PCR 을 이용한 cDNA 의 cloning

국문 초록 (Abstract)

Polymerase chain reaction(PCR)은 특이성과 증폭율이 매우 높아 각종 DNA의 증폭에 널리 이용되고 있으나, DNA polymerase의 mismatching error가 무시못할 정도로 크기 때문에 sequence가 알려져 있지 않은 cDNA의 cloning에 적용하는 데에는 어려움이 있다. 그러나 gene expression system이 확립되어 있고 gene product의 특성이 알려져 있다면 DNA의 full sequence를 모르는 cDNA의 cloning에도 PCR이 이용될 수 있다. 본 연구에서는, 사람 면역 방어 기전에 중요한 HLA class I 유전자의 cDNA를 model로 PCR을 이용한 cloning 방법을 확립하였다. HLA class I의 A, B, C locus 중 B-locus gene을 대상으로 하였고, 실험에 사용된 cell line은 B-35/B-51 heterozygote로써 이의 gene products의 isoelectric point(pI)가 알려져 있다. PCR을 이용하여 clone된 gene product의 성상은 expression-deficient mutant cell line에 transfection하여 규명하였다. B-35와 B-51 각각의 cDNA는 poly A RNA를 reverse transcription한 후, 두번의 연속적인 PCR로 amplification하여, E. coli에 transformation하는 과정을 거쳐 얻었다. Transformants 중 각각의 cDNA clone은 B-35 또는 B-51 specific primer pair를 이용한 transformant 세퍼추출액의 PCR로써 screening 하였다. 이 방법은 종래의 plasmid DNA 분리/restriction enzyme digestion 과정을 거치지 않고 bacterial colony의 insert존재유무를 확인할 수 있을 뿐만 아니라, DNA sequencing을 시행하지 않거나 insert gene product에 대한 information이 없이도 clone의 allele type을 결정할 수 있다는 장점이 있다. PCR reaction intrinsic error의 존재유무는, HLA class I이 발현되지 않는 mutant cell line과 B-locus antigen-specific monoclonal antibody를 이용한 expression study로 확인하였다. 사용된 RSV. 5(neo) vector는 eukaryotic expression vector로 개발되었으나, 본 연구에서는 expression 뿐만 아니라 cloning과 sequencing에도 이용하여 single vector system 확립을 목적으로 사용하였다. Clone 중 B-35 type의 expression 여부를 Fluorescence Activated Cell Sorter(FACS)로 선정된, cell clone의 plasma membrane에 B-35 type class I protein이 expression됨을 확인하였다. 또한, 이 expression product는 원래 세포의 product와 동일한 pI를 가지며 B-35에 specific한 monoclonal antibody에 의해 인지되는 것이 확인되었다. 이 clone에 대해 DNA sequence를 조사한 결과, 지금까지 sequence가 알려져 B-35 alleles (B-3501, B-3502) 중 B-3501과 유사하였으나, 오직 한 base pair가 다름을 확인하였다. 이로부터 유추된 cloned gene product의 pI는 isolelectrofocusing data와 일치하였다.