니켈 및 코발트의 세포독성 기전에서 Nitric Oxide의 역할 = Role of Nitic Oxide in the Nickel and Cobalt Induced Cytotoxicity in RAW 264.7 cell

국문 초록 (Abstract)

목적 : 이 연구는 RAW 264.7 cell의 배양조건에 니켈, 코발트 또는 iNOS의 competitive inhibitor인 NMLA를 여러 조건으로 처리하여 NO 생성의 변조유무 및 이와 관련된 ATP 생성과 세포생존율의 변조양상을 관찰하므로써 니켈 및 코발트가 염증반응을 일으키는 세포독성 과정에서의 NO 역할에 대해 알아보고자 실시하였다.
방법 : Balb/c 마우스의 복강내에 Abelson leukemia virus(A-MuLV)를 주입하여 발생시킨 대식세포주 RAW 264.7 세포의 배양조건에 니켈, 코발트 또는 iNOS의 특이억제체인 NMLA를 여러 조건으로 처리하여 NO 생성의 변조유무 및 이와 관련된 ATP 생성과 세포생존율의 변조양상을 관찰하였다. 세포생존율은 trypan-blue dye exclusion 방법을 이용하였으며 NO는 Hibbs 등(1987)의 방법에 따라 그 대사물질인 nitrite(NO2-)의 측정을 통해 간접 측정하였다. 또한, ATP는 세포막을 파괴한 후 luciferase와 ATP의 반응에 따른 발광정도를 luminometer로 측정하였다. 한편, 각 실험조건에서의 세포의 형태학적 변화는 inverted microscope(×400)를 이용하여 관찰하였다.
결과 : 기본배양조건에 cytokines과 여러 농도의 니켈 또는 코발트의 단독 및 동시첨가의 경우 두 금속 모두 50 μM, 48시간을 기점으로 NO 생성량은 첨가농도의 증가에 따라 용량의존적으로 증가하다가 그 이상의 농도 및 시간에서는 현저히 감소하였으며, 동일 조건에서의 세포생존율은 저 농도에서는 대조군과 차이가 없었으나 전반적으로 첨가한 금속의 농도증가에 따라 용량 및 시간 경과에 따라서 감소하는 경향을 보였다.
두 금속 모두 세포생존율 및 NO의 생성율이 높게 유지되는 50 μM, 48시간 배양 조건에서의 결과 또한, 니켈 및 코발트 첨가는 두 금속 모두 cytokines만의 첨가시보다 NO 생성을 더욱 증가시켰으며 ATP 생성정도는 NO 생성 양상과는 반대로 니켈 및 코발트 모두 대조군보다 현저히 감소하였다. 한편 동일 조건에서의 세포생존율은 ATP 감소양상과 비슷하였으며, 이러한 결과들은 두 금속의 동시첨가시 상가(additive)작용으로 나타났다.
한편, 니켈 및 코발트를 단독 또는 동시 첨가한 경우 모두에서 나타났던 NO의 증가와 ATP 감소 및 세포생존율의 감소는 iNOS 억제제인 NMLA를 전처리로 NO 생성은 감소하고 ATP 및 세포생존율은 증가하여 모든 경우에서 대조군 수준으로 완전히 회복되었다.
또한, 이러한 경향은 RAW 264.7 세포를 여러 실험 조건으로 배양한 후 세포상태를 inverted microscope로 관찰한 결과에서도 동일한 결과를 나타내어 니켈 또는 코발트의 첨가로 나타났던 전반적인 세포의 위축과 불규칙한 외형들은 NMLA의 전처리에서는 나타나지 않았다.
결론 : 이상의 결과에서, 니켈 및 코발트는 대식세포의 NO 생성을 증가시키며 이들 금속에 의한 ATP 생성 억제는 그 간 알려졌던 NO의 궁극적인 독성양상인 ATP 생성억제와 동일한 결과로서, 니켈 및 코발트는 대식세포를 활성화시켜 NO 생성을 증가시키고 NO는 ATP 생성을 억제하여 생존율을 감소시키는 것으로 사료된다. 한편, 니켈 및 코발트의 독성효과들은 NMLA를 전처리로 완전하게 억제되고 있어 니켈 및 코발트의 독성은 대부분 NO에 의해 매개됨을 알 수 있었다. 따라서 NO는 니켈 및 코발트의 염증유발 과정에서 중요한 매개역할을 수행하리라 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Objectives : The nickel and cobalt present in many industrial working environments and consumer products. They are two of the leading causes of allergic contact dermatitis, which is a typical delayed(type IV) hypersensitivity reaction. However, the mechanism by which nickel and cobalt causes this pathology is not well known. The nickel and cobalt induced contact dermatitis is mediated primarily through macrophages. This mechanism is similar to the autotoxicity procedure for NO. Therefore, this study was designed to examine whether the metals could modulate NO productihb and how the metals may affect ATP production and cell viability. In summary, the purpose of this study was to elucidate the role of NO in the nickel and cobalt induced cytotoxicity.
Methods : This study is based on observations of cultures of RAW 264.7 cells which are originated from a tumor of Balb/c mouse that was induced by Abelson murine leukemia virus. RAW 264.7 cells were treated with either Ni, Co, Ni plus Co, or N-monomethyl-L- arginine(NMLA) for 24-72 h. The cytotoxicity of the nickel and cobalt was measured by cell viability and NO2-, and mitochondrial function was evaluated by adenosine triphosphate(ATP) production in RAW 264.7 cells. In addition, the morphology of cells was observed using an inverted microsope.
Results : The NO2- synthesis of RAW 264.7 cells increased with increasing concentrations of Ni and Co up to 50 μM after 24 and 48 h of exposure to Ni and Co but then decreased if the concentration was greater than 50 μM and the time period was greater than 48 h. However, the viability of cells was decreased by Ni and Co exposure in a dose and time dependent manner. Therefore, 50 μM Ni or Co and 48 h of treatment were used in this study. A complete inhibition of NO2- synthesis by Ni or/and Co occurred when iNOS inhibitor, NMLA, were pretreated prior to addition of Ni or/and Co, whereas Ni or/and Co induced decrease of synthesis of ATP and viability completely recovered when NMLA were pretreated prior to addition of Ni or/and Co. Ni or/and Co(50 μM) induced the characteristic morphological features of cytotoxicity which is characterized by a shrinkage of cytoplasm and irregular shape of the cells, but the pretreatment of NMLA resulted in a recovered morphological change of the cells to their normal appearance.
Conclusions : These results suggest that NO plays an important role in the pathogenesis of the cytotoxicity of nickel and cobalt, and nickel and cobalt may exert their toxicities by means of modulation of NO prduction. The results from this study may facilitate further understanding the role of NO of nickel and cobalt induced immune and inflammatory processes.

목차 (Table of Contents)

• 서론
• 대상 및 방법
• 1.실험재료
• 2.실험방법
• 3.통계처리
• 결과
• 1.배양시간별 RAW 264.7 세포의 NO 22- 생성능과 세포생존율
• 2.니켈 및 코발트 첨가에 의한 시간 경과별 RAW 264.7 세포의 NO2- 생성능과 세포생존율
• 3.NMLA 전처리에 의한 NO2- 생성의 변화
• 4.NMLA 전처리에 의한 ATP 생성의 변화
• 5.NMLA 전처리에 의한 세포생존율의 변화
• 6.니켈 및 코발트 첨가시 RAW 264.7 세포의 형태학적 관찰
• 7.NMLA 전처리시 RAW 264.7 세포의 형태학적 관찰
• 고찰