테스토스테론 물질 검출을 위한 in vitro TCD 시스템 구축

이동근(Dong-Geun Lee),조정권(Jung-Kwon Jo),이상현(Sang-Hyeon Lee) 한국생명과학회 2019 생명과학회지 Vol.29 No.10

남성호르몬 감소와 관련된 남성갱년기에 대한 관심이 고조되고 있지만, 남성호르몬의 정량을 위해 항체를 이용하는 고가의 kit가 이용되고 있다. 본 연구에서는 in vitro 전사 활성 시험법을 이용하여 남성 스테로이드호르몬의 활성 혹은 농도를 검증하는 시스템을 구축하였다. 테스토스테론-AR (androgen receptor) 복합체와 반응하는 ARE-AdE1bTATA 염기서열이 삽입되고 리포터로 luciferase를 발현하는 테스토스테론 유사활성 검증 리포터 플라스미드인 pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA를 제조하고, 인체 전립선암 세포인 LNcap-LN3 세포에 stable transfection을 실시하였다. 구축된 LNcap-LN3/pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA TCD (testosterone compound detection)시스템은 표준물질인 테스토스테론의 10<SUP>-13</SUP>~10<SUP>-8</SUP> M 범위에서 농도 증가에 비례하는 정량성을 보였다. 이 연구에서 확립된 in vitro TCD 시스템을 이용하면 천연물 유래 테스토스테론 유사물질 및 테스토스테론 저하물질의 대량탐색 등이 가능할 것이므로, 건강기능성 식품이나 의약품 신소재의 개발에 기여할 것이다. Although there is a growing interest in male menopause, a phenomenon associated with male hormone depletion, current kits using antibodies to quantify male hormones are expensive. In this study, we constructed an in vitro system for verifying the activity or concentration of male steroid hormones using a transcriptional activity test. A reporter plasmid, pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA, which reacts to testosterone, was constructed. In this plasmid, the ARE-AdE1bTATA sequences can be bounded by the testosterone - androgen receptor complex to express luciferase as a reporter. Then, a stable transfection was performed on the human prostate cancer cell line, LNcap-LN3. The constructed LNcap-LN3/pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA testosterone compound detection (TCD) system showed quantitatively proportional luciferase activities to concentrations of 10<SUP>-13</SUP> to 10-8 M of standard testosterone. The established in vitro TCD system will contribute to the development of materials for health/functional foods and drugs as it will be possible to search en masse for testosterone-like or testosterone-inhibiting substances derived from natural materials.

In vitro 검출 시스템을 이용한 한약재 열수 및 에탄올 추출물의 남성호르몬 유사활성 검출

이동근(Dong-Geun Lee),조정권(Jung-Kwon Jo),이상현(Sang-Hyeon Lee) 한국생명과학회 2020 생명과학회지 Vol.30 No.6

이 연구의 목적은 시험관내 TCD (테스토스테론 화합물 검출) 시스템으로 8개 한약재의 테스토스테론 유사 활성을 검색하는 것이었다. 녹각상, 백수오, 야관문, 홍삼, 토령, 민들레, 남가세, 호로파의 열수 추출물과 80% 에탄올 추출물을 5, 50, 500 μg/ml의 농도로 in vitro TCD 시스템에 적용하였다. 80% 에탄올 추출물의 테스토스테론 유사활성은 일반적으로 농도에 비례하였고, 음성대조군보다 0.9 내지 5.0 배 더 높았다. 호로파와 야관문은 동일한 농도에서 우수한 테스토스테론 유사 활성을 보였으며 민들레와 홍삼이 그 뒤를 이었다. 토령과 남가세는 낮은 테스토스테론 유사 활성을 보였으며 녹각상과 백수오는 매우 낮은 활성을 나타냈다. 양성대조군 5α-DHT의 활성과 비교하면, 호로파 및 야관문의 80% 에탄올 추출물은 500 μg/ml에서 10<SUP>-8</SUP> M 5α-DHT보다 높은 테스토스테론 유사활성을 나타냈다. 열수 추출물은 80% 에탄올 추출물보다 낮은 테스토스테론 유사 활성을 보였고, 농도에 따른 활성의 증가도 에탄올 추출물보다 낮았다. 호로파, 야관문 및 민들레 등의 80% 에탄올 추출물이 테스토스테론 관련 유전자의 전사 효율을 향상시킬 수 있음이 확인되었다. 따라서, 본 연구는 남성 갱년기 증상의 개선에 필요한 건강 기능성 식품 재료 또는 의약 재료를 개발하는 데 참고가 될 수 있을 것이다. The purpose of this study was to screen the testosterone-like activities of eight oriental medicines with an in vitro testosterone compound detection (TCD) system. Distilled water and 80% ethanol, both at 80℃, were used to obtain extracts from Cervus nippon temminck (Nokgaksang), Cynanchum wilfordii (Baeksuo), Lespedeza cuneata (Yagwanmun), Panax ginseng (Hongsam), Smilax china (Toryeong), Taraxacum platycarpum (Mindlre), Tribulus terresteis (Namgase), and Trigonella foenum-graecum (Horopa), and extracts at concentrations of 5, 50, and 500 μg/ml were assessed using the TCD system. The testosterone-like activities of the 80% ethanol extracts were seen to increase with concentration and ranged from 0.9 to 5.0 times higher than those of the negative control; Horopa and Yagwanmun exhibited superior testosterone-like activities, followed by Mindlre and Hongsam at the same concentration. Toryeong and Namgase, on the other hand, showed low activity with Nokgaksang and Baeksuo exhibiting very low levels. Compared with the activities of the positive control (5α-DHT), the 80% ethanol extracts of Horopa and Yagwanmun at a concentration of 500 μg/ml showed higher testosterone- like activities than 10<SUP>-8</SUP> M 5α-DHT. The water extracts showed lower activity levels than the ethanol samples, and the change of activity with concentration was also lower. It was confirmed that the 80% ethanol extracts of Horopa, Yagwanmun, and Mindlre etc. enhance the transcription efficiency of testosterone-related genes and may therefore be useful in developing health food or medicinal treatments for the improvement of male menopausal symptoms.

한약재 열수 및 에탄올 추출물의 여성호르몬 유사활성 검증

이동근(Dong-Geun Lee),조정권(Jung-Kwon Jo),이상현(Sang-Hyeon Lee) 한국생명과학회 2019 생명과학회지 Vol.29 No.9

본 연구에서는 홍삼, 호로파, 민들레, 백수오, 남가새, 녹각상, 토복령, 호로파, 야관문 등의 8개 한약재의 에스트로겐 유사활성을 파악하고자 하였다. 이를 위하여 한약재의 열수- 및 에탄올-추출물을 제조하였고 in vitro 전사 활성 시험법을 이용하여 에스트로겐 유사활성을 검증하였다. 에탄올추출물에서는 홍삼, 백수오, 호로파, 야관문, 민들레가 에스트로겐 유사활성을 나타냈고, 열수출출물에서는 홍삼, 호로파, 백수오가 에스트로겐 유사활성을 나타냈다. 홍삼추출물은 500 μg/ml의 농도에서의 활성은 열수추출물과 에탄올추출물 모두 10<SUP>-8</SUP> M 17β-estradiol의 활성보다 높은 활성을 보였고, 홍삼 에탄올추출물 50 μg/ml과 백수오 에탄올추출물 500 μg/ml에서의 활성은 10<SUP>-9</SUP>와 10<SUP>-8</SUP> M 17β-estradiol에서의 활성 사이의 활성을 보였다. 이 연구를 통해 홍삼, 백수오, 호로파, 민들레 등을 이용한 식물성 여성호르몬 유사물질을 함유하는 기능성소재의 개발에도 기여할 수 있을 것이며 천연물 유래 여성호르몬 유사물질의 대량 탐색 등이 가능할 것이다. The purpose of this study was to investigate the estrogen-like activities of eight oriental medicines, including red ginseng, fenugreek, and dandelion. Hot water and ethanol extracts were prepared from Cervus nippon temminck (Nokgaksang), Cynanchum wilfordii (Baeksuo), Lespedeza cuneata (Yagwanmun), Panax ginseng (red ginseng), Smilax china (Toryeong), Taraxacum platycarpum (Mindeulre, dandelion), Tribulus terresteis (Namgase), and Trigonella foenum-graecum (Horopa, fenugreek). Then, estrogen-like activities were verified by the in vitro transcriptional activity assay. The extracts showing estrogen-like activities were red ginseng, Baeksuo, fenugreek, Yagwanmun, and dandelion in the ethanol extracts, and red ginseng, fenugreek, and Baeksuo in the hydrothermal extracts. Red ginseng extract showed a higher activity than the standard 10<SUP>-8</SUP> M 17β-estradiol in both the hydrothermal and ethanol extract at 500 μg/ml, while the 50 μg/ml of the red ginseng ethanol extract and the 500 μg/ml of the Baeksuo hydrothermal extract showed estradiol activities between 10<SUP>-9</SUP> and 10<SUP>-8</SUP> M 17β-estradiol. This shows that it would be possible to contribute to the development of functional materials using red ginseng, Baeksuo, fenugreek, and dandelion.

한약재 추출물의 항균활성 검증

이창은(Chang-Eun Lee),조정권(Jung-Kwon Jo),김재덕(Jae-Deok Kim),이동근(Dong-Geun Lee),김원석(Won-Seok Kim),이상현(Sang-Hyeon Lee) 한국생명과학회 2017 생명과학회지 Vol.27 No.6

식중독의 원인 세균 및 병원성 세균 7종(Bacillus cereus (11.2, 20), Clostridium perfringens (2.4, 4.7), Escherichia coli (9.1, 9.1), Listeria monocytogenes (11.1, 20), Salmonella typhi (4.7, 9.1), Staphylococcus aureus (2.4, 4.7), Vibrio parahaemolyticus (2.4, 5.3))에 대해 한약재 추출물의 항균 활성을 측정하였다. 추출물은 증류수를 이용한 고온추출법(121℃에서 30분간)으로 제조하였고, 9가지 한약재 추출물의 수율은 0.5-33.4% 범위였다. 종이 디스크 확산법을 이용하여 박테리아에 대한 항균 활성을 평가하였을 때 황련, 지유, 오배자 추출물에서만 항균활성이 나타났다. 황련과 지유 추출물은 Clostridium perfringens과 Listeria monocytogenes에만 항균활성을 나타낸 반면, 오배자는 시험한 모든 세균에 대해 강한 항균 작용을 보였다. 오배자 추출물의 건조시료가 나타내는 최소억제농도(MIC)와 최소살균농도(MBC)는 2.4~20 mg/ml 범위였다. 본 연구결과는 추후 정제와 항균물질에 대한 연구를 통하여 기존 항균제의 보완제 및 식품의 유통기한 증진 등 항균소재로서 응용이 가능할 것으로 기대된다. The antibacterial activities of nine oriental herbal medicine extracts were measured against seven kinds of bacteria known to cause food poisoning and disease. The extracts were prepared with distilled water using an autoclave (121℃ for 30 min). The extraction yields of nine oriental herbal medicines were in the rage of 0.5%-33.4%. The antibacterial activities were evaluated using the paper-disc method. Extracts of Hwangryeon, Jiyu, and Ohbaeja showed antibacterial activities while the others did not. Extracts of Coptis japonica, Hwangryeon, and Sanguisorba officinalis, Jiyu showed antibacterial activities only against Clostridium perfringens and Listeria monocytogenes. Extracts of Rhus javanica, Ohbaeja showed the strongest antibacterial activities against all the bacteria tested. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of R. javanica extracts were in the range of 2.4~20 mg/ml for the bacteria tested. In conclusion, the extract of R. javanica showed superior antibacterial activities against the seven bacterial strains tested. The MIC and MBC values for each bacterium were represented as strain names (MIC, MBC), which were Bacillus cereus (11.2, 20), Clostridium perfringens (2.4, 4.7), Escherichia coli (9.1, 9.1), Listeria monocytogenes (11.1, 20), Salmonella typhi (4.7, 9.1), Staphylococcus aureus (2.4, 4.7), and Vibrio parahaemolyticus (2.4, 5.3). Further purification and study of this antibacterial material would be helpful for developing antibiotics or promoting synergistic effects with known antibiotics, producing antibacterial material for lengthening the shelf-life of food, and so on.

한약재 추출물의 에스트로겐 유사활성 및 조골세포 증식과 분화에 미치는 영향

김미향(Mihyang Kim),김보경(Bokyung Kim),김재덕(Jae-Deog Kim),강아람(A-Ram Kang),이창은(Chang-Eun Lee),서정민(Jungmin Seo),이동근(Dong-Geun Lee),조정권(Jung-Kwon Jo),김육용(Yuck Yong Kim),유기환(Ki Hwan Yu),이상현(Sang-Hyeon Lee) 한국생명과학회 2017 생명과학회지 Vol.27 No.4

본 연구는 3종의 한약재(감초(Glycyrrhizae radix), 황기(Astragali radix) 및 산약(Dioscorea rhizome)) 추출물의 에스트로겐 유사활성 및 조골세포 증식과 분화에 미치는 영향을 검토하고자 실험을 진행하였다. 에스트로겐 유사활성측정을 위하여 인체 유방암 세포주인 MCF7 세포를 luciferase 유전자를 리포터로 사용하는 에스트로겐 반응성 리포터 시스템을 가지는 세포로 형질전환하여 사용하였다. 상기 세포를 이용하여 추출물의 에스트로겐 유사활성을 측정한 결과, 한약재 추출물이 음성대조군과 비교하여 1.11배~5.73배 높은 에스트로겐 유사활성을 나타내었다. 그 중 감초 추출물이 가장 높은 에스트로겐 유사활성을 보였다. 감초 추출물의 에스트로겐 유사활성은 추출물의 농도가 50 μg/ml 및 500 μg/ml 일 때 각각 10<SUP>-8</SUP> M 및 10<SUP>-7</SUP> M 17β-estradiol과 거의 유사한 활성을 나타내었다. 조골세포주인 MC3T3-E1 세포를 이용한 실험에서는 감초 추출물의 농도가 1~1,000 μg/ml 범위일 때 독성을 나타내지 않았다. 황기 추출물은 조골세포에 있어서 유의적인 세포 증식률을 보이지 않았다. 그러나, 감초 및 산약추출물은 각각 148% 및 133%의 최대 증식률을 보였다. 또한, 감초 추출물은 대조군과 비교하여 alkaline phosphatase (ALP) 활성이 증가하였으며, 추출물의 농도가 100 μg/ml 일 때 최대 122%의 ALP 활성을 나타내었다. 또한, Alizarin red S 염색법을 이용한 석회화 형성능 측정에서도 대조군과 비교하여 석회화가 증가하였다. 이러한 결과로 미루어 보아 감초 추출물이 골 형성 및 골다공증 예방 효과가 우수한 식품 소재인 것으로 사료된다. The purpose of this study was to investigate the effect of 3 types of medicinal herbs (Glycyrrhizae radix, Astragali radix and Dioscorea rhizoma) extracts on estrogen-like activities, proliferation and differentiation in osteoblast. Human breast cancer cell line MCF7 was transfected using an estrogen responsive luciferase reporter plasmid for measure the estrogen-like activity. Estrogen-like activities of extracts were in the range of 1.11~5.73 fold to that of negative control. The extract of G. radix showed the strongest estrogen-like activities. The estrogen-like activities of 50 and 500 μg/ml extracts of G. radix were similar to that of 10<SUP>-8</SUP> and 10<SUP>-7</SUP> M standard solution (17β-estradiol), respectively. G. radix extract showed no cytotoxicity against osteoblast MC3T3-E1 cells at 1~1,000 μg/ml. The extract of A. radix showed no significant proliferation of osteoblast. However, the extract of G. radix and D. rhizome showed maximum 148% and 133% proliferation effects. The extract of G. radix also increased alkaline phosphatase activity and the maximum was 122% at 100 μg/ml compared to that of control. The nodule formation by the method of the Alizarin red S staining increased compared to control. These results suggest that G. radix is able to perform the bone formation and prevent osteoporosis.