2-세포기 생쥐 배아의 동결보존 전의 평형온도와 시간이 동결보존 후의 결과에 미치는 영향 = (The) Effect of Equilibration Temperature and Time Prior to Cryopreservation on the Outcome of Cryopreservation of 2-Cell Mouse Embryos

국문 초록 (Abstract)

목 적: 최근 인간 배아의 동결 및 해빙이 동결보존액으로 1,2-propanediol(PROH)를 사용함으로써 성공적으로 이루어지고 있다. 배아를PROH에 노출 시 평형온도 조절의 중요성이 보고된 바 있다. 본 실험은 2-세포기 생쥐 배아를 PROH에 노출 시 평형온도와 노출 시간에 따른 생쥐 배아의 발생에 미치는 영향을 알아보고, 2-세포기 생쥐 배아의 동결 전에 동결보존액에서의 적정 노출 온도와 시간을 알아보고자 한다.
방 법: 5-6주령의 ICR계통의 암컷 생쥐로부터 2-세포기 배아를 획득하여 15 M PROH를 포함하는 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에 37℃, 상온(22-24℃), 4℃에서 각각 0분(대조군), 10분, 30분씩 노출시킨 후 1, 0.5, 0 M PROH를 포함하는 PBS에 각 실험군의 배아를 순서대로 각각 5분씩 두어 PROH를 완전히 제거한 후 0.4% 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)이 포함된 Ham's F-10에서 배양하여 배아의 발생률을 비교 분석하였다. 한편, 상온과 4℃에서 15 M PROH를 포함하는 동결보존액에 2-세포기 생쥐배아를 각각 10분씩 노출시킨 후 동결-해빙 하여 배아의 발생률을 비교 분석하였다.
결 과: 37℃ PROH에서의 노출군은 대조군에 비해 배아 발생률이 유의하게 저해되었고(0분:54.8%, 10분 8.3%, 30분. 54%, p=0.047, 0.038), 상온 노출군에서는 대조군에 비해 노출시간이 길어질수록 배아 발생률이 감소하였으나 유의한 차이는 없었다(0분:47.2%, 10분 28.3% 30분: 23.7%). 한편 상온과 4℃에서 각각 동결보존 전에 PROH에 노출 후 동결-해빙 하였을 때 배아의 발생률은 대조군에 비해 낮았으나 유의한 차이는 없었고(대조군: 57.1%, 상온: 25.7%, 4℃ : 30.8%) 4℃ 노출군이 상온 노출군에 비해 배아 발생률이 높게 나타났으나 유의한 차이는 없었다.
결 론: 이상의 결과로 미루어 2-세포기 생쥐 배아를 PROH에 노출할 때 평형온도와 시간에 좌우되어 발생률의 차이를 나타냈으며, 상온과 4℃에서 2-세포기 생쥐 배아를 PROH에 10분간 노출시킨 후 동결-해빙하였을 때 배아의 발생률에 있어서 유의한 차이를 보이지 않았다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Objective One-cell human zygotes have been successfully frozen and thawed using l,2-propanediol(PROH) during freezing and thawing. This study was performed to assess the effect of equilibration temperature and time on cryopreservation of 2-cell mouse embryos by investigating the equilibration temperature and time during initial PROH exposure prior to cryopreservation
Materials and Methods: The late 2-cell mouse embryos were obtained from 5-6 week old ICR mice and were exposed to 1.5 M PROH in phosphate-buffered saline(PROH-PBS) at 37℃, room temperature(22-24℃), and 4℃ for 30 min The PROH was washed off the 2-cell mouse embyos by incubating them for 5 min each in 1, 0.5, and 0 M PROH-PBS in the order named. The 2-cell mouse embryos were subsequently cultured in Ham's F-10 medium and embryo development was assessed at 24, 48, and 96 hours.
Results: Incubation of 2-cell mouse embryos at 37℃ for 30 min significantly impaired embryo development to blastocysts. Embryo development after exposure to PROH at 37℃ for 10 min was 8.3%(P=0.047) and embryo development for 30 min was 5.4%(P=0.038). Incubation of 2-cell mouse embryos at room temperature or 4℃ for up to 30 min did not significantly reduce embryo development. Cryosurvival of 2-cell mouse embryos exposed to PROH at room temperature or 4℃ was similar.
Conclusion: These findings suggested that pronanediol is toxic to 2-cell mouse embryos in a temperature- and time-dependent fashion. Cryopreservation of 2-cell mouse embryos after exposure at 4℃ appears to be no better than after exposure at room temperature

목차 (Table of Contents)

• 목차
• 국문초록 = ⅰ
• ABSTRACT = ⅲ
• List of Tables = ⅴ
• Legend of Figure = ⅵ
• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 연구 목적 = 3
• Ⅲ. 연구 재료 및 방법 = 4
• 가. 실험동물 = 4
• 나. 과배란 유도 및 2-세포기 생쥐 배아의 회수 = 4
• 다. 2-세포기 생쥐 배아의 PROH에 노출 = 4
• 라. PROH 제거 후 2-세포기 생쥐 배아의 체외발생 = 6
• 마. 동결보존액의 제조 = 6
• 바. 2-세포기 생쥐 배아의 동결보존 = 6
• 사. 2-세포기 생쥐 배아의 해빙 = 8
• 아. 해빙 후 2-세포기 생쥐 배아의 체외 발생 = 8
• 자. 통계분석 = 8
• Ⅳ. 연구 결과 = 9
• 가. 2-세포기 생쥐 배아를 37˚C에서 1.5M PROH에 노출시켰을때 시간의 경과에 따른 배아 발생률 = 9
• 나. 2-세포기 생쥐 배아를 상온, 1.5 M PROH에 노출시켰을 때 시간의 경과에 따른 배아 발생률 = 9
• 다. 2-세포기 생쥐 배아를 4˚C, 1.5 M PROH에 노출시켰을 때 시간의 경과에 따른 배아 발생률 = 9
• 라. 2 세포기 생쥐 배아를 각각 상온과 4˚C 에서 1.5 M PROH에 노출 후 동결-해빙 후의 배아 발생률 = 10
• Ⅴ. 고찰 = 15
• Ⅵ. 결론 = 18
• 참고문헌 = 19