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RAPD 표지자 분석에 의한 가시아메바속 한국분리주의 유전적 지위
홍용표,오승환,라미숙,임경일 INSTITUTE OF TROPICAL MEDICINE YONSEI UNIVERSITY 1995 YONSEI REPORTS ON TROPICAL MEDICINE Vol.26 No.1
가시아메바 속(Acanthamoeba spp.)의 DNA 염기 구성 정보와 관계없이 임의의 10개의 염기로 구성된 프라이머를 사용하여 random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction(RAPD-PCR)에 의해 게놈 상의 DNA를 무작위로 증폭하여 확인된 표지자로써 한국 분리주 및 외국 분리주와 기존의 알려진 4개 가시아메바 종간의 유전적 근연관계 분석을 통해서 4개 한국분리주의 분류상의 성상을 규명하였다. 본 연구에서 A. culbertsoni, A. hatchetti, A. triangularis, A. polyphaga와 한국 분리주인 YM-2, YM-3, YM-4, YM-5, 그리고 외국 분리주인 HOV의 게놈 DNA는 18종류의 프라이머에 의하여 다양한 양상의 증폭산물을 보였으며, 그 중 9개 프라이머는 한국 분리주간에도 특이성을 보이는 RAPD 표지자를 제공하였다. 총 18개의 프라이머에 대한 증폭산물을 대상으로 각 시료의 유사도를 조사한 결과, A. culbertsoni는 A. hatchetti, A. triangularis, A. polyphaga와 유사도가 각각 0.300, 0.308, 0.313이었고, A. hatchetti와 A. triangularis간의 유사도는 0.838이었다. 한국 분리주 YM-2, -3, -4간의 평균 유사도는 0.959이었고, YM-2, -3, -4와 A. hatchetti, A. triangularis간의 평균 유사도는 0.832이었다. 한국 분리주 YM-5는 YM-2, -3, -4 간의 비교에서 평균 0.237의 유사도를 보인 반면, A. culbertsoni와 유사도 0.857을 보여, 다른 한국 분리주보다 A. culbertsoni와 유전적으로 유사함을 알 수 있었다. UPGMA법에 의한 유전적 근연관계 분석 결과 phenogram 상에 두개의 분지군이 존재하는데, A. hatchetti, A. triangularis 및 3개 한국 분리주 (YM-2, -3, -4)가 하나의 분지군을, A. culbertsoni, A. polyphaga, HOV주, 및 YM-5가 다른 분지군을 형성하는 것으로 나타났다. 게놈 DNA 상의 변이에 근거하여 볼 때, YM-5 주는 유전적으로 A. culbertsoni와 거의 유사한 분리주이며 한국 분리주는 최소 2종 이상의 가시아메바로 분류할 수 있다고 사료된다. Genetic status of Acanthamoeba spp. were tested on the basis of random amplified polymorphic DNA(RAPD) marker analysis. Four previously established Acanthamoeba species. 4 Korean isolates of Acanthamoeba sp.. and one American isolate of Acanthamoeba sp. were analyzed by RAPD-PCR using an arbitrary decamer primers. Amplification products were fractionated by agarose gel electrophoresis and stained by ethidium bromide. Eighteen primers producted DNA amplification profiles revealing clear differences among 4 species. Nie of them also produced DNA amplification profiles which included some isolate-specific amplification products. On the basis of amplified fragments by 18 primers, the pairwise similarity indices between A. culbertsoni and other species (i.e., A. hatchetti, A. triangularis, A. polyphaga) were 0.300, 0.308, and 0.313, respectively. Similarity index between A. hatchetti and A. triangularis was 0.833. The mean similarity index among the 3 Korean isolates (YM-2,-3,-4) was 0.959 and 0.832 among them and 2 other species (A. hatchetti and A. triangularis). The mean similarity index among YM-5 and other Korean isolates (YM-2,-3,-4) was 0.237. However, the similarity index between YM-5 and A. culbertsoni was 0.857, which suggests that YM-5 is genetically more similar to A. culbertsoni than other Korean isolates. Phenogram reconstructed by UPGMA method revealed that there are two groups: one group consists of A. hatchetti, A. triangularis, and 3 Korean isolates (YM-2,-3,-4), and the other group consists of A. culbertsoni, A. polyphaga, HOV, and YM-5.
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Cytotoxicity of Acanthamoeba sp. YM-4(Korean isolate)
Shin, Ho-Joon,La, Mi-Sook,Im, Kyung-il INSTITUTE OF TROPICAL MEDICINE YONSEI UNIVERSITY 1993 YONSEI REPORTS ON TROPICAL MEDICINE Vol.24 No.1
Acanthamoeba 한국분리주(Acanthamoeba sp. YM-4)의 다양한 배양온도에서의 생장율 및 병원성정도를 병원성이 알려진 A. culbertsoni 및 A. polyphaga와 비교하여 다음과 같은 성적을 얻었다. Acanthamoeba sp. YM-4와 A. culbertsoni는 37 및 40℃에서 증식이 빨랐으며, A. polyphaga는 25℃에서 급속히 수가 증가하였다. 특히, Acanthamoeba sp. YM-4와 A. culbertsoni는 40℃ 배양에서 세대시간이 19.6 및 17.8일로 가장 짧았으며 A. polyphaga는 25℃ 배양에서 18.2일로 생장율이 높았다. 37℃ 배양에서는 세 종간에 각각 19.1, 18.7 및 19.4일로 별다른 유의점이 발견되지 않았으나, 40℃ 배양에서 A. culbertsoni의 증식이 가장 빨랐으며, Acanthamoeba sp. YM-4가 중간이었고, A. polyphaga는 배양 이틀째부터 별다른 수의 증가를 보여주지 못하였다. Chinese hamster ovary(CHO) 세포에 대한 세포독성 실험에서 Acanthamoeba sp. YM-4의 영양형 lysate (1:4 희석)는 88.5%의 세포 파괴율을 보여주었으며, A. culbertsoni 및 A. polyphaga영양형의 lysate (1:4 희석)는 각각 100% 및 13.8%의 세포독성을 나타내었다. 살아있는 영양형의 세포독성에서 보면 세종류 중에서 Acanthamoeba sp. YM-4는 중간정도의 세포 파괴율을 보여주었다. 이상의 결과로 보아 Acanthamoeba sp. YM-4는 A. culbertsoni 보다 40℃ 배양에서 생장율이 조금 느리고 또한 CHO 세포에 대한 세포독성에 있어서도 세포 파괴율이 낮은 것으로 관찰되었다. Acanthamoeba sp. YM-4 (Korean isolate), was compared with A. culbertsoni and A. polyphaga, with regard to the generation time for various culture temperatures and the cytotoxic activity to CHO cells. Acanthamoeba sp. YM-4 and A. culbertsoni propagated rapidly at 37℃ and 40℃, but A. polyphaga proliferated most rapidly at 25℃. In a 25℃ cultivation, the generation times of Acanthamoeba sp. YM-4, and A. culbertsoni were 25.7 and 24.2 hours, as compared with 18.2 hours for A. polyphaga. At 37℃, the generation times of Acanthamoeba sp. YM-4, A. culbertsoni and A. polyphaga were 19.1, 18.7 and 19.4 hours, respectively. The generation time for A. polyphaga at 40℃ was not calculated, but for Acanthamoeba sp. YM-4 and A. culbertsoni was 19.6 and 17.8 hours, respectively. When using lysates(1 : 4 dilution), the cytotoxicity of Acanthamoeba sp. YM-4 to CHO cells was 88.5%. The cytotoxicity of A. culbertsoni and A. polyphaga was 100% and 13.8%, respectively.
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