건조채소 및 과일 추출물이 세포 증식억제에 미치는 영향을 보기 위해 MTT assay를 실시하였고, 그 중 가장 낮은 농도에서 가장 효과가 있는 것을 선택하여 이후의 실험을 진행하였다. 무시래기 추출물은 0, 100, 200, 300 ㎍/mL 농도로, 씀바귀뿌리, 피자두, 키위, 금귤 추출물은 0, 250, 500, 1000 ㎍/mL 농도로 MDA-MB-231 cell에 처리한 후 0, 24, 48시간 후에 MTT assay를 실시하여 암세포 증식에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. 이 중 가장 효과가 있는 추출물을 선택하여 세포 증식과 관련이 있는 단백질인 ErbB2, ErbB3, Akt의 단백질 및 mRNA 발현에 미치는 영향과, Akt의 활성형인 pAkt의 단백질 발현 정도를 알아보았다. 세포 사멸과 관련된 Bcl2와 Bax의 단백질 및 mRNA 발현도 알아보았다. 암의 전이 과정에 미치는 영향에 대해 알아보기 위해 암세포의 부착성, 침윤성, 이동성과 침윤시 분비되는 단백분해 효소인 MMP2와 MMP9의 mRNA 발현정도를 알아보았다. 무시래기, 씀바귀뿌리, 피자두, 키위, 금귤 추출물을 MDA-MB-231 cell에 처리한 결과 씀바귀뿌리, 키위, 금귤 추출물 처리시 세포증식에 유의적인 차이가 없었다. 피자두 추출물 처리시 48시간 후 1000 ㎍/mL에서 유의적으로 세포증식이 억제되었다. 무시래기 추출물 처리시 48시간에 100 ㎍/mL에서 유의적으로 세포증식이 억제되어, 이후의 실험은 무시래기 추출물을 선택하여 실험하였다. 세포증식에 관여하는 ErbB2의 단백질 및 mRNA 발현은 100 ㎍/mL부터, ErbB3의 단백질 발현은 300 ㎍/mL, mRNA 발현은 100 ㎍/mL부터, Akt 단백질 발현은 200 ㎍/mL부터, pAkt 단백질 발현은 100 ㎍/mL부터, Akt의 mRNA 발현은 200 ㎍/mL부터 유의적으로 감소하였다. 세포사멸을 억제하는 Bcl2의 단백질 및 mRNA 발현은 200 ㎍/mL부터 유의적으로 감소하였고, 세포사멸을 유도하는 Bax의 단백질 발현은 100 ㎍/mL부터, mRNA 발현은 300 ㎍/mL에서 유의적으로 증가하였다. 전이과정별로 효과를 알아본 결과 세포의 부착성은 100 ㎍/mL부터, 침윤성은 200 ㎍/mL부터, 이동성은 100 ㎍/mL부터 유의적으로 감소하였고, MMP2의 mRNA 발현은 200 ㎍/mL부터, MMP9의 mRNA 발현은 300 ㎍/mL에서 유의적으로 감소하였다. 따라서 본 연구에서는 무시래기 추출물이 인체 유방암세포인 MDA-MB-231의 세포 증식을 억제하고, 사멸을 유도하며, 전이과정을 억제하는 것을 관찰하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Breast cancer has steadily increased to an extent that it accounts the second place in the cancer onset rate with females in Korea. While the causes of its onset have not been clearly shown, various factors are known to be involved, which a factor of diet has been reported to account for about 35%. Intake of vegetables is known to be important for prevention of a cancer. Long since vegetables were mass produced, vegetables have been dried for an improved storage ability and taken in. Although many studies on anticarcinogenic effects of natural ingredients are in progress, studies on the effects of dried vegetables and fruits on the breast cancer are scarce. Thus, this study examines the effects of dried vegetables and fruit extracts on cell proliferation, apoptosis, and metastasis of the human breast cancer cell, MDA-MB-231. MTT assay was conducted to see the effects of several dried vegetables and fruit extracts extracted with 80% ethanol on suppression of cell proliferation, from which the most effective ones at the lowest concentration have been selected for the subsequent experiments. An extract of Raphanus sativus L. leaf was treated on MDA-MB-231 cell in concentrations of 0, 100, 200, 300 ㎍/mL, and extracts of the root of Lxeris dentata Nakai, plumb, kiwi and kumquat in concentrations of 0, 250, 500, 1000 ㎍/mL, followed by execution of MTT assay to study their effects on proliferation of cancer cells. Of these the most effective extracts were selected, for which the effects on the expression of proteins related to cell proliferation such as proteins of ErbB2, ErbB3, Akt and mRNA and the extent of expression for the active type of Akt such as pAkt. Expressions of the proteins of Bcl2 and Bax as well as mRNA related to cell apoptosis have also been investigated. To see the effects on metastasis of the cancer, adhesion, invasion, motility of the cancer cells, and the extent of mRNA expression of matrix metalloproteinase such as MMP2 and MMP9 secreted upon invasion have been studied. The treatment results on MDA-MB-231 cell of extracts including Raphanus sativus L. leaf, roots of Lxeris dentata Nakai, plumb, kiwi and kumquat showed no significant differences in cell proliferation in the cases of treating with extracts from roots of xeris dentata Nakai, kiwi, and kumquat. In the case of treating with plumb extracts, there was a significant inhibition of cell proliferation after 48 hours at 1000 ㎍/mL. When treated with extracts of Raphanus sativus L. leaf, there was a significant inhibition of cell proliferation after 48 hours at 100 ㎍/mL, after which the extract from Raphanus sativus L. leaf has been selected for further experiments. Significant decreases in expression occurred with the protein of ErbB2 and mRNA involved in cell proliferation from 100 ㎍/mL, with the protein of ErbB3 from 300 ㎍/mL, with mRNA from 100 ㎍/mL, with the protein of Akt from 200 ㎍/mL, with the protein of pAkt from 100 ㎍/mL, with mRNA of Akt from 200 ㎍/mL. Whereas the expressions of the protein of Bcl2 and mRNA suppressing cell apoptosis decreased significantly from 200 ㎍/mL, the expression of the protein of Bax inducing cell apoptosis increased significantly from 100 ㎍/mL along with that of mRNA from 300 ㎍/mL. According to examinations of the effects on metastasis, adhesion of the cells decreased significantly from 100 ㎍/mL, invasiion from 200 ㎍/mL, motility from 100 ㎍/mL, and the mRNA expression of MMP2 showed a significant decrease from 200 ㎍/mL, together with that of MMP9 from 300 ㎍/mL. Thus, it has been observed in the present study that the extract from Raphanus sativus L. leaf inhibits proliferation of human breast cancer cells of MDA-MB-231, induces their apoptosis, and suppresses metastasis as well.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 문헌고찰 3
• 1. 무 (Raphanus sativus L.) 3
• 1) 무 (Raphanus sativus L.) 3
• 2) 무시래기의 생리기능성 물질 3
• 2. 유방암 4
• 1) 유방암의 정의 및 종류 5
• 2) 유방암의 위험요인 5
• 3) 유방암과 식이요인 6
• 3. 세포성장과 사멸 6
• 1) Epidermal growth factor receptor (EGFR) 6
• 2) Apoptosis 7
• 4. 전이 8
• Ⅲ. 재료 및 방법 9
• 1. 재료 10
• 2. 세포배양 10
• 3. 세포증식 억제와 사멸 10
• 1) 세포증식 (MTT assy) 10
• 2) 단백질 발현 (Western bolt analysis) 11
• 3) mRNA 발현 (RT-PCR) 12
• 4. 전이 15
• 1) 세포 부착성 (Adhesion assay) 15
• 2) 세포 침윤성 (Matrigel invasion chamber assay) 15
• 3) 세포 이동성 (Boyden chamber motility assay) 15
• 4) Matrix metalloproteinase mRNA 발현(RT-PCR) 16
• 5. 통계처리 16
• Ⅳ. 결과 및 고찰 17
• 1. 세포증식 (MTT assay) 17
• 2. 세포증식 관련 단백질 및 mRNA 발현 24
• 3. 세포사멸 관련 단백질 및 mRNA 발현 32
• 4. 전이 38
• 1) 세포 부착성 (Adhesion) 38
• 2) 세포 침윤성 (Matrigel invasion assay) 40
• 3) 세포 이동성 (Boyden chamber motility assay) 42
• 4) Matrix metalloproteinase mRNA 발현(RT-PCR) 44
• Ⅴ. 요약 및 결론 47
• 참고문헌 49
• 영문요약 59