선박평형수 처리 시스템 효율 검증을 위한 해양 플랑크톤 생사판별시 Neutral red 염색법 적용 가능성 연구

현봉길,신경순,정한식,최서열,장민철,이우진,최근형,Hyun, Bonggil,Shin, Kyoungsoon,Chung, Hansik,Choi, Seo-Yeol,Jang, Min-Chul,Lee, Woo-Jin,Choi, Keun-Hyung 한국해양학회 2014 바다 Vol.19 No.4

선박평형수를 통한 외래종 확산을 방지하기 위해 국제해사기구(IMO)에서는 2004년 선박평형수관리협약을 채택하였다. 이 협약에 따르면 앞으로 대부분의 선박들은 선박평형수 처리시스템을 통해서 해양 생물을 사멸 또는 제거시킨 후 배출해야 하며, 이는 플랑크톤의 생사판별방법을 통하여 이루어진다. 본 연구에서는 국제적으로 선박평형수 처리후 생사판별법으로 널리 사용되고 있는 fluorescein diacetate assay (FDA) 염색방법의 제한성과 이의 대안으로 Neutral red (NR) 염색방법사용 가능성을 살펴보고자 하였다. FDA 염색법은 대부분의 플랑크톤 염색에 되어서 현재 가장 널리 사용되는 방법임에도 불구하고 본 연구에서는 Ditylum brightwellii 을 제외한 모든 식물플랑크톤 대해서 낮은 염색 효율(전체 평균 염색 효율 <50%)을 보였으며, 식물플랑크톤이 갖는 고유한 형광(적색)에 간섭을 많이 받는 것으로 나타났다. 또한 FDA는 형광파장에 노출된 후 빠르게 색이 바래지는 경향도 관찰되었다. 반면에 NR은 조사된 모든 동 식물플랑크톤 개체수에 대해서 90% 이상의 높은 염색 효율을 보였다. 두 염색법 모두 포르말린을 이용해서 사멸시킨 동 식물플랑크톤에 대해서는 염색이 되지 않았다. 본 연구결과를 통해서 NR 염색법을 이용한 동 식물플랑크톤 생사판별은 매우 효율적이라고 판단된다. In order to prevent the spread of non-indigenous aquatic species through the ballast water in commercial ships, International Maritime Organization (IMO) adopted in 2004 the International Convention for Control and Management of Ship's Ballast Water and Sediments. The Convention mandates treatment of ballast water for most transoceanic voyages and its confirmation of treatment is made with plankton live/dead assay. Fluorescein diacetate assay (FDA), which produces bright green light for live phytoplankton, has been a de facto standard method to determine the survival of marine plankton, but its staining efficacy has been in dispute. In the present study, we examined the limitation of FDA, and compared its efficacy with Neutral red (NR) staining, another promising assay and widely used especially for zooplankton mortality. For all phytoplankton species studied in the present study, except Ditylum brightwellii, the staining efficiency was <50% with FDA. The green FDA fluorescence interfered with phytoplankton autofluorescence in most samples. In contrast, NR assay stained over 90% of both phytoplankton and zooplankton species tested in this study. FDA assay also showed that green FDA fluorescence rapidly faded when phytoplankton cells were exposed to microscope light. Both FDA and NR assay were negative on formalin-killed individuals of both phytoplankton and zooplankton species. Our results suggest that NR assay is more effective for determining the survival of marine plankton and can be applied to test the efficacy of ballast water treatment.

선박평형수 처리장치 효율 검증을 위한 해양미소부유생물 생사판별기법

백승호(Baek, Seung-Ho),신경순(Shin, Kyoungsoon) 한국산학기술학회 2015 한국산학기술학회논문지 Vol.16 No.6

본 연구는 선박평형수처리장치 성능을 평가하기 위한 일환으로 Evan blue, Aniline blue 그리고 CMFDA 염색방법을 활용하여 해양부유생물의 생사판별을 이해하고자 하였다. Evans blue와 Aniline blue의 염색은 죽은 생물을 파란색으로 염색 하여 죽은 생물을 평가하는 방법이고, CMFDA의 방법은 살아있는 생물을 녹색으로 염색하여 평가한다. 현장 동·식물플랑크 톤 군집을 대상으로 Evans blue와 Aniline blue의 방법을 적용한 결과, 죽은 생물을 90%이상 염색시키는 것으로 나타났다. 하지만, 살아있는 일부 식물플랑크톤의 군집에서도 파란색으로 염색 되어, 실제 선박평형수 처리장장치의 성능을 평가하기에 는 일정의 한계성을 나타내었다. 한편, 살아있는 생물을 염색하는CMFDA방법을 적용한 결과, 현장의 부유생물의 70%의 염 색효과를 보였다. CMFDA방법은 FDA방법과 유사하게 살아있는 생물을 녹색으로 염색하여 생물 생사판별이 가능하게 함으 로, 두 가지 방법을 중복염색(double staining)하는 방법을 고안해 보다 높은 효율의 생사판별방법을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 두 가지의 염색시약을 중복으로 염색한 실험군에서 95%이상의 높은 효율을 보였고. 이는 단일 염색한 실험군보다 상대 적으로 높은 염색효율을 얻을 수 있었다. 따라서 CMFDA+ FDA를 중복염색한 평가법이 해양생물의 생사를 판별하는데 보다 높은 효율을 보였고, 선박평형수처리장치의 성능을 평가하는 방법으로 활용이 가능할 것으로 판단된다. We determined a method to determine marine planktonic organism viability using Evan’s blue, Aniline blue, and 5-choromethyfluorescein diacetate (CMFDA). The Evan’s blue and Aniline blue methods produced bright blue light for dead phytoplankton and zooplankton and were the best dyes to detect dead cells. The staining efficiency of Evan’s blue and Aniline blue were ≥ 90% of the original field sample. However, it was difficult to test the efficiency of a ship’s ballast water treatment system because detection of living cells. In contrast, the CMFDA method, which is based on measuring cell esterase activity using a fluorimetric stain, was the best dye to detect live cells of almost all phytoplankton species, and staining efficiency was 70%. The CMFDA method is similar to the fluorescein diacetate (FDA) staining method. Therefore, we estimated viability of phytoplankton species using a double-staining method by combining CMFDA and FDA to determine optimum staining efficiency. As a result, the frequency of dying cells based on the double-staining method was 95%, which was significantly higher than that of single CMDFA staining. Our results suggest that a CMDFA + FDA assay is more effective to determine survival of marine plankton and that this method was applicable to investigate the efficacy of a ship’s ballast water treatment system.

활성물질로 처리된 해수에서 시간과 수온에 따른 소독부산물 농도 변화

장풍국(Pung-Guk Jang),신경순(Kyoungsoon Shin),차형곤(Hyung-Gun Cha),이우진(Woo-Jin Lee),최태섭(Taesup Choi) 한국해양환경·에너지학회 2017 한국해양환경공학회 학술대회논문집 Vol.2017 No.10

우리나라 주요 국제항에 입항하는 중국 기원 선박의 평형수내 수질 및 식물플랑크톤 특성 연구

장풍국,현봉길,장민철,신경순,Jang, Pung-Guk,Hyun, Bonggil,Jang, Min-Chel,Shin, Kyoungsoon 해양환경안전학회 2016 해양환경안전학회지 Vol.22 No.7

본 연구는 우리나라 주요 국제항에 출입하는 중국기원 선박의 선박평형수내 환경 및 부유생물의 특성을 파악하여 선박평형수 처리장치(BWTS)와 관련된 면제 협상을 위한 기초자료를 확보하고자 하였다. 조사된 37척의 선박 중 평형수의 보관 기간은 발해만을 포함하는 북부지역(지역 "A")에서 평균 $3.91{\pm}4.61days$로 가장 짧았다. 총부유물질의 농도는 $1.80{\sim}266mg\;L^{-1}$의 범위를 보였고, 용존성 및 입자성 유기물질은 각각 $1.09{\sim}5.79mg\;L^{-1}$, $0.17{\sim}3.65mg\;L^{-1}$의 범위를 나타내었다. 영양염 농도는 양자강 유역을 포함한 지역 "B"에서 높았고, 홍콩을 포함하는 지역 "C"에서 낮은 평균값을 보였다. 엽록소-a 평균 농도는 $0.67{\pm}1.15{\mu}g\;L^{-1}$로 나타났고, $1{\mu}g\;L^{-1}$ 이상의 높은 값은 지리적으로 우리나라와 가까운 지역 "A"에서 7척 중 3척이 집중되었다. 식물플랑크톤의 개체수가 > $10,000cells\;L^{-1}$의 선박평형수는 37척 중 6척으로 나타났고, 이 중 3척이 지역 "A" 기원으로 파악되었다. 특히, 홍콩항에서는 유해미세조류로 잘 알려진 와편모그룹의 종이 높은 밀도로 관찰되었다. 본 연구 결과, 중국과의 BWTS 면제권 협상은 신중하게 접근할 필요성이 있다고 판단된다. The water quality and phytoplankton presence in the ballast water (BW) of 37 vessels originating from the international ports of China were investigated to facilitate negotiations for exemptions to the Ballast Water Management Convention (BWM Convention). The shortest duration given BW spent in a vessel was $3.91{\pm}4.61days$ in area "A", which included the Bohai Sea. Total suspended solids, dissolved organic carbon, and particulate organic carbon ranged from 1.80 to $266mg\;L^{-1}$, from 1.09 to $5.79mg\;L^{-1}$, and from 0.17 to $3.65mg\;L^{-1}$, respectively. A low average concentration of nutrients was measured in BW from area "C", but the concentration of nutrients in BW from area "B" (around the Changjiang estuary) was high, which may be related to the relevant supply of freshwater. A high chlorophyll-a concentration (> $1{\mu}g\;L^{-1}$) was measured in six vessels, three of which carried BW in the area "A". High abundance of phytoplankton (> $10,000cells\;L^{-1}$) was measured in four vessels, two of which carried BW in the area "C". Vessel No. 37, originating from Hong Kong Bay in area "C", showed a high density of dinoflagellates. The results suggest that BWM Convention exemption negotiations with China should be performed cautiously.

USCG Phase II 선박평형수 성능 평가를 위한 해양 식물플랑크톤군집 대량 확보 및 생물사멸시험

현봉길,백승호,이우진,신경순,Hyun, Bonggil,Baek, Seung Ho,Lee, Woo Jin,Shin, Kyoungsoon 해양환경안전학회 2016 해양환경안전학회지 Vol.22 No.5

The type approval test for USCG Phase II must be satisfied such that living natural biota occupy more than 75 % of whole biota in a test tank. Thus, we harvested a community of natural organisms using a net at Masan Bay (eutrophic) and Jangmok Bay (mesotrophic) during winter season to meet this guideline. Furthermore, cell viability was measured to determine the mortality rate. Based on the organism concentration volume (1 ton) at Masan and Jangmok Bay, abundance of ${\geq}10$ and $<50{\mu}m$ sized organisms was observed to be $4.7{\times}10^4cells\;mL^{-1}$and $0.8{\times}10^4cells\;mL^{-1}$, and their survival rates were 90.4 % and 88.0 %, respectively. In particular, chain-forming small diatoms such as Skeletonema costatum-like species were abundant at Jangmok Bay, while small flagellate ($<10{\mu}m$) and non chain-forming large dinoflagellates, such as Akashiwo sanguinea and Heterocapsa triquetra, were abundant at Masan Bay. Due to the size-difference of the dominant species, concentration efficiency was higher at Jangmok Bay than at Masan Bay. The mortality rate in samples treated by Ballast Water Treatment System (BWMS) (Day 0) was a little lower for samples from Jangmok Bay than from Masan Bay, with values of 90.4% and 93%, respectively. After 5 days, the mortality rates in control and treatment group were found to be 6.7% and >99%, respectively. Consequently, the phytoplankton concentration method alone did not easily satisfy the type approval standards of USCG Phase II ($>1.0{\times}10^3cells\;mL^{-1}$ in 500-ton tank) during winter season, and alternative options such as mass culture and/or harvesting system using natural phytoplankton communities may be helpful in meeting USCG Phase II biological criteria.

선박평형수처리장치의 외국형식승인 선상시험결과를 정부형식승인 시험결과로 대체하기 위한 연구

장풍국(Pung-Guk Jang),신경순(Kyoungsoon Shin) 한국산학기술학회 2021 한국산학기술학회논문지 Vol.22 No.11

국제해사기구(IMO)는 선박평형수로 인한 외래생물의 침입을 방지하기 위해 2004년 선박평형수관리협약을 제정하여 정부형식승인을 받은 선박평형수처리장치(BWMS)로 선박평형수를 처리해 배출하도록 하였다. 우리나라는 IMO가 제시한 시험 방법으로 인증된 BWMS에 대해 형식승인증서를 발급하지만, 미국정부형식승인은 자체 시험방법으로 시험을 통과한 BWMS만 인증한다. 두 시험 방법 중 식물플랑크톤에 대한 채집 방법, 전처리 과정(농축과 비농축)과 검경 양에 차이가 있어 이에 대한 검토가 필요하다. 본 연구는 검증 단계를 3단계로 설정하여 미국형식승인 선상시험 결과 값을 정부형식승인 선상시험 결과 값으로 대체할 수 있는 과학적 접근 방법을 제시하고자 한다. 검증 1단계는 시료의 균질도 검증, 2단계는 분석 양에 대한 검경, 3단계는 시료 농축에 대한 식물플랑크톤 손실/손상 정도를 반영하는 단계이다. 실제 미국형식승인 선상시험을 수행한 8척의 선박에서 각 5회씩 수행된 결과 값을 검증한 결과 한번의 선상시험을 제외하고 모두 정부형식승인 선상시험 결과 값으로 대체할 수 있었다. 또한 선상시험을 통해 농축/비농축 시료를 비교한 결과, 두 방법 간에 통계적 유의한 차이가 없었다. 따라서 본 연구에서 제시한 검증 단계로 미국형식승인 선상시험 결과 값을 검증하면 정부형식승인 선상시험 결과 값으로 대체 가능한지를 판단할 수 있는 방법으로 활용할 수 있을 것으로 판단된다. The International Maritime Organization (IMO) Convention on ballast water treatment systems (BWMSs) requires that ballast water be treated and discharged by BWMSs approved by the government. The Korean government issues a type approval (TA) for BWMSs tested with the guidelines (BWMS Code) of the IMO, but the US"s TA certifies only the BWMSs tested with its test method (the ETV protocol). This study aims to propose a methodology that can replace the result of the shipboard test (SB) of the ETV protocol with that of the BWMS Code by splitting the verification step into three steps as follows. The first step verifies the homogeneity of the sample, the second step verifies the amount of the analysis, and the third step reflects the degree of loss and damage of phytoplankton caused by concentrations using the net. The result of comparing the concentrated and non-concentrated samples through the actual SB showed no significant difference. In addition, when the SB result of the US"s TA was evaluated at the verification stage, it was determined to be replaced with that of the government"s TA. Therefore, the verification step in this study could determine whether the SB result of the US"s TA can be substituted with that of the government"s TA.

해양 플랑크톤 군집의 전기분해 염소소독 효과

강정훈(Jung-Hoon Kang),신경순(Kyoungsoon Shin),현봉길(Bong-Gil Hyun),장민철(Min-Chul Jang),김은찬(Eun-Chan Kim),장만(Man Chang) 한국해양환경·에너지학회 2007 한국해양환경·에너지학회지 Vol.10 No.3

인공생태계를 이용하여 연안환경에서 N/P ratio의 변화에 따른 식물플랑크톤의 군집변화 예측

김선주(Sun Ju Kim),신경순(Kyoungsoon Shin),장풍국(Pung Kuk Jang),이택견(Taek kyun Lee),강병희(Byung Hee Kang),장만(Man Chang) 한국해양환경·에너지학회 2002 한국해양환경공학회 학술대회논문집 Vol.2002 No.-

다시마 유래 항미세조류 물질 추출 및 알긴산 올리고 유도체의 막전위에 대한 영향

이건섭(Lee, Gun-Sup),장만(Chang, Man),신경순(Shin, Kyoungsoon),김동균(Kim, Dong-Giun),오정균(Auh, Chung-Kyoon),이택견(Lee, Taek-Kyun) 한국산학기술학회 2012 한국산학기술학회논문지 Vol.13 No.12

알긴산 올리고 유도체를 갈조류로부터 추출하였고, 추출물의 항미세조류 효과와 작용기작을 연구하였다. 고분자 알긴산을 2 N HCl과 1% H₂O₂.로 순차적 가수분해하여 알긴산 올리고 유도체를 제조하였다. 추출물의 항미세조류 활성은 반응시간에 비례하였으며 4시간에 가장 높았다. 알긴산 올리고 유도체를 Akashiwo sanguinea와 Cochlodinium polykrikoides 에 처리하였을 때, 세포의 움직임이 정지하였다. A. sanguinea 세포는 파쇄되었고, C. polykrikoides 세포에는 원형질 분리가 유도되었다. 알긴산 올리고 유도체의 작용기작을 연구하기 위하여, 세포내(pHi) 및 세포외 pH(pHe)의 변화를 0.05% 알긴산 올리고 유도체에 노출된 미세조류에서 측정하였다. pHi는 0.3 unit 감소하였고, pHe는 0.9 unit 증가하였다. 이러한 결과로부 터 알긴산 올리고 유도체에 의한 막전위의 변화가 미세조류의 세포사멸을 유도할 수 있을 것으로 추측된다. Oligo-alginate derivatives were extracted from brown algae and its antimicroalgal effects and reaction mechanism were investigated. Oligo-alginate derivatives were produced from sequential hydrolysis of high molecular weight alginate by treatment of 2 N HCl and 1% H₂O₂. Antimicroalgal activity of extracts was proportional to reaction time and activity was highest at 4 hrs. When oligo-alginate derivatives were treated to Akashiwo sanguinea and Cochlodinium polykrikoides, mobilities of cells were ceased. A. sanguinea cells were crushed and plasmolysis was induced in C. polykrikoides cells. To investigate the action mechanism of oligo-alginate derivatives, changes of intracellular (pHi) and extracellular pH (pHe) were determined in the microalgal cells exposed to 0.05% of oligo-alginate derivatives. pHi was decreased about 0.3 unit and pHe was increased about 0.9 unit. These results suggested that change of membrane potential by oligo-alginate derivatives could led to microalgal cell death.

삭시톡신 분석을 위한 항체의 제조 및 항-삭시톡신 항혈청의 민감도 분석

장만(Chang, Man),이건섭(Lee, Gun-Sup),모상현(Moh, Sang-Hyun),신경순(Shin, Kyoungsoon),오정균(Auh, Chung-Kyoon),이택견(Lee, Taek-Kyun) 한국산학기술학회 2012 한국산학기술학회논문지 Vol.13 No.12

해양미세조류 유래 독성물질에 대한 이해와 활용에 있어서 가장 중요하지만 간과되고 있는 부분은 독성물질 을 검출할 수 있는 빠르고, 쉽고 경제적인 검출기술을 개발하는 것이다. 이 논문에서 우리는 삭시톡신(STX)에 대한 항체를 생산하였다. 헤모시아닌(mariculture keyhole limpet hemocyanin, mcKLH)과 오브알부민(ovalbumin, OVA)을 운 반단백질로 사용하였다. 면역반응을 위해서 mcKLH-STX 결합체를 BALB/c 쥐에 복강주사하였다. 채혈 후 항-STX 항 혈청을 분리하였다. 항혈청의 역가분석을 위하여 유리 STX와 OVA-STX로 코팅된 microtiter plate를 이용하여 간접 ELISA 실시하였다. 발색반응을 위한 이차항체로는 goat anti-mouse IgG-phosphatase conjugate가 사용되었다. 항-STX 항혈청은 OVA-STX와 유리 STX에 특이적으로 반응하였다. 항-STX 항혈청의 민감도는 매우 높았으며, STX를 위한 검출한계는 약 64.9 ng/kg이었다. The most essential but missing components to understand and use toxic substances from marine microalgae are developing the fast, easy and economical determining technology for detecting it. In this paper we produced the antibodies against saxitoxin (STX). Mariculture keyhole limpet hemocyanin (mcKLH) and ovalbumin (OVA) were used as carrier proteins. mcKLH-STX conjugates were injected into the peritonial cavity of BALB/c mouse for immunization. After bleeding from mouse, anti-STX antiserum was isolated. Indirect enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) was performed to determine antiserum titer using the microtiter plate coated with free STX and OVA-STX. A goat anti-mouse IgG-phosphatase conjugate was used as secondary antibody to enable chromogenic reaction. Reactions of anti-STX antiserum were very specific on the OVA-STX and free STX. Sensitivity of anti-STX antiserum on STX was very high and STX detection limit was to be 64.9 ng/kg for indirect ELISA.