Effects of cuscutae semen on the cAMP-responsive element modulator (CREM) expression and sperm parameters in infertile male mice induced by Cyclophosphamide

국문 초록 (Abstract)

토사자(菟絲子)가 Cyclophosphamide로 유발된 불임 수컷 생쥐의 CREM 유전자 발현 및 생식 지표에 미치는 영향 연구
補肝腎益精髓의 효능으로 사용되는 菟絲子가 남성불임에 미치는 영향을 측정하기 위하여, cyclophosphamide에 의해 유발된 불임 수컷 생쥐에 菟絲子 추출물을 투여한 후 정자분석과 혈중 테스토스테론 농도, CREM과 CatSper 유전자 및 단백질 발현을 측정하고 정자 형성 과정에 중요한 spermatogonia (GC-1), spermatocyte (GC-2), Leydig cell, Sertoli cell에 미치는 영향을 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. 菟絲子 투여군의 GC-1, GC-2 cell 생존율이 정상군에 비해 유의하게 증가하였고, Leydig cell과 Sertoli cell의 생존율은 菟絲子 투여군과 정상군의 차이가 없었다.
2. 수컷 생쥐 Cyclophosphamide 투여군에 비하여 토사자 투여군은 체중대비 고환의 무게를 유의하게 증가시켰다.
3. Computer Assisted Semen Analysis (CASA) system으로 분석한 정자분석 결과, cyclophosphamide 투여군의 정자의 수 및 운동성은 정상군에 비해 유의하게 감소하였으며, 菟絲子 투여군은 대조군에 비해 정자의 수와 운동성이 유의하게 증가하였다.
4. Cyclophosphamide 투여군의 혈중 테스토스테론 농도는 정상군에 비해 유의하게 감소하였고, 菟絲子 500 mg/kg/day 와 1000 mg/kg/day 투여군에서 대조군에 비해 유의하게 증가하였다.
5. Cyclophosphamide 투여군의 정상군에 대한 CREM 유전자와 단백질 발현 정도는 유의하게 감소하였으며, 菟絲子 100 mg/kg/day 와 500 mg/kg/day 투여군에서 대조군에 비해 유의하게 증가하였다.
6. Cyclophosphamide 투여군의 정상군에 대한 CatSper 유전자와 단백질 발현 정도는 유의한 감소가 있었고, 菟絲子 투여군의 발현 정도는 농도에 따라 유의하게 증가하였다.
이상의 결과 菟絲子는 생식세포인 spermatogonia (GC-1)와 spermatocyte (GC-2)의 생존율을 증가시키고 cyclophosphamide에 의해 유도된 생식 독성에 대하여 남성호르몬의 증가와 정자의 수 및 운동성을 증가시키는 기전을 증명하였으며, 남성불임증의 치료에 응용될 수 있는 있음이 확인되었다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Materials and Methods 6
• 1. Chemicals and reagents 6
• 2. Preparation of Cuscutae Semen extract 7
• 3. Cell culture 8
• 4. Cell proliferation assay 8
• 5. Animals and experimental protocol 9
• 5. 1. Animals 9
• 5. 2. Treatment of cyclophosphamide and Cuscutae Semen 9
• 5. 3. Preparation of serum and tissues 10
• 6. Sperm analysis 10
• 7. Hormone assay 11
• 8. RNA isolation and RT-PCR 11
• 8. 1. Total RNA isolation from mouse testes 11
• 8. 2. cDNA synthesis and PCR-amplification 12
• 9. Western blotting analysis 13
• 10. Statistical analysis 14
• Ⅲ. Results 15
• 1. Effect of Cuscutae Semen extract on viability of germ cells 15
• 2. Changes of body and testis weights after Cuscutae Semen treatment 17
• 3. Effect of Cuscutae Semen on sperm count 19
• 4. Effect of Cuscutae Semen on sperm motility 21
• 5. Effect of Cuscutae Semen on serum testosterone levels 23
• 6. Effect of Cuscutae Semen on CREM mRNA levels in mouse testes 25
• 7. Effect of Cuscutae Semen on the expression of CREM protein in mouse testes 27
• 8. Effect of Cuscutae Semen on the expression of CatSper mRNA levels in mouse testes 29
• 8-1. CatSper2 29
• 8-2. CatSper3 31
• 9. Effect of Cuscutae Semen on CatSper protein levels in mouse testes 33
• 9-1. CatSper2 33
• 9-2. CatSper3 35
• Ⅳ. Discussion and Conclusions 37
• References 48
• Abstract in Korean 65