SYBR Green Ⅰ을 이용한 선박평형수내 해양 바이러스 생사 판별 방법

현봉길(Bonggil Hyun),우주은(Jooeun Woo),장민철(Min-Chul Jang),신경순(Kyoungsoon Shin) 한국해양환경·에너지학회 2017 한국해양환경·에너지학회 학술대회논문집 Vol.2017 No.10

본 연구에서는 미국 USCG Phase Ⅱ 규정 발효 시 적용될 것으로 예측되는 해양 바이러스의 생사판별을 위해서 SYBR Green Ⅰ 적용 가능성에 대해서 알아보고자 하였다. 먼저 SYBR Green Ⅰ의 염색 효율은 시료 내 생물의 농도와 밀접한 연관성을 갖고 있기 때문에, 실험 해역인 장목만 해수를 이용해서 적정 시료 부피 및 농도를 확인하였다. 또한 실제 선박평형수관리시스템(BWMS)중 하나인 전기분해장치를 이용해서 전기분해장치 통과 전 후 바이러스의 개체수 밀도도 확인해 보았다. 실험결과를 보면, 장목민 자연 해수인 경우 시료 부피는 0.5 mL~2 mL, SYBR Green Ⅰ 염색 시약을 100배 및 200배 희석한 조건에서 가장 선명하게 관찰이 되는 것으로 확인되었다. 전기분해장치통과전 장목만 해역 내 바이러스 개체수 밀도는 mL 당 10<SUP>7</SUP> 개체 이상이며, 5일후 대조수에서도 뚜렷한 개체수 변화는 관찰되지 않았다. 하지만 5일후 처리수내에서는 염색된 바이러스가 관찰되지 않았다. 다양한 처리 방법에 따른 추가적인 검증 실험이 필요하지만, USCG Phase Ⅱ 규제 발효 시 해양 바이러스 생사판별을 수행하는데 있어서 SYBR Green Ⅰ 염색법은 좋은 대안이 될 수 있다고 판단된다. We investigated the potential applicability of SYBR Green Ⅰ for the live/dead determination of marine viruses that are expected to be applied in the USCG(United States Coast Guard) Phase Ⅱ regulation. Since the staining efficiency of SYBR Green Ⅰ was closely related to the density of organisms in the sample, the optimal filtration volume and SYBR Green Ⅰ concentration was determined using seawater in Jangmok bay. We also checked the live/dead of marine viruses in the samples before and after passing through the electrolysis that is one of the ballast water management system(BWMS). Our data showed that stained virus was most clearly observed under the conditions of 100 and 200 times dilution of SYBR Green Ⅰ regent when sample volume was 0.5mL~2mL. In the control water, the number of viruses was more than 10<SUP>7</SUP>mL<SUP>-1</SUP>. while marine virus was not observed in treated water after 5 days. Although additional verification experiments are need using various BWMS. SYBR Green Ⅰ staining method is considered to be a good alternative for the live/dead determination of marine viruses when USCG Phase Ⅱ regulation will enforce.

선박평형수처리장치 성능 평가를 위한 해양 바이러스 생사판별 방법 개발

현봉길(Bonggil Hyun),우주은(Joo-Eun Woo),장풍국(Pung-Guk Jang),장민철(Min-Chul Jang),이우진(Woo-Jin Lee),배미경(Mi-Kyung Bae),신경순(Kyoungsoon Shin) 한국산학기술학회 2021 한국산학기술학회논문지 Vol.22 No.1

본 연구는 향후 보다 강화될 것으로 예측되어지는 USCG Phase II 형식승인시험을 대비하기 위해 SYBR Green I과 SYBR Gold의 염색 효율을 비교한 후 염색 효율이 높은 시약을 실제 선박평형수처리장치(electrolysis type, UV + electrolysis type)를 통과한 처리수에 적용해서 보았다. 시료의 부피가 0.5 mL ∼ 2 mL, 염색 시약(Stock solution)을 100배 및 200배 희석한 조건에서 염색된 바이러스가 가장 선명하게 관찰되었다. SYBR GreenI과 SYBR Gold의 염색효율은 장목한 해수조건의 실험구에서 유의한 차이를 보이지 않았지만, SYBR Gold의 노란색에 비해 SYBR Green I으로 염색된 시료에서 발현하는 녹색 형광이 보다 선명해서 관찰이 용이한 것으로 확인되었다. 선박평형수처리장치(electrolysis type, UV + electrolysis type)를 통과하지 않은 실험수 및 대조수에서의 해양 바이러스 현존량은 약 10<SUP>9</SUP>~10<SUP>10</SUP> VLP 100 mL<SUP>-1</SUP> 으로 확인된 반면, 처리수에서는 살아 있는 바이러스가 관찰되지 않았다. 실험수 결과를 보면, SYBR Green I은 해수, 기수, 담수 조건에서 효과적으로 염색이 되는 것으로 확인되었다. 다양한 선박평형수처리기술에 따른 추가적인 검증 및 염색 방법 개발이 필요하지만, SYBR Green I 염색법은 USCG Phase II 미국형식승인시험 바이러스 생산판별에 좋은 대안이 될 수 있을 것으로 판단된다. To prepare more stringent regulations for USCG Phase II ballast water management, this study investigated the staining efficiency of SYBR Green I(SGI) and SYBR Gold(SG) on the virus-like particle (VLP). A dye with high staining efficiency was applied to the treated water that was passed through the ballast water treatment system (BWTS). VLP staining was observed most clearly under the 100-fold and 200-fold dilution of the stock solution when the volume of filtered samples was 0.5 mL to 2 mL. The staining efficiency of SGI and SG did not show a significant difference. On the other hand, the green fluorescence of viruses in the sample stained with SGI was more pronounced than in the samples stained with SG (expressed yellow fluorescence), making it easier to observe. The abundance of VLP in the test water and control water treatments that did not pass through the two types of BWTS (electrolysis type, UV + electrolysis type) was approximately 10<SUP>9</SUP> - 10<SUP>10</SUP> VLP 100 mL<SUP>-1</SUP>. In contrast, no stained VLP was observed in the treated water treatments. Moreover, SGI was confirmed to be effectively stained under various salinity conditions, including seawater, brackish water, and freshwater. Further verification tests and development of staining methods under various BWTS are required, but the SGI staining method is believed to be a good alternative to the VLP live/dead determination of the USCG Phase II type approval test.

선박평형수 처리 시스템 효율 검증을 위한 해양 플랑크톤 생사판별시 Neutral red 염색법 적용 가능성 연구

현봉길,신경순,정한식,최서열,장민철,이우진,최근형,Hyun, Bonggil,Shin, Kyoungsoon,Chung, Hansik,Choi, Seo-Yeol,Jang, Min-Chul,Lee, Woo-Jin,Choi, Keun-Hyung 한국해양학회 2014 바다 Vol.19 No.4

선박평형수를 통한 외래종 확산을 방지하기 위해 국제해사기구(IMO)에서는 2004년 선박평형수관리협약을 채택하였다. 이 협약에 따르면 앞으로 대부분의 선박들은 선박평형수 처리시스템을 통해서 해양 생물을 사멸 또는 제거시킨 후 배출해야 하며, 이는 플랑크톤의 생사판별방법을 통하여 이루어진다. 본 연구에서는 국제적으로 선박평형수 처리후 생사판별법으로 널리 사용되고 있는 fluorescein diacetate assay (FDA) 염색방법의 제한성과 이의 대안으로 Neutral red (NR) 염색방법사용 가능성을 살펴보고자 하였다. FDA 염색법은 대부분의 플랑크톤 염색에 되어서 현재 가장 널리 사용되는 방법임에도 불구하고 본 연구에서는 Ditylum brightwellii 을 제외한 모든 식물플랑크톤 대해서 낮은 염색 효율(전체 평균 염색 효율 <50%)을 보였으며, 식물플랑크톤이 갖는 고유한 형광(적색)에 간섭을 많이 받는 것으로 나타났다. 또한 FDA는 형광파장에 노출된 후 빠르게 색이 바래지는 경향도 관찰되었다. 반면에 NR은 조사된 모든 동 식물플랑크톤 개체수에 대해서 90% 이상의 높은 염색 효율을 보였다. 두 염색법 모두 포르말린을 이용해서 사멸시킨 동 식물플랑크톤에 대해서는 염색이 되지 않았다. 본 연구결과를 통해서 NR 염색법을 이용한 동 식물플랑크톤 생사판별은 매우 효율적이라고 판단된다. In order to prevent the spread of non-indigenous aquatic species through the ballast water in commercial ships, International Maritime Organization (IMO) adopted in 2004 the International Convention for Control and Management of Ship's Ballast Water and Sediments. The Convention mandates treatment of ballast water for most transoceanic voyages and its confirmation of treatment is made with plankton live/dead assay. Fluorescein diacetate assay (FDA), which produces bright green light for live phytoplankton, has been a de facto standard method to determine the survival of marine plankton, but its staining efficacy has been in dispute. In the present study, we examined the limitation of FDA, and compared its efficacy with Neutral red (NR) staining, another promising assay and widely used especially for zooplankton mortality. For all phytoplankton species studied in the present study, except Ditylum brightwellii, the staining efficiency was <50% with FDA. The green FDA fluorescence interfered with phytoplankton autofluorescence in most samples. In contrast, NR assay stained over 90% of both phytoplankton and zooplankton species tested in this study. FDA assay also showed that green FDA fluorescence rapidly faded when phytoplankton cells were exposed to microscope light. Both FDA and NR assay were negative on formalin-killed individuals of both phytoplankton and zooplankton species. Our results suggest that NR assay is more effective for determining the survival of marine plankton and can be applied to test the efficacy of ballast water treatment.

USCG Phase II 선박평형수 성능 평가를 위한 해양 식물플랑크톤군집 대량 확보 및 생물사멸시험

현봉길,백승호,이우진,신경순,Hyun, Bonggil,Baek, Seung Ho,Lee, Woo Jin,Shin, Kyoungsoon 해양환경안전학회 2016 해양환경안전학회지 Vol.22 No.5

The type approval test for USCG Phase II must be satisfied such that living natural biota occupy more than 75 % of whole biota in a test tank. Thus, we harvested a community of natural organisms using a net at Masan Bay (eutrophic) and Jangmok Bay (mesotrophic) during winter season to meet this guideline. Furthermore, cell viability was measured to determine the mortality rate. Based on the organism concentration volume (1 ton) at Masan and Jangmok Bay, abundance of ${\geq}10$ and $<50{\mu}m$ sized organisms was observed to be $4.7{\times}10^4cells\;mL^{-1}$and $0.8{\times}10^4cells\;mL^{-1}$, and their survival rates were 90.4 % and 88.0 %, respectively. In particular, chain-forming small diatoms such as Skeletonema costatum-like species were abundant at Jangmok Bay, while small flagellate ($<10{\mu}m$) and non chain-forming large dinoflagellates, such as Akashiwo sanguinea and Heterocapsa triquetra, were abundant at Masan Bay. Due to the size-difference of the dominant species, concentration efficiency was higher at Jangmok Bay than at Masan Bay. The mortality rate in samples treated by Ballast Water Treatment System (BWMS) (Day 0) was a little lower for samples from Jangmok Bay than from Masan Bay, with values of 90.4% and 93%, respectively. After 5 days, the mortality rates in control and treatment group were found to be 6.7% and >99%, respectively. Consequently, the phytoplankton concentration method alone did not easily satisfy the type approval standards of USCG Phase II ($>1.0{\times}10^3cells\;mL^{-1}$ in 500-ton tank) during winter season, and alternative options such as mass culture and/or harvesting system using natural phytoplankton communities may be helpful in meeting USCG Phase II biological criteria.

우리나라 주요 국제항에 입항하는 중국 기원 선박의 평형수내 수질 및 식물플랑크톤 특성 연구

장풍국,현봉길,장민철,신경순,Jang, Pung-Guk,Hyun, Bonggil,Jang, Min-Chel,Shin, Kyoungsoon 해양환경안전학회 2016 해양환경안전학회지 Vol.22 No.7

본 연구는 우리나라 주요 국제항에 출입하는 중국기원 선박의 선박평형수내 환경 및 부유생물의 특성을 파악하여 선박평형수 처리장치(BWTS)와 관련된 면제 협상을 위한 기초자료를 확보하고자 하였다. 조사된 37척의 선박 중 평형수의 보관 기간은 발해만을 포함하는 북부지역(지역 "A")에서 평균 $3.91{\pm}4.61days$로 가장 짧았다. 총부유물질의 농도는 $1.80{\sim}266mg\;L^{-1}$의 범위를 보였고, 용존성 및 입자성 유기물질은 각각 $1.09{\sim}5.79mg\;L^{-1}$, $0.17{\sim}3.65mg\;L^{-1}$의 범위를 나타내었다. 영양염 농도는 양자강 유역을 포함한 지역 "B"에서 높았고, 홍콩을 포함하는 지역 "C"에서 낮은 평균값을 보였다. 엽록소-a 평균 농도는 $0.67{\pm}1.15{\mu}g\;L^{-1}$로 나타났고, $1{\mu}g\;L^{-1}$ 이상의 높은 값은 지리적으로 우리나라와 가까운 지역 "A"에서 7척 중 3척이 집중되었다. 식물플랑크톤의 개체수가 > $10,000cells\;L^{-1}$의 선박평형수는 37척 중 6척으로 나타났고, 이 중 3척이 지역 "A" 기원으로 파악되었다. 특히, 홍콩항에서는 유해미세조류로 잘 알려진 와편모그룹의 종이 높은 밀도로 관찰되었다. 본 연구 결과, 중국과의 BWTS 면제권 협상은 신중하게 접근할 필요성이 있다고 판단된다. The water quality and phytoplankton presence in the ballast water (BW) of 37 vessels originating from the international ports of China were investigated to facilitate negotiations for exemptions to the Ballast Water Management Convention (BWM Convention). The shortest duration given BW spent in a vessel was $3.91{\pm}4.61days$ in area "A", which included the Bohai Sea. Total suspended solids, dissolved organic carbon, and particulate organic carbon ranged from 1.80 to $266mg\;L^{-1}$, from 1.09 to $5.79mg\;L^{-1}$, and from 0.17 to $3.65mg\;L^{-1}$, respectively. A low average concentration of nutrients was measured in BW from area "C", but the concentration of nutrients in BW from area "B" (around the Changjiang estuary) was high, which may be related to the relevant supply of freshwater. A high chlorophyll-a concentration (> $1{\mu}g\;L^{-1}$) was measured in six vessels, three of which carried BW in the area "A". High abundance of phytoplankton (> $10,000cells\;L^{-1}$) was measured in four vessels, two of which carried BW in the area "C". Vessel No. 37, originating from Hong Kong Bay in area "C", showed a high density of dinoflagellates. The results suggest that BWM Convention exemption negotiations with China should be performed cautiously.

선박평형수처리장치 형식승인을 위한 식물플랑크톤 샘플링 방법 비교

장풍국(Pung-Guk Jang),현봉길(Bonggil Hyun),이우진(Woo-Jin Lee),최근형(Keun-Hyung Choi) 한국산학기술학회 2020 한국산학기술학회논문지 Vol.21 No.12

본 연구는 선박평형수처리시스템(BWMS) 형식승인을 위한 국제해사기구(IMO)와 미국해양경찰(USCG)의 시험방법 중 차이가 큰 식물플랑크톤의 전처리 방법을 비교하기 위해 배양종, 자연종, 그리고 BWMS의 육상시험에서 채취한 식물플랑크톤 샘플을 이용해 농축과 비농축에 대한 비교시험을 수행했다. 배양종과 자연종의 비교 시험은 농축하는 과정에서 네트 손실 및 손상이 있는 것으로 확인되었으며, 이는 대상종의 생리 · 형태적 특성에 따라 차이가 있음을 확인했다. BWMS 육상시험에서 생물 농도가 높은 대조수의 경우 비농축한 시료 개체수가 농축한 시료보다 2배 정도 높은 값을 보였고, 생물 개체수가 낮은 처리수는 두 방법 간의 뚜렷한 차이가 없었다. 이러한 결과는 미국형식승인 방법으로 육상시험을 수행하면 시험수 조건이 더 가혹하다는 것을 의미한다. 결과적으로 식물플랑크톤 샘플링 과정에서 농축과 비농축의 차이가 있음에도 불구하고, 농축 방법이 BWMS 성능을 평가하는 방법으로 적용할 수 있을 것으로 판단된다. 하지만 처리수 내에서 살아있는 종이 샘플링의 농축 과정에서 네트 손실 및 손상이 있을 수 있기 때문에 대상종에 대한 평가방법을 개발할 필요성이 있다. This study aimed to compare the pretreatment methods of phytoplankton for type approval of the Ballast Water Treatment System (BWMS). The International Maritime Organization (IMO) and the United States Maritime Police (USCG) use two different test methods for this purpose. To compare the two methods, a test for concentration and non-concentration was performed with cultured and natural phytoplankton, and samples from the land-based BWMS test. The extent of damages caused by the process of concentration varied between cultured and natural species, indicating differences depending on the physiological and morphological characteristics of the species. In the land-based test, in the control water with a high biological population, the number of non-concentrated samples was about twice as high as that of the concentrated samples. There was no distinct difference between the two methods in the treated water with a low biological population. Thus, although there is a difference between concentration and non-concentration for phytoplankton sampling, the concentration method can be applied as a method of evaluating BWMS performance. However, a method for evaluating whether live species in treated water may be lost or damaged during the concentration process of sampling should be developed and validated.