대식세포에서 인지질분해효소A2-PPARγ 신호전달을 통한 15-Deoxy-Δ12,14-Prostaglandin J2 의 항염증효과 = Anti-inflammatory Effect of 15-Deoxy-Δ12,14-Prostaglandin J2 through Phospholipase A2-PPARγ Signaling in RAW 264.7 Cells

국문 초록 (Abstract)

15d-PGJ2는 프로스타글란딘의 한 종류이지만 특이하게도 항염증 효과를 갖는다고 알려져 왔다. 15d-PGJ2는 NF-κB 신호 전달체계를 조절하는데 이 것이 항염증 메커니즘의 한 가지로 알려져 있다. 또한 15d-PGJ2는 PPARγ 리간드로 알려져 있다.
본 연구에서는 15d-PGJ2가 AA대사과정에 중요한 효소인 PLA2와 COX에 미치는 영향과 PPARγ 단백질 발현에 어떠한 변화를 가져오는지 알아보고자 하였다. 이를 통해 대식세포에서의 새로운 15d-PGJ2의 항염증 메커니즘을 제시하고 AA 신호전달과 PPARγ사이의 연관성도 규명하고자 하였다.
이 논문에서 멜리틴은 잠재적인 염증 물질로 PLA2, COX-2의 활성을 증가시키는 물질로 사용되었으며, 멜리틴이 PPARγ발현에 어떠한 영향을 주는지 살펴보았다. 실험 결과 15d-PGJ2는 멜리틴에 의해 활성이 증가된 PLA2를 억제하였으며 두 가지 동위 효소 중에 cPLA2만을 강하게 억제하였다. 그리고 15d-PGJ2는 멜리틴이나 LPS에 의해 유도된COX의 활성을 유의성 있게 감소시켰다. 멜리틴은 PPARγ의 발현을 약간 감소시켰으며 15d-PGJ2는 이를 원래 상태의 이상으로 발현을 회복시켰다. 불포화지방산 중에 유일하게 AA만이 PPARγ의 발현을 억제시켰다. 이 결과들을 통해 15d-PGJ2가 PLA2, COX를 억제함으로써 그리고 감소된PPARγ의 발현을 증가 시킴으로써 항염증 효과를 가질 것이라 유추해볼 수 있다. 또한 AA 대사 과정이 PPARγ 신호전달에 관여해있다는 사실을 알 수 있다.
염증 반응이 과도하게 일어나는 경우에는 류마티스성 관절염, 신우염 등 다양한 질병을 유발한다. 15d-PGJ2의 병태생리학적 기전을 밝힘으로써 다양한 염증 기반의 질병 치료에 도움이 될 것으로 본다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

15d-PGJ2 is a sort of prostaglandins which anticipated to plays the anti-inflammatory responses. It has been revealed that 15d-PGJ2 has anti-inflammatory effects by controlling NF-κB signaling. In addition, 15d-PGJ2 is known as a PPARγ ligand.
In this study, we investigated the effect of 15d-PGJ2 on PLA2 and COX enzyme which involve in AA metabolism and alteration of PPARγ protein expression levels. Through this, we proposed the new mechanism of anti-inflammatory effects by 15d-PGJ2 and linkage between AA metabolism and PPARγ.
Melittin was used as a PLA2, COX-2 stimulator well as tentative inflammatory mediators and effect of melittin on PPARγ expression was observed. 15d-PGJ2 inhibited melittin induced PLA2 activity, especially in cPLA2 but not sPLA2. 15d-PGJ2 significantly decreased COX activity induced by melittin and LPS. Melittin slightly down-regulated PPARγ expression level and 15d-PGJ2 restored it. Through this, we formulated the hypothesis that 15d-PGJ2 might affect to PPARγ via AA signaling. In fact only AA blocked PPARγ expression among unsaturated fatty acids. From these results, 15d-PGJ2 might have anti-inflammatory effect and increase PPARγ expression by inhibiting PLA2 and COX. It is inferred that AA metabolism is involved in PPARγ signaling.
Excessive inflammatory responses could induce rheumatoid arthritis, pyelitis and multiple diseases. To clarify pathophysiological mechanism of 15d-PGJ2 could be of help to treat the inflammatory based diseases.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 5
• 2.1 Materials 5
• 2.2 Cell culture 6
• 2.3 Measurement of cell viability 6
• 2.4 Measurement of [3H]arachidonic acid release 7
• 2.5 Preparation of the RAW 264.7 cell derived phospholipase A2 7
• 2.6 PLA2 activity assay using [14C]AA-PC 8
• 2.7 sPLA2 activity assay using 10-Pyrene-PC 9
• 2.8 Measurement of intracellular calcium mobilization 9
• 2.9 COX activity assay 10
• 2.10 Immunoblot analysis 11
• 2.11 Statistical analysis 13
• 3. Results 14
• 3.1 Cytotoxicity of 15d-PGJ2 or melittin 14
• 3.2 15d-PGJ2 inhibited [3H]AA release induced by melittin 16
• 3.3 15d-PGJ2 significantly suppressed the activities of cPLA2, but not sPLA2 18
• 3.4 Intracellular Ca2+ mobilization was not involved in 15d-PGJ2 operation to PLA2 21
• 3.5 15d-PGJ2 had the inhibitory effect on total COX activities 23
• 3.6 Melittin slightly decreased PPARγ expression and 15d-PGJ2 restored more than original state 25
• 3.7 PPARγ signaling did not affect to the inhibition of [3 H]AA release by 15d-PGJ2 27
• 3.8 The potential involvement of AA signaling in PPARγ expression in macrophage 29
• 4. Discussion 32
• 5. Conclusion 36
• 6. References 37
• 국문초록 43
• Abstract 45