Concentrations of Bioavailable Testosterone and Dihydrotestosterone Determined by Luminescence Immunoassay in Serum

윤용달,이창주,전은현,이준영,Yoon, Yong-Dal,Lee, Chang-Joo,Chun, Eun-Hyun,Lee, Joon-Yeong The Korean Society for Reproductive Medicine 1988 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.15 No.2

혈액에서 생물학적 활성을 나타내는 (bioavailable) steroid hormone은 주로 비결합형(free form)과 알부민 결합형(albumin-bound form)으로 구성된다. 특히 Testosterone (T)과 5 alpha-Dihydrotestosterone (DHT)의 활성적 분획이 전체의 T, DHT 양에 비해 생리적 현상과 보다 잘 일치하는 것으로 알려지고 있다. 본 연구는 섬광면역측정법(Luminescence immunoassay, LIA)으로 혈청내 활성적 T 및 DHT의 농도의 측정에 이용하고져 하였다. 항체는 T- 또는 DHT-3-CMO-BSA를 항원으로 토끼에 면역주사하여 얻었다. 추적자는 T-3-CMO, DHT-3-CMO에 aminobutylethylisoluminol(ABEI)를 부착시켜 사용하였다. 항체중 IgG분획을 Protein-A-Sepharose CL-4B로 분리한 후 Immunobead(Bio-Rad)에 부착시켜 Solid-phase LIA를 실시하였다. 본 연구에서 LIA는 정확도(accuracy), 정밀도(precision), 감도(sensitivity), 교차반응도(specificity)등을 조사하고, 기존의 방사면역측정법(RIA)과 비교하여 만족할만한 결과를 얻었다. 혈청내 T및 DHT의 활성적 분획의 농도를 측정한 결과는 다음과 같았다. T의 경우는 남성에서 T의 전체량의 33% 이상으로 $7.1{\pm}1.5nmol/l$, 여성에서는 26% 이상으로 $0.28{\pm}0.05nmol/l$이었다. DHT의 활성적 분획은 남성의 경우 $601.7{\pm}85.8pmol/l$, 여성의경우 $52.4{\pm}19.9\;pmol/l$이었다. 이상의 결과를 보아 본 연구에서 이용된 LIA는 혈청내 활성적 농도를 측정하기에 충분하다고 사료된다. 또한 이 방법을 이용하여 여성의 Androgenicity 및 남성 정소기능등의 제어방법에 응용될 수 있을 것으로 판단된다.

Dihydrotestosterone과 Testosterone의 섬광면역 측정법과 응용( I );측정법의 정립

윤용달,김성례,Yoon, Yong-Dal,Kim, Sung-Rye The Korean Society for Reproductive Medicine 1987 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.14 No.2

5${\alpha}$-dihydrotestosterone(DHT)과 testosterone(T)은 남성 생식기관의 주 생성 호르몬들로 그 구조가 매우 비슷하여 이들 각 개를 특이하게 측정(specific determination)하는 방법이 개발되지 않고 있다. 본 연구는 고속액체 크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 이들을 분리한 후 섬광면역측 정법(Luminescence immunoassay, LIA)으로 정량하는 방법을 개발하여 이들의 응용 가능성을 검토하고져 하였다. DHT와 T의 retention time은 각각 10.3min, 17.6min이었다. DHT-LIA와 T-LIA에 서 다른 스테로이드들과의 교차반응도는 방사면역측정법(RIA)과 대동소이하였다. 정도관리(quality control) 시료의 intra-assay variation은 DHT-LIA가 8.7%, T-LIA가 6.0%의 변이계수를 나타내었고, inter-assay variation의 변이계수는 각각 12.0% 및 15.3%이었다. 실측치(y)와 기대치(x)간의 관계를 보면, DHT-LIA경우는 Y=0.94X+0.9(r=0.989), T-LIA는 Y=1.01X+0.06(r =0.988)로 두 측정치 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 위의-측정방법을 이용하여 DHT-enanthate와 T-enanthate 처리후 혈청내 DHT 및 T의 농도변화를 조사한 실험결과 LIA와 RIA의 값사이에 유의한 차이가 없었다. 위의 결과로 보아 본 실험에서 개발된 DHT와 T의 섬광면역측정법은 정립되었다고 사려된다.

THE HORMONAL LEVELS OF THE SHORT LUTEAL PHASE IN KOREAN W0MEN (III);CHANGE OF STEROID GLUCURONIDES

윤용달,Yoon, Yong-Dal The Korean Society for Reproductive Medicine 1985 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.12 No.1

월경주기 중 황체기가 짧은 여성 즉 황체기 단축현상을 가진 한국여성(SLP) 의 특성을 조사하고 진단하는 방법을 개발하기 위하여 본 실험을 행하였다. 재료는 정상 월경주기를 가진 12명의 여성에서 26주기와 8명의 황체기 단축현상을 가진 여성에서 17주기를 선택하였다. 기상후 첫 오줌에서 steroid glucuronides의 농도를 측정하여 비교한 결과는 다음과 같았다. SLP 의 estrone -3 -glucuronide ($E_1G)의 농도는 초기 여포기와 황체기 동안 정상인에 비하여 현저히 낮았다. 또한 SLP 의 전 월경기 중 pregnanediol-$3{\alpha}$-glucuronide($P_2G$)의 농도 역시 유의성있게 낮았다. 그러나 $E_1G/P_2G$의 비율은 여포기가 황체기에 비하여 현저히 높았고, SLP 여성의 비율이 정상인 보다 각 월경주기 중 유의성있게 높았다. 위의 결과로 보아 $E_1G$, $P_2G$및 $E_1G/P_2G$의 농도차로 황체기 단축현상을 가진 여성을 진단 하고 또 치료시 난소의 기능조절에 이욜될 수 있을 것으로 사려된다.

Gonadotropin Bioactivity and Steroids in Ovarian Follicle Matured by Hyperstimulation

윤용달,전은현,김문규,권혁방,Yoon, Yong-Dal,Chun, Eun-Hyun,Kim, Moon-Kyoo,Kwon, Hyuk-Bang The Korean Society for Reproductive Medicine 1989 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.16 No.2

본 연구는 생식주기중 폐쇄여포액내에서 생물학적, 면역학적 특성을 나타내는 GTH 의 변화를 조사하고 steroid hormone과의 상관관계를 조사하며 국부조절인자로서 의 GTH의 역 활을 조사하고자 하였다. 가임기간중 215개의 여포와 IVF과정에서 185개의 여포를 얻어 여포액내 GTH의 생물학적 또는 면역학적 활성을 측정하였다. Bioactive LH(bLH)는 생쥐의 Leydig cell-testosterone production assay, bFSH는 흰쥐의 Sertoli cell aromatase assay로 측정 하였 다. Immunological GTH(iLH , iFSH) 는 MaiaClone RIA , Delfia kits를 사용하였다. 여포액내 iLH, iFSH , ihCG 는 hyperstimulation에 의해 형성된 여포의 크기와는 무관하였다. 또 hMG, huFSH 의 처리와도 상관성이 없었다. T의 농도가 높은 여포액내의 iFSH는 현저히 낮았으며 E, P 가 고농도인 여포의 ihCG 양은 현저히 낮았다. 과배란이 유도된 난소의 여포액내 iLH는 LH specific RIA로 측정시 3mIU/ml 이하이었다. 생식주기중 여포액내 bLH, bFSH는 배란기에 현저히 증가 하였다. 혈청내 GTH B/I ratio는 엘정한 반면 여포액내 LH,FSH의 생물학적, 면역학적 활성은 미수정란을 가지거나 폐쇄된 여포내의 활성보다 현저하게 높았다. 위의 결과로 보아 여포액내 생식소자극호르온은 면역학적활성보다 높은 생물학적 활성을 가지며, 생리적 현상의 지표가 된다고 추론된다. 또한 steroid, bGTH는 여포의 선택, 폐쇄를 구분하는 지표로 사용가능하며, 여포가 폐쇄될때 여포액내 B/I ratio가 현저히 낮아지는 것으로 보아 GTH의 활성이 감소되는 것으로 판단된다.

Effect of 19-Norandrostenedione on the Spermatogenesis in Rat Testis

윤용달,전은현,양현원,김종민,Yoon, Yong-Dal,Chun, Eun-Hyun,Yang, Hyun-Won,Kim, Jong-Min The Korean Society for Reproductive Medicine 1990 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.17 No.1

19-nortestosterone(NORA)와 19-norandrostenedione(NT)는 정소내 aromatization과정중 중간 대사물로 검출된다. 본 연구는 이들을 장기간 투여하여 정소 및 부속기관의 무게, 혈청내 testosterone(T)의 농도, 정자형성에 미치는 영향을 조사하였다. NORA, NT 및 TE를 $300/50{\mu}l$농도로 주당 3회씩 12주간 정소에 직접 주사(intratesticular injection, i.t.)하였다. 또한 GnRH antagonist(RS68439)를 처리하여 혈청내 생식소자극호르몬 (GTH)을 감소시킨후 위 호르몬들을 동일방법으로 처리하여 이들의 보상작용을 조사하였다. NORA는 정소무게를 감소시키지 않았으나 GnRH antagonist를 처리하여 감소된 정소무게를 현저하게 보상하였다(P<0.05). NORA, NT, TE는 모두 부속기관의 무게를 증가시켰으며, RS68439가 감소시킨 부속기관의 무게를 현저히 증가시켰다. 그러나 이들은 부정소(epididymis)에는 영향을 주지않았으며 RS68439처리군에서는 보상작용을 나타내었다. 이들의 처리로 혈청내 LH농도는 완전히 감소하였으나 FSH의 농도에는 영향을 나타내지 않았다. 그리고 혈청내 T의 농도를 증가시켰다. NORA는 정자형성과정중 7단계의 spermatid의 수를 현저히 감소시켰다. 위 결과로 보아 NORA는 GnRH antagonist로 FSH의 분비가 억제된 쥐의 FSH분비를 촉진하며, T의 농도를 증가시켜 정자형성과정을 억제하는 것으로 추론된다.

Change of Steroid Receptor Number of and Bioactivity of Gonadotropins in the Follicular Fluid of Porcine Ovarian Atretic Follicles(II):Testosterone Receptor

윤용달,이창주,전은현,김문규,이준영,Yoon, Yong-Dal,Lee, Chang-Joo,Chun, Eun-Hyun,Kim, Moon-Kyoo,Lee, Joon-Yeong The Korean Society for Reproductive Medicine 1989 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.16 No.1

Estradiol (E)은 난소내 과립세포 (granulosa cell, GC)를 증가시키고 생식소 자극호르몬과 협동으로 배란을 유도한다. Androgen은 E의 작용과 반대의 작용을 나타내며 여포의 폐쇄요인으로 알려지고 있다. Testosterone(T)이 폐쇄여포의 여포액내 다량 존재하는 것이 알려짐에 따라 난소내에도 자가조절분비(autocrine)또는 paracrine regulation에 의해 작용을 나타낼 것으로 가정되어 난소내 여포가 폐쇄됨에 따라 그 수용체의 변화하는 양상을 조사하고져 하였다. 흰쥐의 과립세포의 세포질에는 $51.3{\pm}6.1$fmol/mg protein의 Estradiol 수용체(ER) ; $153.1{\pm}25.3$의 Testosterone수용체(TR) ; 또한 $35.1{\pm}8.1$의 Progesterone수용체(PR)가 존재하였다. 과립세포내 ER용 세포질내 E를 제거한 후에 정량이 가능하였고 또한 과립세포내에도 TR이 사람에서는 $23.4{\pm}7.2$ fmol/mg protein, 돼지는 $98.5{\pm}23.1$로 상당량 존재함을 관찰하였다. Dihydrotestosterone Enanthate(DHTE)를 100ug/흰쥐의 농도로 처리한 결과 난소내 TR의 농도는 변화가 없이 ER의 농도만 현저히 저하되고 쥐의 난소무게 역시 감소하는 것을 발견하였다. 위의 결과로 보아 난소내에도 스테로이드 호르몬은 autocrine(자가조절)방법으로 작용하며 An-drogen이 난소의 무게를 감소시키는 것은 ER의 수를 감소시켜 E의 작용이 억제되고 여포들이 폐쇄를 일으켜 그 증식이 저하된 때문으로 사료된다.

The Hormonal Levels of the Short Luteal Phase in Korean Women(II);Change of Serum Prolactin

윤용달,이준영,Yoon, Yong-Dal,Lee, Joon-Yeong The Korean Society for Reproductive Medicine 1984 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.11 No.2

본 연구는 황체기 단축현상(Short luteal phase, SLP) 을 가진 한국여성의 월경주기내 Prolactin 호르몬의 농도변화를 정상월경주기 (Normal luteal phase, NLP)와 비교하고져 하였다. 한편, Circadian rhythm 내 PRL 농도의 변화를 비교하고 임신기간중 PRL의 농도변화를 방사면역측정법(RIA) 으로 조사하였다. SLP여성의 PRL 농도는 후기의 여포성숙기(Late follicular phase) 및 초기황체형성기(Early IuteaI phase) 정상에 비하여 현저히 낮았다. 정상 월경주기에서는 PRL/Progesterone(mU/1/mg/ml)의 비율이 후기 여포성숙기까지 증가한 후 LH Peak day 이후 감소하는데 반하여 SLP여성의 비율은 조기 여포성숙기부터 계속적인 감소현상을 보였다. 또한 취침전 (04:00시) PRL의 농도는 SLP여성에게는 현저히 낮았다. 임신주기중 PRL의 농도는 4개월째 1,077mU/l 에서부터 9개월째 4,462mU/l까지 점진적인 증가를 하였다. 위의 결과로 보아 황체기단축현상은 PRL의 분비이상이 하나의 주요요인이 될 수 있으며, 특히 PRL/Progesterone의 농도비율이 SLP의 판정에 한 지표가 될 수 있을 것으로 사료된다.

냉동절편을 이용한 돼지 자궁내 에스트로겐 수용체의 측정

윤용달,박철홍,이영근,Yoon, Yong-Dal,Park, Chor-Hong,Lee, Young-Keun 대한생식의학회 1989 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.16 No.2

The present study was designed to develop a new method for the determination of estrogen receptor in porcine uterus using frozen sections. Cryostat sections were incubated with $^3H$-estradiol($^3H$-$E_2$) in the presence or absence of diethylstilbestrol(DES) and the radioactivity of 3H-E2 bound to estrogen receptor(ER) was detected. The level of specific estrogen receptor was determined by Scatchard analysis. The highest ratio of specific binding against total binding was achieved in 3 sec. tions(5mm x 5mm) which was corresponded to lOO${\mu}$/ml protein concentration. Optimal binding was obtained during incubation with $^3H$-$E_2$ for 30 minutes at 23$^{\circ}C$ after treatment of sections with acetone for 20 seconds. Three time-washing of sections was proved to be appropriate for the removal of unbound 3H-E2. 200-fold molar excess of DES was substituted for the binding of $^3H$-$E_2$ to ER sufficiently(binding efficiency of 54.8%). ER was saturated with 4nM of $^3H$-$E_2$ and its dissociation constant was 0.1nM. ER assay using frozen sections(Histological radioreceptor assay, HRRA) was significantly correlated with radioreceptor assay for estradiol(RRA, 0.976 , p<O.05). The present method has been proved a simple and reliable method for the preparation of small tissue samples, particularly for the specialized part of tissue, and for researches on reproductive physiology and pathology.

Ketamine과 Pentobarbitone이 생쥐 난자의 퇴화 및 과립세포의 자연세포사에 미치는 영향

김종훈,윤용달,Kim, Jong-Hoon,Yoon, Yong-Dal 대한생식의학회 1998 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.25 No.2

In mammal, lots of follicles start simultaneously their growth but only a few oocytes are ovulated in every sexual cycles. Most of matured and grown oocytes are destined to degenerate by atresia. However, the molecular and physiological mechanisms are not elucidated yet. The present study was designed to establish an induction method of follicular atresia with ketamine or pentobarbitone and evaluate the effect of these anesthetics on oocyte maturation and granulosa cell apoptosis of the mouse ovarian follicle. The percentages of degenerated oocyte and apoptotic granulosa cell in ketamine treated groups were significantly higher than that in controls (58.9% vs 33.5%, p<0.01, degeneration; 44.9% vs 26.6%, p<0.01, apotosis). Futhermore, it was revealed that the concentrations of progesterone in both groups were markedly higher than that in control. In cunclusion, it is considered that ketamine induce an atresia as pentobarbitone, and may be useful for inducing follicular atresia.

돼지 난소내 과립세포의 염색질이상응축과 여포액내 스테로이드호르몬의 농도 변화와의 상관관계

이창주,윤용달,김종흡,김문규,Lee, Chang-Joo,Yoon, Yong-Dal,Kim, Jong-Heup,Kim, Moon-Kyoo 대한생식의학회 1989 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.16 No.1

In order to study the follicular atretic mechanism in mammalian ovary, the relationship between pyknotic index (PI) of granulosa cells and the steroid concentrations in the follicular fluid of atretic follicle was investigated. Follicles were isolated from porcine ovary according to their sizes and the reproductive phases. Steroid concentrations were quantified by high-performance liquid chromatography. As PI increased, the concentration of progesterone was significantly increased(p<0.05), whereas testosterone and estradiol showed no significant changes in their concentration. As follicular size was increased, PI of follicular GC in the luteal phase was increased significantly(p<0.05) and the molar ratio of progesterone to testosterone was increased in the follicles of follicular phase. It can be concluded that progesterone accumulated in the follicular fluid as atresia of the follicles was progressed, and that PI of granulosa cells could be used as one of convenient and pratical criteria for the identification of follicular atresia.