LC-MS/MS를 이용한 Mecoprop 잔류분석법 확립

이정학 ( Junghak Lee ),이종화 ( Jonghwa Lee ),김은혜 ( Eunhye Kim ),신용호 ( Yongho Shin ),이지호 ( Jiho Lee ),정민우 ( Min Woo Jung ),백수진 ( Sujin Baek ),김정한 ( Jeong-han Kim ) 한국환경농학회 2016 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2016 No.-

Mecoprop (MCPP)는 phenoxycarboxylic acid계 제초제로서 광엽잡초 방제에 쓰이는 농약이다. 본 연구에서는 LC-MS/MS를 이용하여 현미, 대두, 고추, 감귤, 감자에서의 mecoprop에 대한 잔류 분석법을 확립 하고자 하였다. 기기분석은 Shimadzu LC-MS 8040과 Kinetex C18 (2.1 × 100 mm, 2.6 μm)를 이용하였고, 이온화를 위하여 Electrospray Ionization negative mode에서 수행하였다. 확립된 전처리법으로 20 g의 분쇄된 시료에 이온억압을 위하여 1% 초산이 함유된 acetonitrile 100 mL로 10분간 추출하였다. salting-out을 위해 15 g의 NaCl를 첨가하여 10 분간 원심분리(3,000 rpm)하고, 상층액(유기용매 층) 20 mL를 감압농축 후 Ion-exchange Solid Phase Extraction (SPE, HLB)를 통해 정제하였다. 최종 잔류물을 질소 농축하여 1 mL의 methanol로 정용하고 matrix effect를 보정하기 위해 matrix matched calibration (1:1 희석)을 이용하여 확인하였다. 분석정량한계(MLOQ)는 5 ng/mL였고, 확립된 분석법의 검증을 위하여 무처리 시료에 각 표준용액을 1, 10, 50배의 3수준 3반복으로 처리하여 회수율을 산출하였다. 그 결과, 현미에서는 MLOQ, 10 MLOQ, 50 MLOQ에서 각각 107.9% ± 3.0, 79.1% ± 4.5, 95.9% ± 4.9였고, 대두에서 74.3% ± 6.3, 86.3 ± 3.3, 103.9% ± 2.3, 고추에서는 86.8% ± 5.8, 95.5% ± 3.2, 99.0% ± 6.4, 감귤은 85.2% ± 7.3, 87.1% ± 6.8, 103.7% ± 5.3, 감자는 85.1% ± 2.1, 102.8% ± 2.6, 94.1% ± 3.7 의 회수율을 확인하였다. 본 연구에서 확립한 방법은 농산물 중 mecoprop의 잔류분석으로 활용이 가능한 시험방법으로 판단된다.

GC-MS/MS를 활용한 대표 지방성 시료 대두 중 농약 90성분 동시 분석법 확립

신용호 ( Yongho Shin ),이종화 ( Jonghwa Lee ),이지호 ( Jiho Lee ),이정학 ( Junghak Lee ),김병준 ( Byung Joon Kim ),정민우 ( Min Woo Jung ),백수진 ( Sujin Baek ),김정한 ( Jeong-han Kim ) 한국환경농학회 2017 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2017 No.-

유지 농산물 분석을 위한 탈지과정 추가 개발 및 검정을 위해 대표 지방성 시료인 대두에서 농약 90성분에 대한 동시 분석법을 GC-MS/MS를 활용하여 확립하였다. GC-MS/MS의 MRM (multiple reaction monitoring) 조건의 확립을 위하여 성분 당 1-3개의 precursor ion을 선정하였고, 각각을 CID (collision-induced dissociation)를 활용한 product ion scan 분석을 통해 감도 및 선택성이 높은 product ion을 2개 선정하여 정량이온(quantifer ion) 및 정성이온(qualifier ion)으로 각각 결정하였다. 시료의 전처리를 위해서 탈지과정이 포함된 식품공전 다종농약 다성분분석법-제2법을 활용하였으며, 시료 및 추출용매의 양을 줄여 전처리 시간 및 비용을 감소시켰다. 마쇄한 대두 10 g에 물 6 mL 를 가하여 30분 동안 습윤화한 후 acetoniltrile 20 mL를 가하여 1,200 rpm에서 2분 간 진탕추출하였다. 감압여과 후 여액에 NaCl 15 g을 넣고 1,200 rpm에서 2분 간 진탕한 후 3,500 rpm에서 5분 간 원심분리하였다. 상등액 10 mL를 취하여 40 ℃에서 감압농축한 후, acetonitrile로 포화된 hexane 30 mL에 재 용해한 다음 hexane으로 포화된 acetonitrile 30 mL로 2회 분배하여 유지를 제거하였다. Acetonitrile 층을 취하여 감압농축하고 Florisil SPE를 사용하여 정제하여 기기분석을 위한 시료로 사용하였다. MLOQ 확인 및 검량선 작성을 위해 0.002 mg L^-1에서 0.2 mg L^-1까지 matrix matched calibration법을 사용하였다. 전체 90성분 중 89성분(98.9%)에 대해 MLOQ ≤0.01 mg/kg이었으며, 감도가 불량한 chlorothalonil 1성분에 대해 MLOQ=0.02 mg/kg로 설정하였다. 검량선의 상관계수(r²) 는 88성분(97.8%)에 대해 r² ≥0.99이었으며, captan 및 chlorothalonil 두 성분에 대해 r²가 0.98-0.99 이었다. 0.01 및 0.05 mg kg^-1 수준에서 회수율 실험 결과 회수율 70-120% (CV ≤20)를 만족하는 농약은 두 수준에서 각각 70성분(77.8%)를 만족하였다. Matrix effect의 전체 평균은 8.6%로 matrix에 의한 감도가 전체적으로 enhancement되는 경향이 있었으며 matrix effect가 ±20% 이내인 성분 은 전체의 74.4% (67성분)이었다. 확립된 전처리법 및 분석기기조건을 바탕으로 대두를 비롯한 지방 성 시료에 대한 농약 잔류 모니터링을 충분히 수행할 수 있을 것으로 사료된다.

GC-MS/MS 및 Florisil Solid-Phase Extraction을 활용한 고추 중 농약 180성분 동시 분석법 확립

신용호 ( Yongho Shin ),이종화 ( Jonghwa Lee ),이정학 ( Junghak Lee ),김병준 ( Byung Joon Kim ),김정한 ( Jeong-han Kim ) 한국환경농학회 2018 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2018 No.-

고추는 색소와 엽록소가 풍부한 작물로, 잔류 농약 분석 시 이들의 효율적인 제거가 필수적이다. 본 실험에서는 florisil solid-phase extraction을 활용하여 고추에서 농약 180성분에 대한 동시 분석법을 GC-MS/MS를 활용하여 확립하였다. GC-MS/MS의 scheduled multiple reaction monitoring(MRM) 조건의 확립을 위하여 성분 당 1-2개의 fragment ion 또는 molecular ion을 precursor ion으로 선정하였다. 각각의 precursor ion을 collision-induced dissociation (CID)을 활용한 production scan 분석을 통해 감도 및 선택성이 높은 product ion을 2개 선정하여 정량이온(quantifer ion)및 정성이온(qualifier ion)으로 각각 결정하였다. 분석법상 정량한계 (MLOQ) 및 검량선의 직선성을 확인하기 위해 혼합표준용액을 단계적으로 희석하고 농약 무처리 고추 전처리 용액과 섞어 matrix-matched standard (1:4, v/v)를 제조하여 이를 GC-MS/MS에 주입하였다. 농약 180성분 전체에서 MLOQ는 0.01 mg/kg 미만을 만족하였다. 검량선의 직선성은 0.002-0.2 mg/L 범위에서 상관계수(r2)를 통해 확인하였으며 대부분의 농약이 r2 >0.990을 만족하였다. 회수율 실험을 위해 무처리 고추 시료에 0.01 및 0.05 mg/kg이 되도록 혼합표준용액을 처리한 후 전처리하였다. 시료 전처리 방법은 식품공전의 다종농약다성분 분석법-제2법을 활용하였으며, 시료량 및 추출용매의 양을 각각 1/5씩 줄여 전처리 비용 및 시간을 감소시켰다. 드라이아이스를 넣어 마쇄한 고추 10 g에 acetoniltrile 20 mL를 가하여 1,200 rpm에서 2분 간 진탕추출하였다. 감압여과 후 여액에 sodium chloride 3 g을 넣고 1,200 rpm에서 2분 간 진탕한 후 3,500 rpm에서 5분 간 원심분리하였다. 상등액 8 mL를 취하여 40℃에서 감압농축한 후 acetone/hexane (20:80, v/v) 4 mL에 재용해하여 hexane 5 mL 및 acetone/hexane (20:80, v/v) 5 mL로 활성화된 florisil cartridge에 넣어 용출하였다. 이후 acetone/hexane (20:80, v/v) 5 mL를 추가로 가하여 용출한 후 모은 용액을 질소 기류하에 송기시켜 용매를 날리고 acetonitrile 2 mL로 재용해한 후 matrix-matching하여 GC-MS/MS로 분석하였다. 회수율 확인 결과, 180성분 모두 0.01 및 0.05 mg/kg 수준에서 회수율 70-120% 및 RSD ≤20%를 만족하였다. 확립된 전처리법 및 분석기기조건을 바탕으로 고추 시료에 대한 농약잔류 모니터링을 충분히 수행할 수 있을 것으로 사료된다.

GC-MS/MS를 이용한 대두 중 농약 다성분 동시 분석

신용호 ( Yongho Shin ),이종화 ( Jonghwa Lee ),이지호 ( Jiho Lee ),이정학 ( Junghak Lee ),정민우 ( Min Woo Jung ),백수진 ( Sujin Baek ),김은혜 ( Eunhye Kim ),김정한 ( Jeong-han Kim ) 한국환경농학회 2016 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2016 No.-

유지 농산물 분석을 위한 탈지과정 추가 개발 및 검정을 위해 대두의 MRL이 설정된 농약 중 GC-MS/MS 분석 성분 49종에 대해 다성분 동시 분석법을 확립하였다. GC-MS/MS 기기분석조건의 확립을 위하여 성분 당 2개의 적정 precursor ion을 선정하였고, product ion scan 분석을 통해 한 성분 당 2개의 SRM (selected reaction monitoring) 조건을 확립하여 분석의 신뢰성을 높였다. 시료의 전처리를 위해서 마쇄한 대두 50 g에 물 30 mL를 가하여 2시간 동안 습윤화한 후 acetoniltrile 100 mL를 가하여 고속진탕추출기를 이용하여 1,300 rpm에서 2분 동안 추출하였다. 추출액에 NaCl 15 g을 넣고 1,300 rpm에서 2분 간 진탕한 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상층액 20 mL를 취하여 40 ℃에서 감압농축한 후, acetonitrile 포화 hexane 30 mL으로 재용해한 다음 hexane 포화 acetonitrile 30 mL 로 2회 분배하여 유지를 제거하였다. Acetonitrile 층을 취하여 감압농축하고 Florisil SPE를 사용하여 정제하여 기기분석을 위한 시료로 사용하였다. 정량을 위한 검량선은 0.01 mg kg-1에서 0.025 mg kg-1까지 matrix matched calibration법을 사용하였으며, hexane으로 유지제거 과정을 실시한 시료의 경우 captan과 chlorfluazuron을 제외한 모든 성분에서 검량선 상관계수(R2)는 0.99 이상이었고, 유지제거 과정을 거치지 않은 시료의 경우 captan 등 5성분을 제외한 모든 성분에서 R2 0.99 이상이었다. 정량한계는 모든 성분에서 0.01 mg kg-1이었다. 0.01 및 0.05 mg kg-1 수준에서 회수율 실험 결과, 전체 49성분 중 회수율 70-120% (CV 20 이하)를 만족하는 성분은 유지제거 과정을 거친 시료에서 전체의 77.6% 및 73.5%를 만족하였으며, 유지제거 과정을 거치지 않은 시료는 전체의 85.7%, 91.8%를 만족하였다. 이것으로 전 처리과정 중 acetonitrile/hexane 분배를 통한 유지제거 과정을 거치지 않더라도 대부분의 농약의 회수율이 양호함을 확인하였다.

GC-ECD/NPD를 이용한 축산물 중 잔류농약 동시 다성분 기기분석조건 확립

이지호 ( Jiho Lee ),이종화 ( Jonghwa Lee ),최훈 ( Hoon Choi ),신용호,이정학 ( Junghak Lee ),정민우 ( Min Woo Jung ),백수진 ( Sujin Baek ),김정한 ( Jeong-han Kim ) 한국환경농학회 2016 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2016 No.-

본 연구에서는 GC를 이용하여 현행 식품공전의 축산물 잔류농약시험법 대상 농약 대부분을 통합 분석할 수 있는 새로운 신속 다종농약 다성분 분석체계를 개발하여 축산물 잔류농약 분석기술의 선진화, 간편화 및 체계화에 그 목적이 있다. 축산물에 잔류허용기준이 설정된 농약 92 성분 중 물리화학적 특성과 기술적 검토를 통하여 GC로 분석이 가능한 75 성분에 대하여 GC-ECD/NPD 분석을 수행하였다. 분석기기 조건은 식품공전 상 다종농약 다성분 분석법 4.1.2.2법을 기반으로 이를 변형하여 확립하였다. 개별 성분들의 ECD 및 NPD 분석을 통해, 75 성분 중, ECD 검출가능 성분 41종, NPD 검출가능 성분 24종, 검출이 불가능한 성분 10종을 확인하였고, 각 성분들의 머무름 시간(Retention time)을 확인하였으며, 컬럼오븐조건의 변화를 통하여 ECD 2 그룹(21 성분, 20 성분), NPD 2 그룹(13 성분, 11 성분)으로 그룹화하였다. 그룹화 완료 후, 각 그룹별로 혼합용액을 조제하고 기기상 검출한계(Limit of detection)를 확인하기 위해 이들을 단계적으로 희석하여 GC-ECD/NPD에 주입하여 크로마토그램상의 시그날 대 노이즈 비율(Signal to Noise rate)을 기준으로 검출한계를 설정하였다. 기기상 검출한계는 0.01 mg/kg 35종, 0.02 mg/kg 10종, 0.05 mg/kg 11종, 0.1 mg/kg 5종, 0.2 mg/kg 1종, 0.5 mg/kg 3종으로 설정하였다. 이를 토대로 각 농약의 잔류허용기준 (Maximum Residue Limits, MRL) 수준의 검출을 위하여 전처리법에서의 농축배수는 최소 2배 이상 필요함을 확인할 수 있었다. 본 연구결과에서 얻은 기기조건을 토대로 축산물시료(소, 돼지, 닭, 계란, 우유)에서의 잔류농약 분석을 위한 기기분석 조건으로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

GC-MS/MS를 활용한 소고기 및 우유 중 잔류농약 다성분 동시분석법 확립

한희주 ( Heeju Han ),이정학 ( Junghak Lee ),원수 ( Xiu Yuan ),박은영 ( Eunyoung Park ),주보은 ( Boeun Ju ),신용호 ( Yongho Shin ),김정한 ( Jeong-han Kim ) 한국환경농학회 2020 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2020 No.-

축산물에서 잔류농약이 검출되는 사례가 발생하면서 식품의 안전성에 대한 불안감이 확산되고 있고 농약허용물질 관리제도(PLS)의 도입이 확정되면서 신뢰할 수 있는 잔류농약 분석법의 필요성이 제고되고 있는 실정이다. 이에, 본 연구는 육류 중 국내 섭취량이 높으면서 포화지방성분이 많아 분석이 어려울 것으로 예상되는 소고기와 그 부산물인 우유를 대상으로 GC 분석이 가능한 농약의 신속 정확한 다성분 분석법을 확립해보고자 하였다. 해외 잔류허용기준 (maximum residue limit, MRLs) 이 존재하는 농약 중 QuEChERS로 전처리가 가능하고 GC-MS/MS로 분석이 가능한 성분을 선정하여 이번 연구를 진행하였다. GC-MS/MS는 Shimadzu GCMS-8050 를 사용하였고 분석 정량한계 (MLOQ, method limit of quantitation)는 0.01 mg/kg이었으며 검량 범위 3-50 ug/mL에서 검량선 상관계수(r2)는 r2>0.98이었다. 분석기기 상의 오차를 보정하기 위해 내부표준물질로 triphenylphosphate (TPP)를 사용하였고, 회수율을 계산하기 위하여 MLOQ, 10MLOQ, 50MLOQ 수준으로 표준용액을 처리하였다. 전처리 조건을 최적화하기 위하여 추출용매와 정제법을 다르게 하여 비교하였다. 추출용매는 0.1% formic acid를 첨가한 acetonitrile 용매와 이에 ethyl acetate를 첨가한 용매를 비교하였다. 작물에 비해서 지방이 많은 축산물의 특성을 고려하여 총 5종류의 정제법을 비교하였다 [dSPE 3종류(C18-dSPE, 2-SEP, Z-SEP plus)와 SPE 2종류(Prime HLB, Phree)]. 113가지 농약성분 중 회수율이 70~120%를 만족하는 성분들의 개수를 비교하였고, 결과적으로 추출용매의 경우, 소고기는 0.1% formic acid와 50% ethyl acetate를 첨가한 acetonitrile 용매가, 우유는 0.1% formic acid를 첨가한 acetonitrile 용매가 효과적으로 확인되었다. 정제의 경우, Z-SEP을 이용하여 정제하는 조건에서 안정적인 경향성을 보이고 있어 동시분석에 용이할 것으로 판단되었다. 본 연구는 해당 농약들을 소고기와 우유에서 동시 정량분석이 가능해서 소고기와 우유에 대한 해당 잔류농약 검사 및 MRLs을 설정하는 데 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

LC-MS/MS를 이용한 축산물 중 농약 분석법 검증 및 기기분석법 확립

김병준 ( Byung Joon Kim ),이종화 ( Jonghwa Lee ),신용호,이정학 ( Junghak Lee ),고락도 ( Rockdo Go ),김정한 ( Jeong-han Kim ) 한국환경농학회 2018 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2018 No.-

2017년 축산물에서의 살충제 사용관련에 대한 보도로 인해 농약사용관리에 대한 관심이 매우 높아졌다. 이에 대하여 살충제 사용에 대한 안전성을 확보하고자 축산물 5종(소, 돼지, 닭, 우유, 알)에 대한 nereistoxin, spinosad에 대한 분석법 검증과 농약 18성분에 대한 동시 다성분 기기분석법개발을 LC-MS/MS를 사용하여 수행하였다. Nereistoxin은 축산물 5종에서 3수준 5반복으로 분석법 검증을 수행하였고 spinosad(spinosyn A, spinosyn D)는 소고기, 돼지고기, 우유는 4수준 5반복, 닭지방은 2수준 5반복, 알은 3수준 5반복으로 진행하였다. Nereistoxin, spinosad는 축산물 5종 모든 수준에서 회수율 70-120%, 변이계수 20%이하를 만족하는 결과를 나타내었다. 18종 농약에 대해 LC-MS/MS를 사용하여 축산물 5종에 대한 분석법 개발을 진행하였다. 사용한 기기는 Shimadzu UPLC LC-MS/MS 8060이고 컬럼은 Kinetex 2.6u C18, 100 x 2.10 mm을 사용하였다. 이동상은 water+0.1% formic acid+5mM ammonium formate와 MeOH+0.1% formic acid+5mM ammonium formate를 사용하였다. MRM(multiple reaction monitoring) 조건 확립을 하고자 scan을 통해 precursor ion 설정하였다. 확립된 precursor ion을 바탕으로 optimization을 통해 product ion scan을 진행하여 quantifier ion과 qualifier ion을 확립하였다. 확립된 MRM조건으로 기기상의 LOQ(limit of quantitation)과 직선성을 확인하였다. 대다수의 농약성분에서 1 ㎍/L의 LOQ를 나타내었고 0.99 이상의 직선성을 보였다.