TRPC4 deletion elicits behavioral defects in sociability by dysregulating expression of miR-138-2

서지영 한양대학교 의생명공학전문대학원 2022 국내박사

The molecular changes in autism spectrum disorders (ASD), are not well understood. To investigate whether the absence of transient receptor potential canonical 4 (TRPC4), which is strongly expressed in the hippocampus, affects ASD, social behavior was examined in mice of which Trpc4 is deleted (Trpc4−/−). The Trpc4−/− mice had enhanced levels of repetitive grooming, and lowered sociability and preference for social novelty at 8 weeks of age, indicative of an autism-like phenotype. In microarray analysis of the hippocampus, microRNA (miR)-138-2, the precursor of miR-138, was upregulated in the Trpc4−/− mice. Absence or blockade of Trpc4 triggered Matrin3 binding to miR-138-2, thereby repressing miR-138 and raising levels of established miR-138 targets, suggesting that Trpc4 regulates signaling components opposing the development of ASD through miR-138. The autistic-like behaviors in Trpc4−/− adults were reversed by overexpressing hippocampal miR-138-2. In conclusion, TRPC4 may contribute to maintaining sociability through the processing of miR-138-2 for proper levels of miR-138.

Signaling role of adipocyte leptin in prostate cell proliferation induced by Trichomonas vaginalis

김정현 한양대학교 의생명공학전문대학원 2019 국내박사

Trichomonas vaginalis (TV), a common sexually transmitted disease, is a protozoan parasite. The majority of infections are asymptomatic in men and remain undiagnosed and untreated, which has been hypothesized to result in persistent prostatic infection. TV has been observed in the prostate tissue of prostate cancer, and in the urine of patients with prostatitis as well as in the prostate tissue of benign prostatic hyperplasia (BPH). Obesity induces chronic low-grade inflammation and increases the risk of BPH. Adipocytes influence not only on the endocrine system but also on the immune response through several cytokine-like mediators known as adipokines including leptin. Leptin is a kind of adipokines that was originally identified as a key molecule in the regulation of food intake and body weight. Abdominal obesity and high serum leptin level are known to associate with prostate growth and reported as high-risk factors for clinical BPH. However, it is not known that leptin could induce proliferation of prostate cells. In this study, we investigated whether adipocyte reacted with the culture supernatant of BPH epithelial cells infected with TV may induce the proliferation of prostate cells via leptin signaling pathway. To investigate the effect of crosstalk between adipocyte leptin and inflamed epithelial cell in proliferation of prostate cells, adipocytes (3T3-L1) were incubated in conditioned medium of BPH epithelial cells infected with TV (TCM) and then the adipocyte-conditioned medium (ATCM) was identified to cause proliferation of prostate cells. To measure the proliferation of prostate stromal and BPH epithelial cells, the BrdU assay and wound healing assay were used. ELISAs, RT-PCR, Q-PCR, western blotting and immunofluorescence assay were used to measure the production and expression of leptin signaling molecules. BPH epithelial cells incubated with live TV released pro-inflammatory cytokines such as IL-6, CXCL8, CCL2 and IL-1β, and induced the migration of pre-adipocytes. When the TCM was added to mature adipocytes, they produced adipokines such as CXCL1, IL-6, CCL2 and leptin. Prostate stromal cell and BPH epithelial cell incubated with the ATCM or recombinant leptin showed increased proliferation and expression of leptin receptor (OB-R). Also, leptin signaling molecules including p-JAK2, p-STAT3, Notch1, NICD, Jagged1, survivin showed increased expression in the prostate cells incubated with ATCM or recombinant leptin. However, blocking of the leptin receptor reduced the proliferation and the expression of leptin signaling molecules in the prostate cells. Therefore, leptin from adipocytes may be involved in proliferation of prostate cells. In summary, the inflammatory mediators released by BPH epithelial cells in response to infection with TV induced the migration and activation of adipocytes. The activated adipocytes induce the proliferation of prostate cells via leptin signal pathway. Our findings showed that BPH epithelial cells infected by live TV induce the proliferation of prostate cells through the leptin signaling. Therefore, it is proposed that adipocyte leptin may contribute to the enlargement of BPH caused by TV infection. 질편모충(Trichomonas vaginalis, TV)은 성병(non-viral sexually transmitted disease)을 일으키는 가장 흔한 원충으로 남성에서는 거의 무증상으로 진단 및 치료가 되지 않아 만성감염을 일으킬 수 있다. 질편모충은 양성전립선비대, 전 립선암 환자의 전립선 조직과 전립선염 환자의 소변에서 발견되었다. 비만과 같은 대사장애는 지방조직에 chronic low-grade inflammation을 유발하며, 지방 세포에서 분비되는 아디포카인은 내분비계 뿐만아니라 면역반응에도 영향을 미친다고 보고되었다. 또한 비만에 의한 염증상태는 종양을 유발하는 인자로서 전립선암 등 여러 종류의 암과 관련되어 연구되고 있다. 그러나 비만과 전립선비대증의 상관관계를 본 실험적 연구는 드물다. 렙틴(leptin)은 아디포카인의 일종으로 식품섭취와 체중조절의 핵심물질로 혈청렙틴수준은 전립선의 증식과 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 전립선비대증의 고 위험인자로 보고되었다. 그러나 렙틴이 양성전립선비대증의 발달에 관여할 수 있는지에 대한 실험적 연구는 없다. 이 연구에서는 질편모충에 감염된 전립선 세포의 증식에 있어서 지방세포에서 분비된 렙틴의 역할을 알아보고자, 질편모충에 의한 전립선비대상피세포의 염증반응이 지방세포에서 렙틴의 분비를 증가시키는지 알아보고 렙틴이 전립선세포(전립선기질세포, 전립선비대상피세포)의 증식을 유도하는지 알아보았다. 양성전립선비대상피세포주(BPH-1), 전립선기질세포주(WPMY-1) 및 지방전구 세포주(3T3-L1)를 사용하였으며, 질편모충은 T016 분리주를 사용하였다. 전립선상피세포주에 질편모충을 반응시킨 TV-conditioned medium(TCM)에는 IL-6, CXCL8, CCL2, IL-1β가 포함되어 있으며, TCM은 지방전구세포의 이동(chemotaxis)을 증가시켰다. 성숙한 지방세포를 TCM과 반응시켰을 때 adipokine인 CXCL1, IL-6, CCL2와 렙틴의 생산이 증가하였다. 지방세포에 TCM을 넣어 만든 adipocyte-TCM(ATCM)을 전립선기질세포주(WPMY-1) 및 전립선비대상피세포주(BPH-1)와 반응시켰을 때 두 세포주 모두에서 증식이 유의하게 증가하였고, 렙틴수용체(OBR)의 발현이 증가하였다. 또한 ATCM에 의해 유도된 증식에서 렙틴신호분자들의 발현을 확인하였을 때 JAK2/STAT3, Notch1, Jagged1, survivin의 발현이 유의하게 증가되었다. ATCM으로 유도된 증식이 렙틴에 의한 것인지 확인하기 위해 ATCM 처리 시 렙틴수용체에 대한 항체를 함께 추가하였을 때 전립선세포주들의 증식은 감소하고 렙틴신호분자 들의 발현도 함께 줄어들었다. 따라서 지방세포에서 분비된 렙틴은 전립선세포의 증식에 관여할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 요약하자면 질편모충에 감염된 전립선비대상피세포에서 분비된 염증물질은 지방세포의 이동 및 활성화를 일으켜서 아디포카인을 생산하는데, 렙틴은 전립선기질세포와 전립선비대상피세포의 렙틴수용체와 결합하여 렙틴신호분자들의 발현을 통하여 전립선세포의 증식을 유도하였다. 이 연구결과는 질편모충감염에 의한 전립선세포의 염증반응은 지방세포의 렙틴 생산을 증가시켜 전립선세포의 증식을 일으킬 수 있음을 제시한다.

Sgk1 inhibition potentiates neurotrophic functions of glia via regulating inflammation, cell senescence, and glutamate uptake

권오찬 한양대학교 의생명공학전문대학원 2019 국내석사

Glial cells such as astrocytes and microglia contribute to the maintenance of the health and function of the central nervous system (CNS). They cooperate with neurons at several levels, including ion and water homeostasis, chemical signal transmission, blood flow regulation, immune and oxidative stress defense, supply of metabolites and neurogenesis. However, the neurotrophic functions of glial cells are altered into rather neurotoxic ones in various disease status by secreting pro-inflammatory cytokines. Thus the idea of polarizing pathologic glia into neurotrophic ones has been appearing on the therapeutic horizon for CNS disorders. In our previous study, the transcription factors Nurr1 and Foxa2 exerted synergistic roles to prevent neuro-inflammatory transition of the glia. In this study, to identify a therapeutic target downstream to Nurr1+Foxa2-mediated anti-inflammatory functions, genome-wide transcriptome analysis was carried out in Nurr1+Foxa2-expressing glia. I identified Sgk1(Serum-and-glucocorticoid-inducible kinase-1) as one of the important genes down-regulated by the combined Nurr1+Foxa2. I showed that Sgk1 inhibition exerted neuroprotective roles by potentiating anti-inflammatory functions of glial cells through multiple mechanistic manners such as down-regulation of NF-kb signaling, inflammasome, cGAS-STING pathway mediated inflammatory signaling. In addition, cell senescence in cultured glia, which has been shown as a critical pathogenic mechanism for Parkinson’s disease(PD) and Alzheimer’s disease(AD), was markedly prevented by Sgk1 inhibition, along with reduction of gene expressions associated with cell senescence. The reduction of glia cell senescence accompanied with a decrease of reactive oxygen species (ROS) production and reduced mitochondrial stress, which are directly linked to cause cell senescence. Finally, glutamate clearance was also potentiated in Sgk1 inhibitor-treated glial cell cultures. Given the anti-inflammatory/neurotropic actions, glial treated with sh-Sgk1 exerted the more potent neuro-supportive effects than those of sh-control treated glia in neuron-glia co-culture experiments. These finding together strongly indicate Sgk1 inhibition in glia could be a therapeutic tool to treat neurodegenerative disorder.

Signaling mechanism for inducing PP2A nitration and morphological change during decidualization of human endometrial stromal cells

이소영 한양대학교 의생명공학전문대학원 2020 국내박사

Decidualization of endometrial stroma is an essential differentiation process for embryo implantation and maintaining pregnancy. We previously reported that protein phosphatase 2A (PP2A) acts as a key mediator during cAMP-induced decidualization of human endometrial stromal cells (hESCs). However, its activation mechanism has been remained veiled in this model. In present study, we aimed to reveal the mechanism which induces the nitration of PP2A catalytic subunit (PP2Ac) during cAMP-induced decidualization of hESCs. First, cAMP-induced PP2Ac nitration and nitric oxide (NO) synthesis was significantly repressed by L-NAME, an inhibitor of nitric oxide synthase (NOS). Among several NOS isoforms, only inducible NOS (iNOS) was highly expressed in this model, indicating iNOS directly regulates the nitration of PP2Ac. Second, cAMP-induced iNOS expression and PP2Ac nitration were decreased by treatment of TSA, an inhibitor of histone deacetylase 5 (HDAC5). And cAMP-induced phosphorylation of CaMKⅡ and HDAC5 were suppressed by treatment of U73122 (an inhibitor of phospholipase C) or transfection of PLCε siRNA. Finally, small G protein Rap1 and its guanine nucleotide exchange factor Epac1 were involved in cAMP-induced PP2A activation. Taken together, our results suggest that PP2Ac nitration during cAMP-induced decidualization of hESCs is induced through the Epac1-Rap1-PLCε-CaMKⅡ-HDAC5-iNOS signaling pathway. By providing the landing area for the implantation of embryo, decidualization of endometrial stroma makes profitable pregnancy environment of uterus through morphological change of hESCs. So, cellular morphology has been observed as the main parameter of decidualization. However, the detailed mechanisms of morphological alteration have not been enough understood yet. We previously reported that a metabolite of phospholipase D1 (PLD1), phosphatidic acid (PA) induces decidualization of hESCs, but we did not determine morphology-related functions of decidualization marker genes. In present study, we aim to elucidate the mechanism how to occur PA-induced cytoskeletal rearrangement during decidualization of hESCs by staining with F-actin. First, we confirmed that decidualization marker genes, IGFBP1 and prolactin, does not related with cytoskeletal rearrangement during PA-induced decidualization. Transfection of dominant-negative Src (DN-Src) prevents PA-mediated cytoskeletal rearrangement. Likewise, the morphological changes were suppressed by treatment of PF-573228 (an inhibitor of FAK phosphorylation). Moreover, RhoA-ROCK pathway, as the downstream effectors of FAK, regulated PA-induced cytoskeletal rearrangement during decidualization of hESCs. Taken together, we provide that a novel signaling mechanism for the cytoskeletal rearrangement through PLD1-PA-Src-FAK-RhoA-ROCK during decidualization of hESCs, and we suggest that morphological alteration of hESCs is not directly related with expression of marker genes.

항체 매개 자가면역질환모델에서 spleen tyrosine kinase의 역할

조소미 한양대학교 의생명공학전문대학원 2022 국내석사

Spleen tyrosine kinase (Syk) plays a pivotal role in the activation of B cells and myeloid-lineage cells by transducing BCR- and FcR-triggered signals to diverse downstream pathways. Dysregulated activity of Syk can cause the development of antibody-mediated autoimmune diseases, such as rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. Therefore, Syk is regarded as a druggable target for therapeutic intervention in such diseases, but it remains to be fully evaluated. This study was undertaken to examine the efficacy of a novel Syk inhibitor SKI-O-703 in two models of such diseases. First, to examine the effect of SKI-O-703 on the progression of lupus nephritis, NZB/W F1 female mice at the autoimmunity-established phase were orally administrated with SKI-O-703. The levels of serum anti-dsDNA antibody, serum BAFF, and proteinuria and histopathologic manifestations of glomerulonephritis were significantly decreased in SKI-O-703-treated mice, and these effects were associated with hypoactivation of B cells, especially germinal center B cells, in the spleen. Second, BALB/c mice were injected with K/BxN serum to induce arthritis and orally administered with SKI-O-703. Upon treatment with SKI-O-703, clinical and histopathological scores were significantly decreased, with less numerous neutrophils and macrophages infiltrated into the synovial tissue. SKI-O-703 at a lower dose had a synergistic effect with anti-TNF antibody. Thus, these results provide evidence that a novel Syk inhibitor SKI-O-703 can attenuate the progression of autoantibody-mediated autoimmune diseases by inhibiting activation of B and innate inflammatory cells. Spleen tyrosine kinase (Syk)는 B 세포 수용체 또는 Fcγ 수용체를 포함한 세포 표면 수용체의 하위에서 세포의 생존, 분화, 기능에 필수적인 역할을 한다. Syk의 과도한 활성화는 자가면역 상태를 일으킬 수 있고, 실제로 류마티스 관절염과 전신홍반루푸스와 같은 대표적인 자가면역질환 환자에서 Syk의 과발현이 보고되었다. 이 두 질환에서 자가항체가 과다생성되고, 관절 또는 콩팥 조직에 침윤되어 염증반응을 일으키는데, 이런 과정에 Syk이 관여하는지, Syk 억제제로 조절이 가능할지에 대한 연구가 미흡하였다. 이 연구에서는 두가지 자가면역질환모델에서 새로운 Syk 저해제인 SKI-O-703의 질환 제어 효능과 약리 기전을 조사하였다. 첫째로, 전신홍반루푸스 모델인 NZB/W 생쥐에서 SKI-O-703이 질병 진행을 억제시킬 수 있는지 조사하였다. 그 결과 약물 투여군에서 혈청내 항-DNA IgG 자가항체 역가가 감소하였으며, 비장종대가 감소하였고, B세포와 종자중심 반응에 관여하는 세포 수가 감소하였다. 또한 단백뇨 증상이 완화되고, 사구체신염의 조직병리학적 점수가 감소하였다. 둘째로, K/BxN 생쥐의 혈청을 정상 마우스에 주사하여 관절염을 유도한 생쥐에서 SKI-O-703이 질병 진행을 억제시킬 수 있는지 조사하였다. 대조군과 비교하여 고용량의 약물 투여 시 관절염 지수, 관절의 두께, 조직병리학적 지수가 현저히 감소하였다. 활막 내 호중구와 대식세포 침투가 감소하고, 림프절의 종자중심 B 세포수가 감소하였다. 또한 저용량의 SKI-O-703과 항 TNF 항체의 병용 투여로 시너지효과를 보였다. 그러므로, SKI-O-703으로 Syk을 통한 신호를 차단하면 B 세포의 항체분비세포로의 분화를 억제하고, 병소조직에 항체 침윤에 따른 선천염증 세포의 활성화를 억제 할 수 있다. 이를 통해 항체 매개 자가면역질환에서 새로운 Syk 억제제인 SKI-O-703의 질환 제어 효능을 입증하였다.

Bacteroides fragilis 장독소로 자극한 장상피세포에서의 matrix metallopeptidase 9 발현

노다정 한양대학교 의생명공학전문대학원 2017 국내석사

Bateroides fragilis는 장내 미생물무리로 알려져 있다. 이 중 장독소(B. fragilis enterotoxin, BFT)를 생산하는 enterotoxigenic B. fragilis는 장염과 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD)을 유발한다. IBD는 환경적 요인과 유전적 요인에 의해 발병된다고 알려져 있다. 장내 미생물무리의 조성변화에 의한 발병은 대표적인 환경적 요인에 포함되는데, 이로 인해 염증반응이 일어난 조직과 면역세포에서는 extracellular matrix (ECM) remodeling 효소가 생성된다. 이중에서 gelatinase가 IBD에 영향을 끼치는 대표적인 효소로 떠오르고 있다. 이 효소는 다양한 자극을 통해 장내 염증 조직에서 발현된다. 특히, IBD 환자의 염증 조직에서 matrix metallopeptidase 9 (MMP-9)이 많이 발현된다는 보고가 있다. MMP-9은 ECM의 구성요소 중 하나인 tight junction protein 1을 분해하여 장내에 존재하는 균이 점막 내로 쉽게 침투하도록 하여 tissue injury를 악화시킨다. 그러므로 BFT로 유도되는 장내 염증반응에서도 MMP-9의 역할과 이와 관련된 조절기전은 중요할 것으로 예상된다. 이번 연구는 BFT로 자극한 장상피세포에서의 MMP-9 발현경로와 신호전달을 규명하는 것을 목표로 하였다. 실험모델로 HCA7 장상피세포를 사용하였으며, MMP-9의 발현은 PCR을 이용하여 확인하였다. 그 결과 BFT자극 3시간부터 MMP-9 mRNA 발현증가가 관찰되었으며 16~ 24시간에서 최대치(대조군에 비해서 19배 증가)를 보였고 그 이후로 감소함을 확인하였다. 또한 NF-κB와 AP-1 전사인자의 활성과 MMP-9 발현의 상관관계를 규명하기 위해 dominant negative (dn)-IκBα DNA와 dn-TAM67 DNA를 도입한 lentiviral particle을 transduction 시켜 각 전사인자의 활성을 억제한 HCA7 세포를 제작하였다. 각각의 세포에 BFT를 자극하여 MMP-9의 발현을 관찰한 결과 MMP-9의 발현이 AP-1을 억제한 세포에서 감소하였다. 한편 BFT 처리된 HCA7 세포에서 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)의 활성도 관찰하였다. MAPKs의 경우 HCA7 세포에서 BFT 자극에 의해 ERK, p38, JNK MAPK 모두 활성화되는 것을 확인하였으며, dn-ERK2 DNA, dn-p38 DNA, dn-JNK DNA가 전달된 세포에서 MMP-9의 발현을 관찰한 결과 JNK가 MMP-9 유도와 관련됨을 확인하였다. 따라서 AP-1과 JNK의 활성이 MMP-9의 발현과 관계가 있음을 확인하였다. 이 연구를 통해 BFT로 HCA7 장상피세포를 자극하였을 때 MMP-9의 발현이 유도될 수 있으며, 이와 관련된 유도기전에 전사인자 AP-1의 활성화와 JNK MAPK의 활성화가 포함된다는 것을 규명하였다. Background and Purpose Enterotoxigenic bacteroides fragilis (ETBF) produces an approximately 20kDa heat-labile enterotoxin (BFT) that cause inflammation such as colitis and inflammatory bowel disease (IBD). IBD is known to be caused by genetic factors and environmental factors containing pathogenesis by change of microbial composition. The process of inflammation is occurred in inflammatory tissues and immune cells that produce extracellular matrix (ECM) remodeling enzyme. One of ECM enzymes, gelatinase B (also known as matrix metallopeptidase 9, MMP-9) play an important role in pathogenesis of IBD. This study has the investigation of the mechanisms of MMP-9 expression and the related signaling in BFT-stimulated human intestinal epithelial cells. Methods HCA7 cells were cultured in presence or absence of BFT. MMP-9 expression was analyzed by reverse transcription-PCR. Activities of transcription factors such as nuclear factor-kappaB (NF-κB) and activator protein-1 (AP-1) were assessed by immunoblot after blocking IκBα and c-Jun and phosphorylation of signal molecules was measured by Immunoblot. Results Stimulation of HCA7 cells with BFT increased MMP-9 expression from 3 h and peaked 16~24 h. BFT activated NF-κB and AP-1 signals in HCA7 cells. Suppression of NF-κB using lentiviruses containing dominant-negative (dn) DNA did not affect the increased MMP-9 mRNA expression in BFT-stimulated HCA7 cells, but suppression of AP-1 significantly decreased BFT-induced MMP-9 expression. Activated signals of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) increased BFT-stimulated HCA7 cells. Infection with lentivirus containing dn-JNK significantly decreased MMP-9 expression compared with lentiviruses containing control DNA in BFT-stimulated cells. However, lentiviruses containing dn-ERK2 and dn-p38 did not inhibit the MMP-9 mRNA expression in HCA7 cells stimulated with BFT. Conclusion These results suggest that BFT induces MMP-9 in BFT-stimulated intestinal epithelial cells through JNK and AP-1 signaling.

Construction of Korean genetic variants database and a variome analysis pipeline for population WES/WGS data

박영찬 한양대학교 의생명공학전문대학원 2016 국내석사

A map of human genome, a piece of work from Human Genome Project (HGP) which took about 10 years, leaves us important scientific information and questions simultaneously. One question arises that how the genome map should be applied on treating disease or developing cures practically. After many years from the end of Human Genome Project, the next generation sequencing technology, which enables one whole human genome re-sequencing in a very short time and at low costs, may answer the question. Now, the full map of one individual’s whole genome can be sequenced in a few weeks. The accumulation of sequence information, generated by the next generation sequencing technologies (NGS), allows researchers to identify large numbers of variants consisting of genetic markers which are very important to understand how they are affecting on hereditary disorders. NGS also boosts up human genome resequencing at low cost, but it has brought about the exponential increase in the amount of data resulting in major computational challenges. To process NGS data, new computational approaches as well as software products have been developed to support the whole genome and exome data analysis. In the results of analyzing 100 Korean individuals’ exome data, we identified a pool of 1,907,598 Single Nucleotide Variants (SNV) and 325,166 Insertion and Deletion (InDel) as initial variations. They are masked with the dbSNP and 1000 Genome Project (1KGP) as the known variation for constructing a database of Korean variations. The database can be utilized as a pilot database of Korean variome and contribute to Korean variome study. The discovered variants and annotation are stored in a newly developed Hanyang variome database (http://166.104.77.48). Information is linked to other related databases in order to allow researchers to access information in a quick and easy way. Moreover, applying the methods from the exome study, we released an automated pipeline for analyzing the whole exome and genome sequence (WES/WGS) population data for novice researchers in Bioinformatics and Genomics fields. Analysis results include various statistical features, such as population distance relationship, Principle Component Analysis (PCA), variants qualities and visualization through a genome browser.

비침습적산전검사(NIPT)에서 태아DNA비율(FF) 추정방법들의 비교 연구

김예진 한양대학교 의생명공학전문대학원 2018 국내석사

오늘날 비침습적산전검사(Non-Invasive Prenatal Testing; NIPT)는 대규모 병렬염기서열분석(Massively Parallel Sequencing; MPS)이 적용되어 태아의 염색체 이수성 진단에 널리 사용되고 있다. 모체혈장 내 태아의 DNA 비율인 Fetal Fraction(FF)은 비침습적산전검사의 정확성을 좌우하는 중요 요소이므로, FF를 보다 정확하게 측정하기 위한 다양한 방법들이 개발되어 적용되고 있다. Y 염색체 기반의 FF 추정방법은 정확하지만 남자태아에게만 수행할 수 있으며, SNP 기반의 FF 추정방법인 FetalQuantSD는 모든 성별에 사용 가능하지만 SNP 유전형검사에 추가 비용이 필요하다. 반면에 통계모델 기반 FF 추정방법인 SeqFF는 대량의 데이터와 다변량회귀모형을 이용하여 계산하는 방법으로, 추가비용 없이 모든 성별 태아의 FF를 추정할 수 있는 장점이 있지만, 낮은 FF의 경우에는 부정확한 추정결과가 나올 수 있다는 단점이 있다. 본 연구에서는 약 2,100명의 임신부 혈액시료에서 생산된 기존 자료를 사용하여 대표적인 Y 염색체 기반, SNP 기반, 통계모델 기반의 FF 추정방법들의 결과를 서로 비교해 보았다. Y 염색체 기반 FF 추정방법(YFF)은 2,058명의 남자태아를 임신한 모체의 혈액시료에서 생산된 기존 자료를 사용하여 각 태아의 Y 염색체에 해당하는 DNA 비율을 계산하였다. SNP 기반 FF 추정방법(SFF)은 90명(남녀 각 45명 태아 임신부)의 모체 혈액시료에서 생산된 기존 자료를 사용하여 SNP 유전변이를 검출한 후, 태아의 SNP 유전변이 비율을 구하여, 태아의 DNA 비율을 측정하였다. 통계모델 기반 FF 추정방법은 SeqFF 논문에 제시된 사전학습모델을 그대로 사용하여 각 구간 내 리드(read)의 개수를 세어 태아의 DNA 비율을 계산하였다. 위의 세 가지 방법으로 계산된 FF들은 상관분석(correlation analysis)을 통해 서로 비교하였다. SNP 기반 FF 추정방법(SFF)과 Y 염색체 기반 FF 추정방법(YFF)의 상관관계는 남자태아 시료인 45명 대상에서만 비교가 가능하였고, r=0.929인 높은 상관관계를 보였다. SNP 기반 FF 추정방법(SFF)과 SeqFF FF 결과의 상관관계는 남자태아 시료인 45명 대상인 경우 r=0.800, 90명의 남녀태아 전체 대상인 경우는 r=0.813을 보였다. Y 염색체 기반 FF 추정방법(YFF)과 SeqFF FF 결과의 상관관계는 r=0.798(남자태아 45명 대상)과 r=0.832(남자태아 2000명 대상)을 보였다. 결론적으로 통계모델 기반의 SeqFF 방법은 염기서열분석자료 만을 가지고 모든 성별 태아 검사에 적용할 수 있다는 장점은 있으나, 일반적으로 Y 염색체 기반 및 SNP 기반 방법에 비해서는 상대적으로 정확도가 떨어지며, 특히 5% 이하의 FF을 추정하는 경우 현저하게 정확도가 떨어질 수 있음을 알 수 있었다. 따라서 높은 정확성의 장점을 가진 Y 염색체 및 SNP 기반의 FF 측정의 더 많은 실험자료를 수집하여, SeqFF와 같이 저비용으로 태아 성별에 무관하게 적용할 수 있는 보다 더 정확한 FF 추정방법의 개발이 비침습적산전검사의 임상적 유용성을 증가시킬 것으로 생각된다. Today, non-invasive prenatal testing (NIPT) by massively parallel sequencing (MPS) is widely used in detecting fetal chromosomal aberrations. Since fetal fraction (FF) of maternal plasma is a key factor affecting the accuracy in NIPT analysis, various methods have been developed and applied to measure FF more accurately. Y chromosome-based FF estimation is accurate, but can only be performed on male fetuses. A SNP-based FF estimation (i.e. FetalQuantSD) can be applied to both male and female fetuses, but requires additional cost for SNP genotyping. A statistical model based FF estimation (i.e SeqFF) is applicable to both male and female fetuses without any additional cost. SeqFF uses a multivariate regression model based on a large amount of data, and it has a disadvantage of providing inaccurate estimation when FF is low. In this study, the estimated FFs by the representative three methods mentioned above were compared. The total data set used for the three methods was produced from approximately 2,100 pregnant maternal samples in the previous studies, but in this study the same subset of data was used for each pair of FF comparison. Y chromosome-based FF estimation(YFF) was performed with 2,058 male fetus pregnant sample data, and the DNA proportion of each fetal Y chromosome was calculated. SNP-based FF estimation (SFF) was done with previously generated SNP genotyping and sequencing data in 90 fetus pregnant samples (male 45 and female 45 each). The fetal DNA proportion was measured by calculating the SNP genetic variation ratio of each fetus. Statistical model based FF estimation (SeqFF FF) was done with the published pretrained model which was based on the regional block based read counts. The FF estimation results by the three methods were compared with correlation analysis. The correlation analysis between SFF and YFF was done for 45 male fetus pregnant sample data, and shows high correlation (r=0.929). The correlation between SFF and SeqFF FF shows r=0.800 for 45 male fetus pregnant sample data, and r=0.813 for 2000 male fetus pregnant sample data. The correlation between YFF and SeqFF FF shows r=0.798 for 45 male fetus pregnant sample data, and r=0.832 for 2000 male fetus pregnant sample data. Generally, in spite of its advantage in clinical application, SeqFF estimation is relatively less accurate than that of the Y chromosome method (YFF) or SNP method (SFF), and cannot be applicable in case of FF less than 5% because of its very low correlation. Therefore, collection of large amount of data from high accuracy methods like Y chromosome-based and SNP-based FF estimation may promote development of more accurate gender independent and low cost FF estimation methods. Thereby, new methods may increase clinical usefulness of NIPT even in case of low FF cases.

5년간 한 기관에서 유행한 Clostridium difficile PCR ribotype 017과 018 균주의 분자역학적 분석

서미란 한양대학교 의생명공학전문대학원 2016 국내박사

배경 및 목적 Clostridium difficile infection (CDI)는 중요한 병원 획득 감염 중 하나이다. 지역별로 균주의 분포가 달라서 북아메리카와 유럽에는 고병원성 C. difficile 균주 (hypervirulent ribotype 027/BI/ NAP1)가 유행하는 반면, 국내에서는 PCR ribotype 018균주(A+B+CDT-)와 PCR ribotype 017균주 (A-B+CDT-)가 유행하고 있다. 이번 연구의 목적은 국내 일개 병원에서 2009년부터 2013년까지 5년간 수집한 PCR ribotype 017 (RT017)과 PCR ribotype 018 (RT018)균주의 클론성과 항생제 내성의 변화를 추적 관찰하는 것이다. 방법 2009년 1월부터 2013년 12월까지 수집한 1,605 균주들을 대상으로 독소 유전자 multiplex PCR과 PCR ribotyping을 시행하였다. 병록지를 후향적으로 검토하여 병원 획득 CDI를 선별하였다. C. difficile RT018균주 207주와 RT017균주 201주를 대상으로 MLVA 분석을 하였고 주요 항생제 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다. MLVA 분석은 CDR4, CDR5, CDR9, CDR48, CDR49 그리고 CDR60의 MLVA loci의 PCR을 하여 genotyping을 하고 Bionumerics software (Version 5.1; Applied Maths NV, Sint-Martens-Latem, Belgium)를 이용하여 Minimum spanning tree analysis (Summed tandem-repeat distance ≤2 기준)를 하였다. Clindamycin, moxifloxacin, metronidazole과 vancomycin은 Etest로 최소억제농도를 측정하였고, piperacillin/tazobactam과 rifaximin은 한천배지희석법을 이용하였다. 결과 2009년 1월부터 2013년 12월까지 수집한 총 균주 수는 1,605개 이었고 중복 검사, 설사가 없는 환자 및 소수의 지역사회 감염 등을 제외한 병원 획득 감염에서 분리된 것은 총 789균주 (49.2%) 이었다. 독소 발생 유전자의 분석 결과 A+B+CDT-균주는 전체의 67.2% (530/789), A-B+CDT-균주는 전체의 25.7% (203/789) 그리고 binary toxin 양성인 A+B+CDT+균주는 3% (24/789) 였다. A-B+CDT-균주는 모두 RT017이었고, A+B+CDT-균주 중 207 균주가 RT018이었다. 두 ribotype의 년도 별 분포는, RT018은 2009년 28.9% (37/128), 2010년 33% (60/182), 2011년 28.5% (45/158), 2012년 30.1% (52/173) 그리고 2013년 8.8% (13/148)의 분포를 보였다. C. difficile RT017균주는 2009년 15.6% (20/128), 2010년 32.4% (59/182), 2011년 31.6% (50/158), 2012년 16.8% (29/173) 그리고 2013년 29.1% (43/173)의 분포였다. 이 두 ribotype은 전체 HA-CDI의 50% 정도를 차지하였다. 총 408 균주를 대상으로 MLVA를 시행한 결과, RT018은 78 MLVA types으로 6개의 clonal complex (CC)를 형성하였다. 년도 별 MLVA type의 분포는 2009년 21 MLVA type, 2010년 27 MLVA type, 2011년 22 MLVA type, 2012년 23 MLVA 그리고 2013년 10 MLVA type으로 구성되었다. 주요 CC-I은 전체 207균주의 71.5% (n=148)를 포함하고 51 MLVA type으로 구성되었다 [2009, 83.8% (31/37); 2010, 93.3% (56/60); 2011, 42.2% (19/45); 2012, 59.6% (31/52); 2013, 84.6% (11/13)]. 반면에 CC-II에는 10 MLVA type의 36균주가 포함되어있으며, 주로 2011년 (n=23)과 2012년 (n=11)균주로 구성되었다. 64 MLVA types으로 구성된 RT017은 5개의 clonal complex을 형성하였다. 년도 별 MLVA type의 분포는 2009년 16 MLVA type, 2010년 22 MLVA type, 2011년 19 MLVA type, 2012년 11 MLVA 그리고 2013년 12 MLVA type으로 구성되었다. 가장 큰 CC-A는 42 MLVA type의 165균주 (82.1%)로 구성되어있으며 2010년도부터 2013년도의 대부분의 균주들이 포함되어있다 [2009, 20% (4/20); 2010, 94.9% (56/59); 2011, 96% (48/50); 2012, 86.2% (25/29); 2013, 76.7% (33/43)]. RT018균주는 2011년에 CC-II가 급격히 증가한 후 2012년 기존의 CC-I으로 회복되는 반면, RT017균주는 2010년 CC-A가 급격히 팽창한 후 2013년까지 유지되었다. C. difficile RT018 207 균주의 항생제 감수성 검사 결과, clindamycin와 moxifloxacin은 각각 97.6%과 98.6%으로 높은 내성율을 보인 반면에 vancomycin은 매우 낮은 내성율을 보였다 (1.4%). Clindamycin, moxifloxacin과 vancomycin의 MIC50은 각각 >256, >32, 0.19ug/ml이고, MIC90은 >256, >32과 0.5ug/ml이었다. C. difficile RT017 201 균주의 항생제 감수성 검사 결과, clindamycin와 moxifloxacin은 각각 100%과 98.5%의 높은 내성율을 보였다. Clindamycin과 moxifloxacin의 MIC50은 각각 >256, >32ug/ml이고, MIC90은 >256, >32ug/ml으로 나타났다. C. difficile RT017과 RT018의 모든 균주들은 metronidazole과 piperacillin/tazobactam에 대해 감수성이 높았다 (MIC90, 0.094, 16ug/ml). 반면 rifaximin에 대해서 RT017은 88.1%의 내성율을 보인 반면에 RT018은 8.2%로 내성률이 매우 큰 차이를 보였다 (MIC50 and MIC90: >64, >64 vs. 0.0038, 0.5ug/ml). 항생제 감수성 결과에 상관없이 각 항생제의 MIC를 연도별 값으로 비교하면 RT018균주에서 clindamycin, moxifloxacin, rifaximin, piperacillin/tazobactam 및 metronidazole의 MIC는 통계적으로 유의하게 증가하였고, RT017균주는 moxifloxacin과 metronidazole의 MIC는 증가 vancomycin의 MIC의 감소를 보였다. 결론 5년동안 한 대학병원에서 유행한 RT017과 RT018균주는 각각의 밀접한 클론 연관성을 보였다. C. difficile RT017과 RT018균주는 clindamycin과 moxifloxacin에 대해 높은 내성율을 보였고 rifaximin에 대해서는 RT017이 RT018보다 높은 내성율을 보였다.

다채널 전극을 이용한 집속 초음파 자극에 의한 해마뉴런의 활동전위의 변화 연구

최정봉 한양대학교 의생명공학전문대학원 2014 국내석사

지난 한 세기 동안 신경 생리학 분야에서 진단과 치료를 위한 뇌 변조(Neuromodulation) 방법들이 연구되어왔다. 최근에 연구자들은 위험요소가 존재하는 침습적인 뇌 변조 방법들을 대체하기 위한 수단으로서 신경 시스템에 집속 초음파 자극을 가하였을 때 신경 활동의 변화를 유발 할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 이러한 집속 초음파 자극은 좁은 영역에 에너지를 집중 할 수 있어 다른 비 침습적인 뇌 변조 기술보다 더 높은 공간 해상도와 침투 깊이를 가진다. 본 실험에서는 미세 전극 배열 위에 배양된 신경세포에 다양한 파라메터의 초음파 자극을 인가하였을 때 신경 세포의 활동에 나타나는 변화를 보고자 한다. 실험에 사용된 신경세포는 임신한지 16일이 된 Sprague-Dawley rat의 태아의 해마에서 추출하였다. 하나의 미세 전극 배열 마다 100,000개의 셀이 분포해 있도록 하였다. 모든 실험은 세포배양을 시작한지 14일 째 되는 날부터 17, 20, 24, 26 일 째 되는 날에 진행하였다. 실험에서 초음파 자극을 발생시키기 위해 500kHz의 중심 주파수를 가지는 초음파 트랜스듀서를 사용하였다. 실험 결과 특정 파라미터로 초음파 자극을 가하였을 때 해마 신경 세포에서 spike 발생 빈도가 초음파 자극을 가하기 전보다 증가하거나 감소하는 결과를 보였다. 이러한 변화는 다 전극 배열의 전체에서 발생하지는 않지만 대부분 전체 전극 개수의 약 50% 정도의 전극에서 이러한 변화를 관찰 할 수 있었다.