Effects of onion peel extracts on antioxidant status- in vitro and human intervention study = 양파껍질 추출물의 항산화 효과-in vitro 및 임상 연구

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 양파껍질 추출물(아세톤, 에탄올, 메탄올)의 1) 자유 라디칼 포집능과 항유전독성 효과, 2) 항산화, 해독관련 유전자 발현 및 대장암 세포 증식에 미치는 영향을 살펴 보고자 시행 되었다. 또한, 건강한 흡연자가 양파껍질 에탄올 추출물 캡슐을 10 주간 섭취하였을 때 3) 항산화, 염증, 그리고 혈행 관련 지표에 있어 어떠한 영향을 미치는 지 알아보고자 하였다. 나아가 이러한 중재 효과가 대상자의 해독 관련 유전자 glutathione S-transferase (GST), 심혈관 질환 관련 유전자 paraoxonase1-192 (PON1-192)의 다형성에 따라 어떻게 다른지 알아보고자 하였다. 한편, 심혈관 질환을 비롯한 산화적 스트레스의 위험성이 적은 건강한 여대생이 동일한 양파껍질 추출물을 2 주간 섭취하였을 경우, 4) 백혈구 DNA 손상도, 지질과산화도, 그리고 항산화 효소 활성에 어떠한 영향을 미치는지 살펴보고자 하였다.
양파껍질 아세톤, 에탄올, 메탄올 추출물의 항산화 및 항유전 독성효과를 시험관 실험을 통해 살펴 본 결과, 메탄올 추출물에서 총 폴리페놀 함량과 ORAC 값이 가장 높았으며 두 변수 사이에서 강력한 양의 상관관계(r = 0.98, p < 0.001)가 확인 되었다. 반면, ABTS.+ 라디칼 포집능은 에탄올 추출물에서, DPPH 라디칼 포집능은 아세톤 추출물에서 가장 높게 나타나 라디칼 종류에 따른 차이를 보였다. 또한, 모든 추출물이 간암 세포 내 산화적 스트레스, 인체 백혈구 세포의 DNA 손상에 대한 보호 효과를 보였으며, 추출 용매에 따른 변화는 나타나지 않았다.
인체 대장암 세포주 HT-29에 대한 양파껍질 추출물의 세포 독성효과를 살펴 보고자 형태학적 관찰을 시행한 결과, 추출물 처리군은 세포 모양이 응축되어 불규칙 적인 형태를 띄거나, 탈락하여 세포 배양액에 떠 있는 모습이 관찰되는 등 대조군과 확연한 차이를 보였다. 또한 MTT 와 LDH 실험에서 모든 추출물은 대장암 세포에 대한 세포증식 억제 및 독성 효과를 나타내었다. 한편, 세포 내독소 물질인 lipopolysaccharide (LPS)를 처리한 HT-29 세포에서 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), heme oxygenase-1 (HO-1), GSTM1, GSTT1, GSTP1 유전자 발현이 유의적으로 증가하였으며, LPS로 스트레스를 유발하기 전 양파껍질 에탄올 추출물을 처리한 세포에서 염증성 사이토카인인 TNF-α 유전자 발현이 유의적하게 감소한 것으로 나타났다. 그리고 양파껍질 추출물의 전처리는 LPS에 의한 항산화 관련 유전자 HO-1, GSTM1, GSTT1, 그리고 GSTP1 유전자 발현의 up-regulation을 덜 유도하는 것으로 확인되어 양파껍질 에탄올 추출물이 LPS로 유도한 스트레스에 대한 보호 효과를 가지는 것으로 확인되었다.
세포 및 시험관 실험을 통해 살펴본 양파껍질 추출물의 생리활성 효과를 임상연구를 통해 검증하고자 건강한 흡연 남성 44명에게 양파껍질 에탄올 추출물가루(100 mg 퀘세틴+ 128 mg 플라보노이드/day) 또는 위약 (덱스트린) 캡슐을 10 주간 보충하였다. 중재 기간이 끝난 후, 양파껍질 섭취군에서 항산화 효소 catalase (CAT)와 혈장 총 항산화능(total radical trapping antioxidant parameter, TRAP)이 유의적으로 증가하였으며 이러한 경향은 GSTT1과 GSTTM1의 유전자형이 모두 null, 혹은 어느 한 유전자만 null인 대상자에서 더 강력하게 나타는 것으로 확인되었다. 또한 증가한 적혈구 항산화 효소 superoxide dismutase (SOD)의 활성은 위약그룹에서만 유의성을 나타난 반면 GSH-Px 와 지질과산화도(conjugated diene), 항산과 관련 유전자 발현(Cu/Zn-SOD, Mn-SOD, CAT)은 두 그룹 모두에서 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. 뇨중 DNA 손상지표인 8-hydroxy-deoxyguanosine은 두 그룹 모두에서 어떠한 변화도 나타나지 않았으며 백혈구 DNA 손상도는 양파껍질 섭취 그룹(60.5%)뿐 아니라 위약 그룹(37.5%)에서도 유의적으로 감소하여 시험관 실험에서의 항유전독성 효과가 본 임상 연구 디자인에서는 뚜렷히 검증되지 않았다. 따라서 다양한 실험 디자인 (양파껍질 추출물의 양, 공급기간, 대상자)을 토대로한 추후 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다. 한편, 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 동맥경화지수가 양파껍질 섭취 그룹에서 유의적으로 감소하고, 혈액 응고 지표인 prothrombin time(PT)와 activated partial thromboplastin time(aPTT)가 개선된 것으로 나타나 양파껍질의 보충이 심혈관계 질환의 예방에 기여할 수 있을 것으로 사료되었다. 반면 혈전(plasminogen activator inhibitor-1, thrombomodulin) 및 염증(interleukin-8, interferon-γ, cyclooxygenase) 관련 유전자 발현에 있어서는 양파껍질 섭취 후 유의적인 변화가 나타나지 않았다. 또한 증가한 HDL-콜레스테롤, 감소한 동맥경화지수는 PON1-192 QR/RR 유전자형을 가진 대상자에서 강력한 것으로 나타났으며, 그 외 혈전 관련 지표 (PT, international normalized ratio)에 있어서도 유전자형에 따라 양파껍질 추출물의 효능이 다르게 나타났다.
양파껍질 추출물의 생리활성 효과를 건강한 여대생에서 확인하기 위해 14명의 여대생에게 동일한 양파껍질 캡슐을 2 주, 위약 캡슐을 2주간 보충하였다. 2주간의 양파껍질 섭취 후, 총콜레스테롤, 동맥경화지수, 수축기 혈압이 유의적으로 감소한 것으로 나타났다. 항산화 시스템의 변화에 있어서는 SOD 효소 활성이 양파껍질 섭취 후 유의적으로 증가하였으며 그 외 다른 항산화 효소(CAT, GSH-Px)와 지질과산화 지표(CD), DNA 손상도(comet) 에 있어서는 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
이상의 연구에서 양파껍질 추출물의 혈중지질농도 및 혈압강하 효과를 확인함으로써, 폐기되는 양파껍질의 활용가능성이 입증되었다. 따라서 건강인은 물론 뇌졸중을 비롯한 심혈관계 질환의 위험성이 높은 흡연자에게 관련 질환을 예방하기 위한 유용한 식이지침 자료가 될 것으로 사료되며, 나아가 양파껍질의 건강기능성 식품소재로써의 가치를 제안하는 바이다. 그러나 항산화 및 항혈전 활성은 본 임상연구 대상자에서 부분적으로 나타났고, in vitro 연구에서 확인된 항염증 효과는 임상연구에서는 뚜렷히 나타나지 않아, 다양한 연구 디자인을 토대로한 추후 연구가 더 이루어져야 할 것으로 사료된다. 또한 이러한 양파껍질 추출물의 효과에 대한 민감도가 대상자의 유전자형에 따라 다르게 나타났으므로 건강기능성 식품 및 제품 개발연구 시 유전적 다형성에 대한 자료가 뒷받침되어야 할 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• LIST OF TABLES = vi
• CHAPTER ⅠPreface and background
• 1.1. Preface = 2
• 1.2. Background = 4
• 1.2.1. Oxidative stress, antioxidant defense system and its biomarkers = 4
• 1.2.1.1. Oxidative stress and its biomarkers = 4
• 1.2.1.2. Antioxidant defense system and its biomarkers = 6
• 1.2.2. Oxidative stress and its resultant cardiovascular events = 9
• 1.2.2.1. Oxidative stress and cardiovascular disease = 9
• 1.2.2.2. Cardiovascular disease risk factors = 10
• 1.2.3. Onion peel and its bioactivity = 12
• 1.2.3.1. Onion peel and its flavonoid = 12
• 1.2.3.2. Antioxidant effect of onion peels = 13
• 1.2.3.3. Beneficial effect of quercetin or onion peel on cardiovascular disease = 14
• 1.3. References = 15
• CHAPTER Ⅱ Antioxidative and antigenotoxic effects of onion peel extracts in non-cellular and cellular systems Abstract = 25
• 2.1. Introduction = 26
• 2.2. Materials and methods = 27
• 2.2.1. Materials = 27
• 2.2.2. Preparation of onion peel extracts = 27
• 2.2.3. Measurement of bioactive compounds = 28
• 2.2.4. Measurement of antioxidant capacity = 29
• 2.2.5. Measurement of antigenotoxic capacity = 31
• 2.2.6. Statistical analysis = 32
• 2.3. Results and discussion = 32
• 2.3.1. Bioactive compounds in onion peel extracts = 32
• 2.3.2. Antioxidative capacity = 35
• 2.3.3. Antigenotoxic capacity = 41
• 2.4. References = 45
• CHAPTER Ⅲ Effects of onion peel extracts on cell proliferation and lipopolysaccharide-induced inflammatory stress in human colon carcinoma cells Abstract = 50
• 3.1. Introduction = 51
• 3.2. Materials and methods = 52
• 3.2.1. Materials = 52
• 3.2.2. Preparation of extracts from onion peel = 53
• 3.2.3. MTT reduction assay = 53
• 3.2.4. Observation of morphological changes = 54
• 3.2.5. Lactate dehydrogenase release assay = 54
• 3.2.6. Real-time quantitative PCR = 54
• 3.2.7. Statistical analysis = 55
• 3.3. Results = 56
• 3.3.1. Cytotoxic activity = 56
• 3.3.2. Modulation of antioxidant and inflammatory gene expressions = 61
• 3.4. Discussion = 65
• 3.5. References = 68
• CHAPTER Ⅳ Effect of onion peel extract supplementation on antioxidant, inflammation and blood coagulation parameters in Korean male smokers: Impact of GST and PON1-192 genetic polymorphisms Abstract = 73
• 4.1. Introduction = 74
• 4.2. Materials and methods = 77
• 4.2.1. Subjects and study design = 77
• 4.2.2. Inflammation, blood coagulation, and biochemical parameters = 79
• 4.2.3. Measurement of antioxidant and DNA damage parameters = 79
• 4.2.4. Real-time quantitative PCR assay = 82
• 4.2.5. Determination of PON1-192, GSTM1 and GSTT1 Genotypes = 83
• 4.2.6. Statistical analysis = 84
• 4.3. Results = 85
• 4.3.1. Subject characteristics = 85
• 4.3.2. Inflammation and blood coagulation parameters = 87
• 4.3.2.1. Blood pressure and serum lipid profiles = 87
• 4.3.2.2. Blood circulation index and its gene expression = 90
• 4.3.2.3. Impact of PON1-192 genotype = 92
• 4.3.3. antioxidant and DNA damage parameters = 94
• 4.3.3.1. Antioxidant enzyme activity and gene expression = 94
• 4.3.3.2. Impact of GST polymorphisms = 96
• 4.3.3.3. Concentrations of serum antioxidant vitamins = 97
• 4.3.3.4. DNA damage = 99
• 4.4. Discussion = 101
• 4.4.1. Effect of onion peel extract supplementation on lipid profiles = 101
• 4.4.2. Effect of onion peel extract supplementation on blood circulation = 102
• 4.4.3. Effect of onion peel extract supplementation on antioxidant status = 105
• 4.5. References = 110
• CHAPTER Ⅴ Effect of onion peel extract supplementation on the lipid profile and antioxidative status of healthy young women: A randomized, placebo-controlled, double-blind, crossover trial Abstract = 120
• 5.1. Introduction = 121
• 5.2. Materials and methods = 122
• 5.2.1. Subjects and study design = 122
• 5.2.2. Anthropometric and biochemical parameters = 123
• 5.2.3. Antioxidant and lipid peroxidation parameters = 124
• 5.2.4. Statistical analysis = 126
• 5.3. Results = 126
• 5.3.1. Anthropometric parameters and other index in serum = 126
• 5.3.2. Lipid peroxidation and antioxidant status = 130
• 5.4. Discussion = 135
• 5.5. References = 138
• Korean abstract = 141