오미자 박, schizandrin 및 gomisin A에 의한 RAW264.7 세포주에서 lipopolysaccharide로 유도된 염증 반응의 억제

서유미(Yu-Mi Seo),김현지(Hyun-Ji Kim),이은주(Eun-Joo Lee),정정욱(Chungwook Chung),성화정(Hwa-Jung Sung),손호용(Ho-Yong Sohn),박종이(Jong-Yi Park),김종식(Jong-Sik Kim) 한국생명과학회 2018 생명과학회지 Vol.28 No.3

오미자는 전통적인 한약재로서 schizandrin과 gomisin A와 같은 다양한 생리활성물질을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 오미자 박의 에탄올 추출물(PSC)과 schizandrin (SZ) 및 gomisin A (GA)에 의한 항염증 활성 및 그들의 작용기전 연구를 수행하였다. 먼저, PSC는 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW264.7 세포에서 세포생존율에는 영향을 미치지 않고 농도의존적으로 nitric oxide (NO) 생성을 감소시켰다. PSC는 염증유발유전자인 iNOS와 COX-2의 발현을 감소시켰으나, TNF-α의 발현에는 영향을 주지 않았다. 또한 오미자 박의 에탄올 추출물은 p38, ERK1/2 및 JNK의 총 단백질의 발현에는 영향을 주지 않으면서, 그들의 인산화를 감소시켰다. 이러한 결과는 PSC가 MAPK 신호를 저해함으로써 염증 반응을 조절할 수 있음을 시사한다. 또한 SZ와 GA도 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW264.7 세포에서 세포 생존율에 영향을 미치지 않으면서 NO 생성을 감소시켰다. SZ은 iNOS 유전자의 발현만을 감소시킨 반면, GA는 iNOS와 COX-2 두 유전자의 발현을 모두 감소시켰다. 종합적으로 이러한 연구결과는 오미자 박 추출물, schizandrin 및 gomisin A에 의해 중재되는 항염증 활성 및 작용기전을 이해하는데 도움을 줄 것이다. Schizandra chinensis has been used as a traditional Chinese medicine and is known to have various bioactive components, including schizandrin and gomisin A. In the current study, we investigated the anti-inflammatory activities and their working mechanisms of ethanol extracts of pomace of Schizandra chinensis (PSC), schizandrin (SZ), and gomisin A (GA). First, we analyzed the effects of PSC on nitric oxide (NO) production and cell viabilities in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW264.7 cells. The results indicated that PSC dramatically reduced NO production in LPS-activated RAW264.7 cells in a dose-dependent manner without affecting cell viabilities. PSC also decreased the expression of pro-inflammatory genes iNOS and COX-2, whereas the expression of TNF-α was not affected by PSC. In addition, PSC inhibited phosphorylation of p38, ERK1/2, and JNK but did not change the expression of their total protein. The results indicate that PSC can regulate LPS-induced inflammatory responses by suppressing MAPK (mitogen-activated protein kinase) signaling. We also analyzed the effects of SZ and GA on NO production and cell viabilities in RAW264.7 cells. The results showed that SZ and GA also decreased NO production in a dose-dependent manner in LPS-activated RAW 264.7 cells without affecting cell viabilities. SZ reduced the expression of iNOS, whereas GA downregulated iNOS and COX-2. Overall, these findings clarify the molecular mechanisms of the anti-inflammatory effects mediated by SC, SZ, and GA.

2단계 BK21 사업의 개요와 특징

서유미,Seo, Yu-Mi 한국대학교육협의회 2006 大學敎育 Vol.139 No.-

'분야별 특성화된 대학원 학과 육성을 통한 국제경쟁력 있는 석·박사급 인력 양성'을 목표로 하는 2단계 BK21 사업이 지난 1월 4일 사업 공고와 함께 막을 열었다. 2단계 BK21 사업을 통해 우리 대학이 인재 양성의 핵심기지가 되기를 기대한다.

건조 상추 에탄올 추출물의 항염증 활성

이은주(Eun-Joo Lee),서유미(Yu-Mi Seo),김용현(Yong-Hyun Kim),정정욱(Chungwook Chung),성화정(Hwa-Jung Sung),손호용(Ho-Yong Sohn),박종이(Jong-Yi Park),김종식(Jong-Sik Kim) 한국생명과학회 2019 생명과학회지 Vol.29 No.3

상추는 가장 선호하는 녹색 채소 중 하나이다. 상추는 폴리페놀성 화합물을 비롯한 다양한 성분을 함유하고 있으며, 항균, 항산화, 항염증 등의 생리활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 건조상추의 에탄올 추출물(DLE)을 제조하고 이들의 항염증 활성을 연구하였다. DLE의 항염증 활성을 측정하기 위하여 LPS로 활성화된 마우스 대식세포 RAW 264.7 세포주에서 nitric oxide (NO) 생성을 측정하였다. DLE는 세포주의 생존에는 영향을 미치지 않으면서 NO 생산을 현저하게 저해하였다. DLE에 의해 염증 유전자인 iNOS와 COX-2의 유전자와 단백질의 발현이 모두 감소하였으며, 6개의 염증관련 cytokine 유전자(IL-1α, IL-1β, IL-1F6, TNF-α, CSF2, 그리고 CXCL10)의 발현이 모두 감소하였다. 또한, DLE의 처리는 MAPKs 경로의 인산화를 모두 저해하였으며, NF-κB p65의 핵으로의 이동을 저해하였다. 이러한 결과는 DLE의 항염증 활성은 MAPKs 경로와 NF-κB 경로를 조절함으로써 이루어짐을 시사한다. 또한, DLE는 농도의존적으로 reactive oxygen species (ROS)의 생산을 저해하였으며, hemeoxygenase-1 (HO-1) 단백질의 발현을 증가시켰으며, HO-1의 전사조절인자인 Nrf2의 핵으로의 이동을 증가시켰다. 결론적으로, 이러한 연구결과는 DLE가 염증관련 유전자의 발현을 감소시키며, MAPKs, NF-κB, 그리고 Nrf2/HO-1 등 다양한 경로를 조절함으로써 항염증 활성을 가지는 것을 제시한다. Lettuce (Lactuca sativa L.) is one of the most popular green leafy vegetables, and it contains various beneficial components including polyphenolic compounds and has been known to possess various biological functions such as anti-microbial, anti-oxidative, and anti-inflammatory activities. In the present study, we prepared ethanol extract of dried lettuce (DLE) and investigated its anti-inflammatory activity. To evaluate the anti-inflammatory activity of DLE, nitric oxide (NO) production was measured in LPS-activated mouse macrophage RAW 264.7 cells. DLE significantly suppressed NO production in these cells without affecting cell viabilities while resveratrol was used as a positive control. DLE dramatically decreased the expression of pro-inflammatory genes such as iNOS and COX-2 at the mRNA and protein levels and reduced the expression of several cytokines including IL-1α, IL-1β, IL-1F6, TNF-α, CSF2 and CXCL10. In addition, DLE suppressed phosphorylation of MAPKs and the nuclear translocation of NF-κB p65 indicating DLE shows its anti-inflammatory activity via regulating MAPKs pathway and NF-κB pathways. And also, DLE reduced the production of reactive oxygen species in a dose-dependent manner. DLE increased HO-1 protein expression, and also increased the nuclear translocation of Nrf2. Overall, our results suggest that lettuce down-regulate various pro-inflammatory genes and have its anti-inflammatory activity via regulating MAPKs, NF-κB, and Nrf2/HO-1 pathways.

LOP와 Petri Dish의 수분 보호능에 관한 비교 연구

이진성(Lee, Jin-Sung),서유미(Seo, Yu-Mi),강창열(Kang, Chang-Youl),정용대(Jeong, Young-Dae),이상수(Lee, Sang-Soo),오정균(Oh, Jung-Kyun) 한국산학기술학회 2008 한국산학기술학회 학술대회 Vol.- No.-

현재 가장 범용적으로 사용되는 미생물 배양 용기인 Petri Dish는 배지 제조 후 냉장과 실온 보관 시 수분 증발에 대한 보호 효과가 적어 세 달 이상 보관하기 어려운 단점이 있어 즉시 사용 배지 (pre-plated media) 개발에 장애가 되고 있다. 본 연구는 미생물 배지의 장기 저장이 가능하도록 고안된 LOP plate의 수분 보호능에 관한 것으로, LB 배지를 표준 배지로 해서 4, 25, 32 및 37℃ 네 개의 온도영역과 진공 포장 및 비 포장 조건에서 Petri Dish와 비교한 결과, 각 온도 조건별로 LOP의 탁월한 수분 보호능을 확인 할 수 있었다. 따라서 향후 LOP를 이용한 장기 저장과 즉시 사용이 가능한 pre-plated media와 관련된 제품 개발이 가능할 것으로 기대된다.

MYP 배지의 난황 농도에 따른 Bacillus cereus의 배양 특성

홍수영(Hong, Su-Young),서유미(Seo, Yu-Mi),강창열(Kang, Chang-Youl),이병우(Lee, Byung-Woo),권무식(Kwon, Moo-Sik),이진성(Lee, Jin-Sung) 한국산학기술학회 2009 한국산학기술학회 학술대회 Vol.- No.-

현재 Bacillus cereus의 정량 및 정성 분석을 위해서 MYP 배지가 주로 사용되고 있으나 식품공전과축산물의 가공기준 및 성분 규격 내에서 MYP의 주요 첨가물인 egg-yolk의 농도는 각각 2.5%와 5%로서로 상이하여 대상이 되는 시료의 유래에 따라 각기 다른 MYP 배지를 제조해야 하는 불편함이 있다. 따라서 본 연구는 MYP 배지에 1%에서 10%로 10개 구간으로 egg-yolk의 농도를 첨가하여 이에 따른 B.cereus의 정량적 특성, lecithinase 활성대의 크기 및 육안 확인이 가장 좋은 구간대에 대한 관능평가를 실시하였다. 결과적으로 정량적 특성과 lecithinase 활성대의 크기는 농도가 증가할수록 비례하지않음을 알 수 있었으며, lecithinase 활성대에 대한 관능평가는 2%의 egg yolk가 가장 확인이 용이한 것으로 평가되었다. 본 연구를 통해서 MYP에 첨가되는 egg-yolk의 최종 농도가 현재의 2.5%(식품), 5%(축산물)로 다르게 기준 되어 있는 것을 2% 또는 식품공전의 2.5%로 통합하여 개정하는 것이 가능하다고 판단되며 이러한 개정을 통하면 MYP 조성물 중 고가인 egg-yolk 제조 비용을 상당히 줄여 줄 것으로 기대된다.

Petri dish와 LOP의 보관조건에 따른 수분함량 비교 연구

홍수영(Hong, Su-Young),서유미(Seo, Yu-Mi),강창열(Kang, Chang-Youl),이병우(Lee, Byung-Woo),권무식(Kwon, Moo-Sik),이진성(Lee, Jin-Sung) 한국산학기술학회 2009 한국산학기술학회 학술대회 Vol.- No.-

현재 상용화되어 있는 petri dish는 미생물 배지의 보관기간이 4℃의 온도에서 15∼50일 정도 되기때문에 장기저장이 어렵다. 그래서 본 연구는 자체 고안된 LOP(Lab on a plate)와 petri dish에 고체배지를 제조하여 배지의 수분함량을 비교하기 위한 연구를 수행하였다. 본 연구에 사용한 배지는 Bacillus cereus 배양을 위한 MYP(Mannitol Egg Yolk Polymyxin) agar로 이용하여 제조하였으며 각각 진공포장및 비포장하여 4℃와 25℃의 온도조건에서 6주 동안 매주 수분함량을 측정한 결과, LOP와 petri dish 모두 비포장 조건보다 진공포장조건의 수분보호능이 우수 하였으며 진공포장조건에서는 25℃가 4℃보다 상대적 수분 보호능이 좋음을 확인할 수 있었다. 또한, 비포장조건에서도 LOP가 4℃와 25℃ 모두petri dish보다 수분보호능이 탁월하여 유통기간이 훨씬 더 연장될 수 있는 가능성을 보여 주어 앞으로LOP를 이용한 장기 보관과 즉시 사용이 가능한 pre-plated media와 관련된 다양한 제품의 용기로 사용가능할 것으로 기대된다.

오미자 박 추출물 및 schizandrin에 의한 암세포 항성장 및 세포사멸 활성

김현지(Hyun-Ji Kim),서유미(Yu-Mi Seo),이은주(Eun-Ju Lee),정정욱(Chungwook Chung),성화정(Hwa-Jung Sung),손호용(Ho-Yong Sohn),박종이(Jong-Yi Park),김종식(Jong-Sik Kim) 한국생명과학회 2018 생명과학회지 Vol.28 No.4

오미자는 다양한 인간 질환을 치료하기 위한 한약재로 사용되어 왔으며, schizandrin과 gomisin A와 같은 다양한 생리활성물질을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 오미자 박으로부터 에탄올 추출물(PSC)을 제조하고, 이들이 대장암 세포인 HCT116의 세포 생존율에 미치는 영향과 ATF3, NAG-1, p21와 같은 pro-apoptotic 유전자의 발현 변화에 미치는 영향을 연구하였다. 오미자 박 에탄올 추출물의 처리는 농도 의존적으로 암세포생존율을 감소시켰으며, 세 가지 pro-apoptotic 유전자의 발현을 모두 증가시켰다. 또한, 오미자 유래의 순수물질인 schizandrin도 세포 생존율을 농도의존적으로 감소시켰으며, ATF3, NAG-1, p21 유전자의 발현을 증가시켰다. 게다가, schizandrin을 처리한 세포에서 PARP cleavage를 확인함으로써 apoptosis가 일어남을 확인하였다. 이러한 PARP cleavage는 NAG-1 siRNA의 transfection에 의해서 회복됨을 확인하였다. 이러한 결과는 schizandrin에 의해 유도되는 apoptosis와 NAG-1의 발현증가가 직접적인 관련이 있음을 나타낸다. 종합적으로, 본 연구결과는 오미자 박 추출물과 schizandrin에 의해 매개되는 항암 활성과 암세포 사멸현상을 이해하는데 도움을 줄 것으로 사료된다. Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. (omija) is often used in Chinese medicine to treat various human diseases, and is known to possess various bioactive components such as schizandrin and gomisin A. In the present study, we prepared ethanol extracts of pomace of Schisandra chinensis (PSC) and investigated their effects on cell viability and expression changes of pro-apoptotic genes such as ATF3, NAG-1 and p21 in human colorectal cancer HCT116 cells. PSC significantly reduced cell viability in a dose-dependent manner, and also dramatically induced the expression of ATF3, NAG-1 and p21 genes, with resveratrol used as a positive control. We also assessed the effects of pure compound schizandrin (SZ) derived from Schisandra chinensis on cell viability and expression of pro-apoptotic genes such as ATF3, NAG-1 and p21. The results showed that SZ also decreased cell viabilities in a dose-dependent manner and increased the expression of ATF3, NAG-1 and p21 genes. In addition, apoptosis was detected in SZ-treated HCT116 cells, which was confirmed with PARP cleavage. PARP cleavage was recovered in part by the transfection of NAG-1 siRNA. The results indicate that NAG-1 is one of the genes responsible for apoptosis induced by SZ. Overall, our findings may contribute to understanding the molecular mechanisms of anti-proliferative and pro-apoptotic activities mediated by PSC and SZ.

지속성 균혈증 및 진균혈증-위험 인자 및 임상적 중요성

최원석 ( Won Suk Choi ),서유빈 ( Yu Bin Seo ),조유미 ( Yu Mi Jo ),김정연 ( Jeong Yeon Kim ),기세윤 ( Sae Yoon Kee ),정혜원 ( Hye Won Jeong ),박대원 ( Dae Won Park ),손장욱 ( Jang Wook Sohn ),정희진 ( Hee Jin Choeng ),김민자 ( Min 대한내과학회 2007 대한내과학회지 Vol.72 No.6

목적: 지속성 혈류 감염은 사망률과 재원 기간을 증가시킨다는 이전의 보고는 있으나, 이에 대한 국내외의 연구는 많지 않다. 이에 저자들은 지속성 균혈증과 진균혈증을 보인 환자들에 대해 위험 인자와 임상적 중요성에 대해 연구하였다. 방법: 환자-대조군 연구로 1999년 5월부터 2005년 2월까지 일개 대학 병원에 입원한 환자들에 대하여 후향적으로 의무 기록을 검토하여 지속성 혈류 감염의 정의에 합당한 환자를 선정하였다. 이후 지속성 혈류 감염 환자군의 혈액배양 검사 날짜와 동일한 날짜에 혈액배양 검사가 이루어진 환자 중 당일에만 양성 소견을 보이고 추적 배양검사 결과 음전된 환자를 대조군인 단기 혈류 감염 환자군으로 선택하여 두 군 간의 차이를 비교하였다. 결과: 연구 기간 중 혈액배양 검사상 양성 소견을 보인 환자는 총 1,737명이었으며, 이 중 연구군이 된 지속성 환자군은 64명이었고, 대조군인 단기 환자군은 146명이었다. 지속성 혈류 감염을 보인 환자들은 1개월 이내의 항생제 사용력, 원내 감염, 농양, 혼합 균주에 의한 감염, Candida sp., 경험적 항생제가 감수성 검사 결과와 부합하지 않는 경우, 중심 정맥 도관 삽관, 처음 혈액배양 검사 당시 중환자실에 재원한 경우가 많았다. 이 중, 1개월 이내에 항생제 사용력(p=0.033), 원내 감염(p=0.026), 농양(p=0.004), 혼합 균주에 의한 감염(p=0.001)은 다변량 분석상에서도 유의한 차이를 보이는 독립적인 연관성을 보였다. 예후의 비교에 있어서는 지속성 환자군이 단기 환자군에 비해 재원 기간이 길었으나(p=0.01), 사망률에 있어서는 차이를 보이지 않았다. 결론: 지속성 혈류 감염을 가진 환자들에 대하여 1개월 이내 항생제 사용력, 원내 감염, 농양 존재, 혼합 균주에 의한 감염 여부에 대해 확인해 보아야 하며, 이외에도 원인균이 Candida sp.가 아닌지, 중심 정맥 도관을 가지고 있는지, 경험적 항생제의 선택이 적절하였는지, 처음 혈액배양 검사 당시 중환자실에 재원한 경력이 있는지 확인해 볼 필요가 있겠다. Background: Persistent bloodstream infection is known to cause high mortality and a prolonged hospital stay. We performed a study examining risk factors and the clinical significance of persistent bacteremia and fungemia. Methods: This was a case-controlled study. Medical records of patients with bacteremia or fungemia in one university hospital in Korea from May 1999 to February 2005 were retrospectively reviewed. Patients with persistent positive blood cultures regardless of antibiotic treatment for more than three days were assigned to the persistent group. Patients with positive blood cultures only on the same calendar days with the persistent group but negative on follow-up were assigned to the short-term group. Results: A total of 64 patients were enrolled in the persistent group, and 146 patients in the short-term group among 1,737 patients with positive blood cultures. The persistent group was associated with previous antibiotic usage within 1 month (p=0.033), nosocomial infection (p=0.026), having an abscess (p=0.008), and infection by mixed organisms (p=0.001), independently. Candida sp. as a causative organism, treatment with inappropriate empirical antibiotics, having a central venous catheter, or ICU care at the time of blood culture was higher in the persistent group as well. The persistent group had a prolonged number of hospital-days (p=0.010), but there was no difference in mortality between the two groups. Conclusions: Patients with a persistent bloodstream infection should be assessed about previous antibiotic usage within 1 month, nosocomial infection, having an abscess, infection by mixed organisms, Candida sp. as a causative organism, treatment with inappropriate empirical antibiotics, having central venous catheter, or ICU care at the time of blood culture. (Korean J Med 72:647-657, 2007)

연잎, 연자육, 연자방 에탄올 추출물의 항염증 활성

이은주(Eun-Joo Lee),서유미(Yu-Mi Seo),김용현(Yong-Hyun Kim),정정욱(Chungwook Chung),성화정(Hwa-Jung Sung),손호용(Ho-Yong Sohn),박종이(Jong-Yi Park),김종식(Jong-Sik Kim) 한국생명과학회 2019 생명과학회지 Vol.29 No.4

연은 아시아 국가에서 음식과 약재로 널리 사용되는 재료이다. 본 연구에서는 연의 잎(leaf, NL), 자육(seed, NS), 자방(seedpod, NSP)으로부터 에탄올 추출물을 제조하고 이들의 항염증 활성과 작용기전을 규명하였다. 이들의 항염증 활성을 연구하기 위하여 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 nitric oxide (NO) 생산을 측정하였다. NL, NS, NSP는 세포 생존율에 영향을 주지 않으면서, 농도의존적으로 NO의 생산을 현저하게 저해하였으며, iNOS 및 COX-2와 같은 pro-inflammatory 중재자들의 단백질 발현을 감소시켰다. 또한, NL, NS, NSP는 MAPKs 단백질의 인신화를 감소시키고 NF-κB p65의 핵으로의 이동을 저해함으로써, 세 추출물에 의한 항염증 활성은 MAPKs 경로와 NF-κB 경로를 조절함으로써 이루어짐을 제시한다. 게다가, ROS의 생성이 세 추출물에 의해서 모두 저해되었으며, HO-1의 발현과 HO-1의 전사조절인자인 Nrf2의 핵으로의 이동이 증가되었다. 결론적으로, 이러한 연구결과는 연의 다양한 부위의 추출물인 NL, NS 그리고 NSP는 항염증 활성을 가지고 있으며, MAPKs, NF-κB, Nrf2/HO-1 등 다양한 신호경로를 통해 조절할 수 있음을 제시한다. Nelumbo nucifera, also known as sacred lotus, has mainly been used as a food throughout the Asian countries. In the present study, we prepared ethanol extracts from leaf (NL), seed (NS), and seedpod (NSP) of Nelumbo nucifera and investigated their anti-inflammatory activities in mouse macrophage RAW 264.7 cells. To evaluate the anti-inflammatory activities of NL, NS, and NSP, nitric oxide (NO) production was measured in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. NL, NS, and NSP significantly reduced NO production in a dose-dependent manner without affecting cell viabilities. NL, NS, and NSP dramatically decreased the protein expression of pro-inflammatory genes such as iNOS and COX-2. NL, NS, and NSP also suppressed phosphorylation of MAPKs and the nuclear translocation of NF-κB p65 indicating they have their anti-inflammatory activities via regulating mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and nuclear factor kappa B (NF-κB) pathways. In addition, we analyzed the production of reactive oxygen species (ROS) by the treatment of NL, NS, and NSP. All extracts reduced ROS production in a dose-dependent manner. And also, they increased heme oxygenase-1 (HO-1) protein expression and the nuclear translocation of nuclear respiratory factor 2 (Nrf2). In conclusion, our results suggest that Nelumbo nucifera has its anti-inflammatory activity via regulating MAPKs, NF-κB, and Nrf2/HO-1 pathways.

2013년 상병 건강검진 결과 분석

조순영 ( Joe Seun Young ),이미정 ( Lee Mi Jung ),이정민 ( Lee Jung Min ),서유미 ( Seo Yu Mi ) 국군의무사령부 2016 대한군진의학학술지 Vol.47 No.1

Objectives; The study analyzes the medical check-up data of enlisted corporal in 2003 from Korea Association of Health Promotion and examines descriptive characteristics between medical check-up results and health behaviors of one selected division. Methods; The design of the study is secondary data analysis. Included data are 62,439 cases after excluding missing data from the total of 64,696 cases provided by Korea Association of Health Promotion and 1,976 cases of first mid-year medical questionnaire record of the one division and medical check-up results. The data were analyzed by 20.0 SPSS program for descriptive characteristic and Chi-square test(χ2). Results; Of 62,439 cases, large proportion of abnormal lab results are Creatine (3556, 5.7%), HDL(2922, 4.7%), ALT(2118, 3.4%). Depending on family history of HTN, there were statistical difference on SBP, BMI, total cholesterol and LDL. In addition, depending on past history of smoking, there were also statistical difference on SBP, total cholesterol, HLD and LDL. Lastly, depending on the number of physical activity, there were statistical difference on SBP, DBP and Hb. Conclusions; Medical check-up for enlisted soldiers should not carry out formally, but there should be thorough follow-up based on the results so that it can contribute to disease prevention and health promotion for the soldiers. Moreover, it is necessary to provide care for those who have family history of HTN and perform health promotion service focusing on smoking cessation and physical activity.