쥐 교감신경 뉴론 N형 칼슘통로의 2가 양이온의존성 비활성화

구용숙,Goo Yong-Sook 한국의학물리학회 2006 의학물리 Vol.17 No.2

본 연구자를 위시한 많은 연구자에 의해 칼슘이 N형 칼슘통로의 비활성화를 촉진시킨다는 것이 보고되었다. 그러나 칼슘에 의한 비활성화 촉진 효과가 고전적인 칼슘의존성 기전에 의해 기인하는지는 아직 확실하지 않다. L형 칼슘통로의 칼슘의존성 비활성화기전을 밝히기 위하여 지금까지 사용해온 방법의 하나는 세포내, 외의 칼슘농도를 변화시켜보는 것이다. 그러므로 본 연구에서는 칼슘의존성 비활성화기전의 존재 여부를 알아보기 위하여 2가 양이온을 1가 양이온인 메틸아민($MA^+$)으로 치환하였다. 선행 연구를 통해 우리는 5초 동안의 긴 저분극 자극 시 바륨과 칼슘을 사용하여 얻은 전류에서 모두 빠른 성분(${\tau}{\sim}150ms$)과 느린 성분(${\tau}{\sim}2,500ms$)의 비활성화가 있음을 알 수 있었다. 본 연구에서 세포외 2가 양이온의 농도가 0이 되도록 하였을 때 빠른 비활성화가 소실된 반면 느린 비활성화에는 영향이 거의 없었다. 또한 바륨를 사용하였을 때보다 10 mV씩 과분극시킨 전압에서의 메틸암모늄 전류 데이터를 비교하여 보았을 때 느린 비활성화의 시정수가 서로 잘 일치하였으며 이 시정수는 막전압이 저분극될수록 감소하는 막전압의존성 비활성화의 특성을 보였다. 본 연구결과와 선행연구의 결과를 종합하여 볼 때 세포외 2가 양이온의 존재는 N형 칼슘통로의 빠른 비활성화가 일어나기 위하여 필수적인 조건이며 이러한 2가 양이온의존성 비활성화기전은 기존의 칼슘의존성 또는 막전압의존성 기전과 다르다는 가설을 제안한다. Experiments from several groups Including ours have demonstrated that $Ca^{2+}$ can enhance the inactivation of N-type calcium channels. However, it is not clear if this effect can be ascribed to a 'classic' $Ca^{2+}$-dependent inactivation (CDI) mechanism. One method that has been used to demonstrate CDI of L-type calcium channels is to alter the intracellular and extracellular concentration of $Ca^{2+}$. In this paper we replaced the external divalent cation to monovalent ion ($MA^+$) to test CDI. In the previous paper, we could separate fast (${\tau}{\sim}150ms$) and slow (${\tau}{\sim}2,500ms$) components of inactivation in both $Ba^{2+}$ and $Ca^{2+}$ using 5-sec voltage step. Lowering the external divalent cation concentration to zero abolished fast inactivation with relatively little effect on slow inactivation. Slow inactivation ${\tau}$ correspond very well with provided the $MA^+$ data is shifted 10 mV hyperpolarized and slow inactivation ${\tau}$ decreases with depolarization voltage in both $MA^+\;and\;Ba^{2+}$, which consistent with a classical voltage dependent inactivation (VDI) mechanism. These results combined with those of our previous paper lead us to hypothesize that external divalent cations are required to produce fast N-channel inactivation and this divalent cation-dependent inactivation is a different mechanism from classic CDI or VDI.

상부복외측 연수 심혈관계 세포의 체성교감 반사시 자발적 흥분발사특성 분석 :II. 최소 세포망 모델

구용숙,노진아,차은종,Goo, Yong-Sook,No, Jin-A,Cha, Eun-Jong 대한의용생체공학회 1996 의공학회지 Vol.17 No.1

A number of experimental evidences suggest that the rnun ventrolateral medulla(RVLM) is the final common pathway in the regulation of arterial blood pressure. A Voup of neurons in the RVLM, called the cardiovascular neurons (UN), show spontaneous activity temporally synchronized with the periodic cardiac cycle. These neurons affect the sympathetic nerve discharge(SND), thus are believed to be responsible for blood pressure control. The present experiment identified 98 UVNs in 42 cats based on the temporal relationships between each neuron's activity with both the cardiac cycle and SWD. In 20 UWL changes of spontaneous firing rate(FR) during the somatosympathetic reflex(SSR) were studied Five different firing patterns were observed during the pressor and depressor responses of SSR, implying that they form an interconnected neuronal circuit interacting with one another to generate efferent signals for blood pressure regulation. In the following companion paper, the firing patterns of CVN are analyzed to develop a minimal neuronal circuit model explaining the present experimental outcome.

Effects of Electrolytes and Drugs on the Inhibitory Junction Potentials Recorded from the Antrum of Guinea-pig Stomach

구용숙,서석효,이석호,황상익,김기환,Goo, Yong-Sook,Suh, Suk-Hyo,Lee, Suk-Ho,Hwang, Sang-Ik,Kim, Ki-Whan The Korean Physiological Society 1990 대한생리학회지 Vol.24 No.1

The effects of electrolytes, adenosine, ATP, 5-hydroxytryptamine (5-HT, serotonin) and ketanserin on the inhibitory junction potentials (IJPs) were investigated to clarify the interactions of these drugs with the neurotransmitters released from non-adrenergic, non-cholinergic nerves in the antrum of guinea-pig stomach. Electrical responses of antral circular muscle cells were recorded intracellularly using glass capillary microelectrode filled with 3 M KCI. All experiments were performed in Tris-buffered Tyrode soluition which was aerated with 100% $O_{2}$ and kept at $35^{\circ}C$. The results obtained were as follows: 1) Inhibitory junction potential (IJP) was recorded in antral strip, while excitatory junction potential (EJP) was recorded in fundic strip. 2) IJP recorded in antral strip was not influenced by atropine $(10^{-6}\;M)$ and guanethidine $(5{\times}10^{-6})$. 3) The amplitude of IJP increased in high $Ca^{2+}$ solution, while that of IJP decreased in high $Mg^{2+}$ solution or by $Ca^{2+}$ antagonist (verapamil). Apamin, $Ca^{2+}$-activated $K^{+}$ channel blocker blocked IJP completely. 4) ATP and adenosine decreased the amplitude of IJP. 5) 5-HT decreased the amplitude of IJP with no change of the amplitude of slow waves, while ketanserin (5-HT type 2 blocker) decreased the amplitude of slow waves markedly with no change in that of IJP. From the above results, the following conclusions could be made. 1) IJP recorded in antral strip is resulted from neurotransmitters released from non-adrenergic, non-cholinergic nerves. 2) An increase in the concentration of external $Ca^{2+}$ enhances the release of neurotransmitters from non-adrenergic, non-cholinergic nerves which activate the $Ca^{2+}$-dependent $K^{+}$ channel. 기니피그 유문동 부위를 절제한 뒤 점막층을 박리하고 윤상근 주행방향으로 길이 10 mm, 너비 2 mm 되는 조직 절편을 만들어 수평형 실험용기에 넣어 핀으로 고정하였다. 유리미세전극을 세포내에 삽입하여 서파를 기록하면서 조직양편에 설치한 백금자극전극(직경 0.5 mm)에 강도 $10{\sim}50V$, 기간 $50{\sim}100\;{\mu}s$ 되는 자극파를 주어 신경-근 부위의 접합부 전압을 기록하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1) 위저부에서는 흥분성 접합부 전압이, 유문동에서는 억제성 접합부 전압이 기록되었고 유문동의 억제성 접합부 전압은 atropine($10^{-6}\;M)$과 guanethidine$(5{\times}10^{-6}\;M)$을 동시 처치했을 때 영향을 받지 않았다. 2) 세포외 $Ca^{2+}$ 농도를 높였을 때(7 mM)는 억제성 접합부 전압의 크기가 증가하고 세포외 $Mg^{2+}$ 농도를 높였을 때(5 mM)와 verapamil($10^{-5}\;M$)을 주었을 때는 억제성 접합부 전압의 크기가 감소하였다. 3) 아데노신을 투여하였을 때와 ATP를 투여했을 때는 모두 억제성 접합부 전압의 크기가 감소하였다. 4) 5-HT$(10^{-6}\;M)$을 투여했을 때는 서파크기에는 변화없이 억제성 접합부 전압의 크기만 감소하였고 5-HT type 2 길항제인 ketanserin$(5{\times}10^{-6}\;M)$을 투여했을 때는 서파크기는 현저히 감소한 반면 억제성 접합부 전압크기는 변화가 없었다. 이상의 결과로부터 유문동에서 기록되는 억제성 접합부 전압은 비아드레날린, 비콜린 동작성 신경에 의해 유발되며 $Ca^{2+}$은 비아드레날린 비콜린 동작성 신경에서 신경흥분전달물질의 유리를 촉진시키고 분비된 신경흥분전달물질로 인해 $Ca^{2+}$ 의존성 $K^{+}$ 통로가 활성화되어 억제성 접합부 전압의 크기를 증가시킨다고 사료된다.

기니피그 유문동에서 기록되는 억제성 접합부 전압에 미치는 전해질과 약물의 효과

구용숙(Goo, Yong-Sook),서석효(Suh, Suk-Hyo),이석호(Lee, Suk-Ho),황상익(Hwang, Sang-Ik),김기환(Kim, Ki-Whan) 대한생리학회 1990 대한생리학회지 Vol.24 No.1

기니피그 유문동 부위를 절제한 뒤 점막층을 박리하고 윤상근 주행방향으로 길이 10 mm, 너비 2 mm 되는 조직 절편을 만들어 수평형 실험용기에 넣어 핀으로 고정하였다. 유리미세전극을 세포내에 삽입하여 서파를 기록하면서 조직양편에 설치한 백금자극전극(직경 0.5 mm)에 강도 10 ~ 50V$</TEX>, 기간 50 ~ 100 μs 되는 자극파를 주어 신경-근 부위의 접합부 전압을 기록하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1) 위저부에서는 흥분성 접합부 전압이, 유문동에서는 억제성 접합부 전압이 기록되었고 유문동의 억제성 접합부 전압은 atropine(10^-6 M)과 guanethidine(5 X 10^-6 M)을 동시 처치했을 때 영향을 받지 않았다. 2) 세포외 Ca²⁺ 농도를 높였을 때(7 mM)는 억제성 접합부 전압의 크기가 증가하고 세포외 Mg²⁺ 농도를 높였을 때(5 mM)와 verapamil(10^-5 M)을 주었을 때는 억제성 접합부 전압의 크기가 감소하였다. 3) 아데노신을 투여하였을 때와 ATP를 투여했을 때는 모두 억제성 접합부 전압의 크기가 감소하였다. 4) 5-HT(10^-6 M)을 투여했을 때는 서파크기에는 변화없이 억제성 접합부 전압의 크기만 감소하였고 5-HT type 2 길항제인 ketanserin(5 X 10^-6 M)을 투여했을 때는 서파크기는 현저히 감소한 반면 억제성 접합부 전압크기는 변화가 없었다. 이상의 결과로부터 유문동에서 기록되는 억제성 접합부 전압은 비아드레날린, 비콜린 동작성 신경에 의해 유발되며 Ca²⁺은 비아드레날린 비콜린 동작성 신경에서 신경흥분전달물질의 유리를 촉진시키고 분비된 신경흥분전달물질로 인해 Ca²⁺ 의존성 K⁺ 통로가 활성화되어 억제성 접합부 전압의 크기를 증가시킨다고 사료된다. The effects of electrolytes, adenosine, ATP, 5-hydroxytryptamine (5-HT, serotonin) and ketanserin on the inhibitory junction potentials (IJPs) were investigated to clarify the interactions of these drugs with the neurotransmitters released from non-adrenergic, non-cholinergic nerves in the antrum of guinea-pig stomach. Electrical responses of antral circular muscle cells were recorded intracellularly using glass capillary microelectrode filled with 3 M KCI. All experiments were performed in Tris-buffered Tyrode soluition which was aerated with 100% O<Sub>2</sub> and kept at 35℃. The results obtained were as follows: 1) Inhibitory junction potential (IJP) was recorded in antral strip, while excitatory junction potential (EJP) was recorded in fundic strip. 2) IJP recorded in antral strip was not influenced by atropine (10^-6 M) and guanethidine (5 X 10^-6). 3) The amplitude of IJP increased in high Ca²⁺ solution, while that of IJP decreased in high Mg²⁺ solution or by Ca²⁺ antagonist (verapamil). Apamin, Ca²⁺-activated K⁺ channel blocker blocked IJP completely. 4) ATP and adenosine decreased the amplitude of IJP. 5) 5-HT decreased the amplitude of IJP with no change of the amplitude of slow waves, while ketanserin (5-HT type 2 blocker) decreased the amplitude of slow waves markedly with no change in that of IJP. From the above results, the following conclusions could be made. 1) IJP recorded in antral strip is resulted from neurotransmitters released from non-adrenergic, non-cholinergic nerves. 2) An increase in the concentration of external Ca²⁺ enhances the release of neurotransmitters from non-adrenergic, non-cholinergic nerves which activate the Ca²⁺-dependent K⁺ channel.

Effects of Extracellular $Ca^{2+}$ and $Ca^{2+}$-Antagonists on Endothelium-Dependent Relaxation in Rabbit Aorta

서석효,구용숙,박춘옥,황상익,김기환,Suh, Suk-Hyo,Goo, Yong-Sook,Park, Choon-Ok,Hwang, Sang-Ik,Kim, Ki-Whan The Korean Physiological Society 1990 대한생리학회지 Vol.24 No.1

토끼 흉부 대동맥을 이용하여 내피세포 의존성 혈관이완에 대한 세포외 $Ca^{2+}$과 여러가지 $Ca^{2+}$ 길항제의 효과를 분석하여 EDRF의 작용기전을 밝혀 보고자 하였다. 대동맥 횡단 절편의 등장성 수축은 $10^{-7}\;M$ 노에피네프린으로 유발시켰으며, $10^{-6}\;M$ 사세틸콜린으로 내피세포 의존성 혈관이완을 일으켰다. 내피세포는 작은 솜뭉치로 부드럽게 문질러서 제거하였으며, hemolysate를 사용하여 EDRF에 대한 헤모글로빈의 효과를 관찰하였다. 결과를 종합하면 다음과 같다. 1) 아세틸콜린에 의한 내피세포 의존성 혈관이완은 두 시기, 즉 초기급속이완기와 후기완만이완기로 나타났다. 2) 세포외 $Ca^{2+}$을 낮추면, 아세틸콜린에 의한 내피세포 의존성 혈관이완이 감소하였으며, 특히 후기완만이완기가 감소하였다. 3) Verapamil, nifedipine, $Mn^{2+}$ 및 $Cd^{2+}$은 내피세포 의존성 혈관이완에 영향이 없었던 반면 $La^{3+}$와 $Co^{2+}$는 억제시켰다. 4) 헤모글로빈을 투여하면 내피세포가 없는 절편에서는 기초긴장도의 변화가 없었으나 내피세포가 있는 절편에서는 기초긴장도가 증가하였고 아세틸콜린에 의한 내피세포 의존성 혈관이완도 완전히 억제되었다. 이상의 결과로부터 세포외 $Ca^{2+}$은 주로 후기완만이완기에 작용하며 이때 사용되는 $Ca^{2+}$ 유입 통로는 $Ca^{2+}$ 길항제로 억제되지 않는 것으로 결론지을 수 있다. The effects of extracellular $Ca^{2+}$ and various $Ca^{2+}$ antagonists on endothelium-dependent relaxation to acetylcholine were studied in the isolated rabbit thoracic aorta in order to elucidate the control mechanism of endothelium derived relaxing factor (EDRF) release. Endothelium was removed from aortic strips by gentle rubbing with cotton ball. The effect of hemoglobin on basal tension was also observed with hemolysate. The results obtained were as follows: 1) Endothelium-dependent relaxation (EDR) to acetylcholine (ACh) showed biphasic pattern; the initial rapid relaxation phase and the late slow relaxation phase. 2) With the depletion of the extracellular $Ca^{2+}$, EDR was gradually suppressed, especially the late slow relaxation. 3) Verapamil, nifedipine, $Mn^{2+}$ and $Cd^{2+}$ had not any effect on EDR, while $La^{3+}$ and $Co^{2+}$ suppressed EDR completely. 4) The resting tension of the strips with rubbed endothelium was not altered by the addition of hemoglobin. That of the strips with intact endothelium, however, was enhanced and EDR to ACh was completely blocked From these results, we suggest that extracellular $Ca^{2+}$ is necessary for ACh-induced slow relaxation while $Ca^{2+}$ antagonists have not any effect on EDR.

SD rat 망막신경절세포의 생후 성숙기간에 따른 빛 자극 반응 특성

예장희,구용숙,Ye, Jang-Hee,Goo, Yong-Sook 한국의학물리학회 2005 의학물리 Vol.16 No.4

한국형 인공시각장치 개발 목적으로 토끼망막을 사용하여 차후 개발될 인공시각장치에 인가하기 위한 적절한 전기자극 파라미터를 추출하는 실험을 수행하였다. 유전적 망막변성모델인 RD mouse (rd/rd (C3H/HeJ))를 망막질환모델로 사용하기 앞서 본 연구에서는 SD rat을 사용하여 설치류의 생후성숙기간 동안 변화하는 망막신경절세포의 빛 자극에 대한 변화 양상을 전반적으로 파악하는 control 실험을 하였다. 망막신경절세포의 흥분파는 8${\times}$8의 MEA (multi- electrode array)로 기록하였다. 개안 이전시기(pre-eye opening period)인 생후 15일까지는 망막신경절세포의 자발적 집단발사현상 (moving spontaneous bursts)이 옮겨 다니는 것을 발견하였다. 이 시기의 쥐들은 시각기능이 완성되지 않아 빛 자극에 의해 유발되는 흥분파를 보이지 않으며 오로지 이들의 촉각(tactile sense)에 의하여서만 이동하는 것을 관찰하였다. 그러나 생후 2주(post-eye opening period)가 지나면, 빛 자극에 의해 ON, OFF, ON/OFF 반응이 유발됨을 확인할 수 있었다. 전체적인 ON, OFF, 그리고 ON/OFF 망막신경절세포의 양상은 각각 $40\%,\;50\%,\;5\%$였으며, 이들 세포가 확인된 안구에서의 해부학적인 위치는 등쪽 관자방향(dorso-temporal)이 $50\%$, 배쪽 방향(ventral)이 $37.5\%$, 그리고 등쪽 코 방향(dorso-nasal)이 $12.5\%$로 나타났다. 설치류 망막을 대상으로 빛 자극에 의한 반응을 알아보는 실험을 할 때 생후 2${\~}$3주령이 가장 적합한 시기임을 확인하였다. 것이 바람직하다고 판단되었다.의한 발아촉진 효과는 종피의 탈색과 부식으로 인한 광흡수의 증대에서 기인되는 것으로 추측된다.3월 8일과 3월 15일 피복처리구의 그린업이 가장 효과적이었다. 한국잔디 및 한지형 잔디의 비닐 피복으로 인한 초봄 그린업 촉진시 유의할 점은 충분한 수분 유지를 위해 비닐 피복전에 관수를 하거나 비온 후에 비닐 피복하는 것이 좋으며, 비닐 제거시 잔디의 일소현상의 피해를 줄이기 위해 흐린날 비닐을 제거하는 것이 좋을 것으로 판단되었다.유발식이 급여로 $524\%$가 증가된 동맥경화지수는 질경이 에틸아세테이트 분획 병합투여로 대조군에 비하여 $40.2\%,\;51.2\%$가 감소됨으로써 동맥경화 발병 위험율이 대조군에 비하여 감소되었다. HDL-콜레스테롤 함량/총콜레스테롤 함량 비는 고콜레스테롤혈증 유발 식이 급여로 정상군보다 $73.9\%$가 감소됐으나 질경이 에틸아세테이트 분획 병합투여로 대조군에 비하여 유의한 증가를 나타냈다. 26두가 발정 반응($96.3\%$)을 나타내어 2.75${\~}$3.5의 경우가 2.50 이하의 경우에 비하여 높은 발정반응을 나타내었다.osterone과 0.40의 정의 상관이었고 근내지방도와 creatinine 농도간에는 -0.55의 비교적 높은 음의 상관계수가 추정되었으나 유의성은 인정되지 않았다. 6. 한우 비거세우의 도살시 혈청 성분 농도와 도체형질과의 상관에서 육량지수는 연령에 대해 보정한 HDLC 농도와 -0.71의 음의 상관이었으며, 도체율은 globulin과 0.70의 높은 정의 상관이었고, 등지방두께는 연령으로 보정된 HDLC와 0.69로 정의 상관관계를 보였다. 도체중은 triglyceride와 0.51의 정의 상관, 배최장근단면적은 testosterone과 -0.91, As part of Korean retinal prosthesis project, we have provided preliminary experimental results regarding voltage parameters for the stimulation of chemically degenerated rabbit retina. Since our APB-treated chemically degenerated retina is only ON-pathway blocked, now we switch our experiments to more appropriate retinal degeneration model, genetically degenerated retina model (RD mouse: rd/rd (C3H/HeJ)). Before studying with RD mouse, we started control experiments with normal SD rat to understand characteristics of retinal ganglion ceil activity with postnatal maturation in rodents. Ganglion cell activities were recorded with 8${\times}$8 multi-electrode array. Moving spontaneous bursts appeared until postnatal day of 15. During pre-eye opening period, no light evoked response appeared. After postnatal day of 2 weeks (post-eye opening period), ON-, OFF- and ON/OFF response appeared. The fractional distributions of ON, OFF, and ON/OFF ganglion cell is about $40\%,\;50\%$, and $5\%$. The percentage ($\%$) of light evoked response in each dorso-temporal, ventral, and dorso-nasal area of eye is about $50\%,\;37.5\%$ and $12.5\%$, respectively. We concluded that the optimal period for experiment in rodent is about postnatal day of 2${\~}$3 weeks.

흰쥐 부신 크로마핀 세포 칼슘통로 조절에 미치는 ATP의 효과

김경아,구용숙,Kim, Kyung Ah,Goo, Yong Sook 한국의학물리학회 2014 의학물리 Vol.25 No.3

뉴론에서 ATP는 분비 과립내에 신경전달물질과 함께 다량 저장되어 있다가 신경전달물질과 함께 분비되는 것으로 알려져 있으므로 신경전달물질의 자극-분비(stimulus-secretion) coupling 과정에 있어 중요한 조절작용을 할 것으로 기대된다. 그러므로 본 연구에서는 뉴론과 그 발생학적 기원이 동일한 부신수질 세포(adrenal chromaffin cell)를 대상으로 하여 세포막 칼슘통로를 통한 세포막 전류에 미치는 ATP의 영향을 측정함으로써 신경전달물질이 자극-분비 coupling 과정에 작용하는 ATP의 조절 작용을 알아보고자 하였다. 부신수질 세포의 칼슘통로를 통한 세포막 전류는 패치클램프 테크닉으로 기록하였다. 10 mM $Ba^{2+}$을 포함한 세포 외 용액에서, $Ba^{2+}$ current는 0.1 mM ATP를 세포외부에 처치했을 때, 평균 $36{\pm}6%$ (n=6) 감소되어 나타났고 ATP를 씻어준 후 전류는 다시 회복되는 가역적 반응을 보였다. ATP의 전류 억제 기전을 알아보고자 칼슘통로에서 관찰되는 현상 중의 하나인 소통(facilitation)현상을 기록하였다. +80 mV의 큰 prepulse를 준 후 바로 테스트 펄스를 주며 측정한 전류는 큰 prepulse에 의해 억제효과가 풀리는(disinhibition) 현상을 나타내었다. ATP 처치 후 큰 자극을 주어 $37{\pm}5%$ (n=11)의 $Ba^{2+}$ 전류 증가가 있었고 이는 ATP가 없는 상태에서 순수하게 큰 자극에 의해 소통되는 $25{\pm}3%$ (n=12)과 유의한 차이를 보였다(p<0.05). ATP의 억제 기전이 G-protein을 매개로 한 것인지를 알아보고자 가수분해 되지 않는 GTP 유도체인 $GTP{\gamma}S$를 세포 내에 준 후 $Ba^{2+}$ 전류를 기록하였다. $GTP{\gamma}S$에 의해 55%의 전류 크기의 감소가 있었고 이 환경에서 큰 prepulse를 인가하였을 때 $34{\pm}4%$ (n=19)의 소통현상을 보였다. 이는 $GTP{\gamma}S$가 없는 환경에서의 $25{\pm}3%$ (n=12)의 소통현상을 보인 것과 유의한 차이를 보였다(p<0.05). $Ba^{2+}$ current trace의 활성화 과정(activation)을 curve-fitting한 결과, control은 single exponential curve로 fitting된 반면, ATP 또는 $GTP{\gamma}S$를 처치한 경우, 그리고 ATP와 $GTP{\gamma}S$ 모두 처치한 경우에서는 double-exponential curve로 가장 잘 fitting이 되었다. 즉, ATP나 $GTP{\gamma}S$를 처치했을 때 모두 전류가 더 느리게 활성화되는 모양을 나타내었고, 이상의 결과로 미루어 ATP와 $GTP{\gamma}S$는 같은 방식으로 칼슘통로를 억제하고, 이러한 억제효과는 세포막에 아주 큰 전압을 걸어주면 칼슘 통로에 결합했던 G-protein이 막전압 의존적으로 떨어짐으로써 소실(disinhibition)된다고 해석된다. 본 연구에서 확인한 ATP의 칼슘통로 억제효과는 자체 크로마핀 세포 또는 주변 세포에서 아드레날린이 적게 분비되게 하는 autocrine 또는 paracrine inhibition 과정의 중요한 기전으로 작용할 것이다. ATP in quantity co-stored with neurotransmitters in the secretory vesicles of neurons, by being co-released with the neurotransmitters, takes an important role to modulate the stimulus-secretion response of neurotransmitters. Here, in this study, the modulatory effect of ATP was studied in $Ca^{2+}$ channels of cultured rat adrenal chromaffin cells to investigate the physiological role of ATP in neurons. The $Ca^{2+}$ channel current was recorded in a whole-cell patch clamp configuration, which was modulated by ATP. In 10 mM $Ba^{2+}$ bath solution, ATP treatment (0.1 mM) decreased the $Ba^{2+}$ current by an average of $36{\pm}6%$ (n=8), showing a dose-dependency within the range of $10^{-4}{\sim}10^{-1}mM$. The current was recovered by ATP washout, demonstrating its reversible pattern. This current blockade effect of ATP was disinhibited by a large prepulse up to +80 mV, since the $Ba^{2+}$ current increment was larger when treated with ATP ($37{\pm}5%$, n=11) compared to the control ($25{\pm}3%$, n=12, without ATP). The $Ba^{2+}$ current was recorded with $GTP{\gamma}S$, the non-hydrolyzable GTP analogue, to determine if the blocking effect of ATP was mediated by G-protein. The $Ba^{2+}$ current decreased down to 45% of control with $GTP{\gamma}S$. With a large prepulse (+80 mV), the current increment was $34{\pm}4%$ (n=19), which $25{\pm}3%$ (n=12) under control condition (without $GTP{\gamma}S$). The $Ba^{2+}$ current waveform was well fitted to a single-exponential curve for the control, while a double-exponential curve best fitted the current signal with ATP or $GTP{\gamma}S$. In other words, a slow activation component appeared with ATP or $GTP{\gamma}S$, which suggested that both ATP and $GTP{\gamma}S$ caused slower activation of $Ca^{2+}$ channels via the same mechanism. The results suggest that ATP may block the $Ca^{2+}$ channels by G-protein and this $Ca^{2+}$ channel blocking effect of ATP is important in autocrine (or paracrine) inhibition of adrenaline secretion in chromaffin cell.

N형 칼슘통로 비활성화와 연계된 세포 신호전달 체계로서의 인산화과정

임원일,구용숙,Lim Wonil,Goo Yong Sook 한국의학물리학회 2004 의학물리 Vol.15 No.4

N형 칼슘통로의 비활성화기전에 관하여는 아직까지도 막전압의존성 기전과 칼슘의존성 기전간에 논란이 계속되고 있다. 2003년에 의학물리에 발표한 논문1)에서 본 연구자는 N형 칼슘통로의 비활성화 기전은 2가지 성분 -빠른 성분과 느린 성분을 가지고 있고 빠른 성분은 칼슘의존적이 아니며 오직 느린 성분만이 칼슘의존적일 가능성을 제시하였다. 본 논문에서는 막전압의존성 기전이 옳건 칼슘의존성 기전이 옳건 간에 세포 신호전달 체계로서 비활성화와 연계된 기전이 필요하므로 이러한 맥락에서 인산화 기전을 연구하였다. 흰쥐 경동맥 결절뉴론을 단일 세포로 얻은 후 whole cell patch clamp technique를 사용하여 N형 칼슘전류를 기록하고 대조 세포내액을 사용하였을 때와 phosphatase inhibitor인 okadaic acid를 포함한 세포내액을 사용하였을 때의 차이를 비교하였다. Okadaic acid에 의하여 비활성화정도가 증가되었고 이러한 okadaic acid 효과는 주로 N형 통로를 통하여 영향을 미침을 N형 칼슘통로 억제제인 $\omega$-conotoxin GVIA를 사용함으로써 확인하였다. Okadaic acid에 의한 비활성화 증가 효과는 protein kinase를 비특이적으로 억제하는 staurosporine에 의하여 억제되었고 또한 calmodulin dependent protein kinase의 특이적 억제제인 lavendustin C에 의하여 억제되었으므로 인산화과정이 N형 칼슘통로 비활성화와 관련되어 있고 특히 calmodulin을 통한 인산화과정이 주로 관여함을 확인하였다. 본 연구자가 발표한 선행논문1)에 의해 외부의 2가 양이온에 의해 빠른 비활성화가 진행되며, 본 논문에 의하여 인산화과정에 의해 빠른 비활성화가 촉진된다는 사실이 확인되었다. 그러나 본 연구결과만으로는 인산화과정이 비활성화 자체라고는 볼 수 없으며 단지 인산화과정에 의해 비활성화가 가속되었다고 해석할 수 밖에 없다. 인산화과정이 비활성화자 체인지 여부는 2가 양이온이 칼슘통로에 작용하는 결합부위에 관한 연구 및 인산화 부위가 칼슘통로인지 아니면 다른 조절 부위인지 여부를 확인할 수 있는 연구가 진행되어야 확실히 알 수 있을 것이다. In N-type $Ca^{2+}$ channels, the mechanism of inactivation - decline of inward current during a depolarizing voltage step- is still controversial between voltage-dependent inactivation and $Ca^{2+}$ -dependent inactivation. In the previous paper we demonstrated that fast component of inactivation of N-type calcium channels does not involve classic $Ca^{2+}$ -dependent mechanism and the slowly inactivating component could result from a $Ca^{2+}$ -dependent process. However, there should be signal transduction pathway which enhances inactivation no matter what the inactivation mechanism is. We have investigated the effect of phosphorylation on calcium channels of rat sympathetic neurons. Intracellular dialysis with the phosphatase inhibitors okadaic acid markedly enhanced the inactivation. The rapidly inactivating component is N-type calcium current, which is blocked by $\omega$-conotoxin GVIA. Staurosporine, a nonselective protein kinase inhibitor, prevented the action of okadaic acid, suggesting that protein phosphorylation is involved. More specifically lavendustin C, inhibitor of CaM kinase II, prevented the action of okadaic acid, suggesting that calmodulin dependent pathway is involved in inactivation process. It is not certain to this point whether phosphorylation process is inactivation itself. Molecular biological research regarding binding site should be followed to address the question of how the divalent cation binding site is related to phoshorylation process.

Electrical Stimulation Parameters in Normal and Degenerate Rabbit Retina

진계환,구용숙,Jin, Gye-Hwan,Goo, Yong-Sook Korean Society of Medical Physics 2008 의학물리 Vol.19 No.1

망막색소변성(retinitis pigmentosa: RP)과 연령 관련 황반변성(age-related Macular Degeneration: AMD)은 망막변성으로 인해 실명에 이르는 대표적인 질환이며 망막이식장치의 개발을 통해 치료될 수 있다고 간주되고 있다. 최근에 국내에서도 망막이식장치 개발을 위한 연구팀이 조직되었다. 성공적인 망막이식장치 개발을 위하여 여러 가지 선결요소가 필요하지만 그 중 한 가지가 이식장치에 인가할 전기자극을 최적화하는 것이다. 변성망막의 전기적 특성은 정상 망막과 다르리라 예측되므로 우리는 장차 개발될 망막 이식장치에 인가할 전기자극 최적화를 위한 가이드라인을 제공하기 위해 정상 망막과 변성 망막의 전압자극 파라미터에 관한 실험을 하였다 망막을 분리한 후 망막절편을 신경절세포 층이 다채널전극의 표면을 향하게 하여 전극에 붙인다 in-vitro 상태에서 망막 신경절세포의 전기신호를 기록하기 위해 전극 직경: $30{\mu}m$, 전극간 거리: $200{\mu}s$, 전극 임피던스 1kHz 에서 $50k{\Omega}$인 8행 8열의 다채널전극을 사용하였다. 다채널전극의 60채널 중 두 채널을 자극전극과 접지로 사용하여 단극전기자극을 인가하였고 나머지 전극을 기록전극으로 사용하였다. 가한 전기자극은 전압자극으로 전하균형을 맞춘 이상성자극을 아노딕 사각파를 먼저 주고 캐쏘딕 사각파가 나중에 나오는 형태로 두 사각파간의 지체는 없도록 하였으며 동일한 자극을 2초 간격으로 50회 반복하여 인가하였다. 다양한 전기자극을 사용하였는 바 첫째는 사각파의 크기를 달리하였다 $(0.5{\sim}3V)$. 둘째는 사각파의 시간을 달리하였다 $(100{\sim}1,200{\mu}s)$. 전하밀도는 옴의 법칙과 쿨롱의 법칙을 이용하여 계산하였다. 전기자극으로 유발된 반응은 50회 자극에 대한 평균치를 얻은 후 자극 후 히스토그램(PSTH)을 그려 분석하였다. 전압자극의 크기를 $0.5{\mu}3V$로 달리하였을 때 믿을 만한 망막신경절세포가 유발되는 자극은 1.5V이었고 이때 계산된 전하밀도의 역치는 $2.123mC/cm^2$이었다. 전압의 크기를 2V로 고정하고 자극 지속시간을 $100{\sim}1,200{\mu}s$로 달리하였을 때 믿을 만한 망막신경절세포가 유발되는 자극의 역치는 $300{\mu}s$에서 관찰되었다. 이때 계산된 전하밀도의 역치는 $1.698mC/cm^2$이었다. L-(1)-2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB)을 사용하여 ON-경로를 차단한 후에 전기자극을 인가하였을 때도 자극에 의해 망막신경절 세포의 반응이 유발되는 것을 확인하였다. APB-변성망막에서 전압의 크기를 2V로 고정하고 자극 지속시간을 $100{\sim}1,200{\mu}s$로 달리하였을 때 믿을 만한 망막신경절세포가 유발되는 자극의 역치는 $300{\mu}s$에서 관찰되었으며 이는 정상망막의 결과와 같았다. 추후 APB-변성망막을 가지고 좀더 실험이 진행되어야 정상망막과 변성망막의 전하밀도에 관한 명료한 비교가 가능할 것이다. Retinal prosthesis is regarded as the most feasible method for the blind caused by retinal diseases such as retinitis pigmentosa (RP) or age related macular degeneration (AMD). Recently Korean consortium launched for developing retinal prosthesis. One of the prerequisites for the success of retinal prosthesis is the optimization of the electrical stimuli applied through the prosthesis. Since electrical characteristics of degenerate retina are expected to differ from those of normal retina, we performed voltage stimulation experiment both in normal and degenerate retina to provide a guideline for the optimization of electrical stimulation for the upcoming prosthesis. After isolation of retina, retinal patch was attached with the ganglion cell side facing the surface of microelectrode arrays (MEA). $8{\times}8$ grid layout MEA (electrode diameter: $30{\mu}m$, electrode spacing: $200{\mu}m$, and impedance: $50k{\Omega}$ at 1 kHz) was used to record in-vitro retinal ganglion cell activity. Mono-polar electrical stimulation was applied through one of the 60 MEA channel, and the remaining channels were used for recording. The electrical stimulus was a constant voltage, charge-balanced biphasic, anodic-first square wave pulse without interphase delay, and 50 trains of pulse was applied with a period of 2 sec. Different electrical stimuli were applied. First, pulse amplitude was varied (voltage: $0.5{\sim}3.0V$). Second, pulse duration was varied $(100{\sim}1,200{\mu}s)$. Evoked responses were analyzed by PSTH from averaged data with 50 trials. Charge density was calculated with Ohm's and Coulomb's law. In normal retina, by varying the pulse amplitude from 0.5 to 3V with fixed duration of $500{\mu}s$, the threshold level for reliable ganglion cell response was found at 1.5V. The calculated threshold of charge density was $2.123mC/cm^2$. By varying the pulse duration from 100 to $1,200{\mu}s$ with fixed amplitude of 2V, the threshold level was found at $300{\mu}s$. The calculated threhold of charge density was $1.698mC/cm^2$. Even after the block of ON-pathway with L-(1)-2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB), electrical stimulus evoked ganglion cell activities. In this APB-induced degenerate retina, by varying the pulse duration from 100 to $1200{\mu}s$ with fixed voltage of 2 V, the threshold level was found at $300{\mu}s$, which is the same with normal retina. More experiment with APB-induced degenerate retina is needed to make a clear comparison of threshold of charge density between normal and degenerate retina.

다채널기록법을 이용한 토끼 망막 신경절세포의 특성 분석

조현숙,진계환,구용숙,Cho Hyun Sook,Jin Gye-Hwan,Goo Yong Sook 한국의학물리학회 2004 의학물리 Vol.15 No.4

망막의 신경절세포는 눈에 가해진 시각 정보를 흥분파의 형태로 변환하여 시신경을 통하여 대뇌의 시각피질까지 전달한다. 과거에 사용하여 왔던 방법은 단일 전극을 단일 뉴론의 세포내, 외에 삽입함으로써 특정 시간대에 특정 뉴론만을 기록하는 방법이었으므로 신경망 전체를 통하여 처리되어 나오는 정보를 알아보기에는 적합하지 않다. 다행히 최근에 다채널 전극을 사용하여 여러 신경세포에서 나오는 신호를 동시에 기록할 수 있는 다채널기록법(multichannel recording) 이 개발되었으므로 본 연구에서는 8행 ${\times}$ 8열의 다채널전극을 사용한 다채널기록법을 이용하여 망막신경절세포 군집의 흥분파를 기록, 분석함으로써 단일 신경세포가 아닌 망막 신경망을 거쳐 최종적으로 나오는 신호에 대해서 연구하였다. 전극에 부착된 망막 절편에 2초 동안 빛을 가하고 5초 동안 빛이 차단되는 자극을 반복적으로 인가한 후, PSTH 분석방법으로 망막 신경절세포를 ON 세포, OFF세포, ON/OFF세포의 세가지 유형으로 분류할 수 있었으며, ON 세포: 35.0$\pm$4.4%, OFF 세포: 30.4$\pm$1.9%, ON/OFF 세포: 34.6$\pm$5.3% (전체 망막절편수=8)로 분포되어 있음을 확인하였다. 또한 상호상관(Cross-Correlation) 분석방법을 통해서 인접한 세포들끼리 매우 짧은 시간대에(<1 ms) 동기화된 흥분을 발사함을 확인할 수 있었고, 동기화된 흥분은 6~8개의 세포로 구성된 세포 클러스터에서 일어남을 확인하였다. 즉 개개의 신경절세포들이 빛 자극을 처리함에 있어 독립적으로 작용한다는 기존의 가정과는 달리 인접한 세포끼리는 동기화된 흥분을 보이는 것을 확인하였으며, 이러한 방식은 시세포 수와 신경절세포 수의 불균형으로 인해 초래되는 병목현상을 완화할 수 있는 효과적인 기전으로 생각된다. Retinal ganglion cells transmit visual scene as an action potential to visual cortex through optic nerve. Conventional recording method using single intra- or extra-cellular electrode enables us to understand the response of specific neuron on specific time. Therefore, it is not possible to determine how the nerve impulses in the population of retinal ganglion cells collectively encode the visual stimulus with conventional recording. This requires recording the simultaneous electrical signals of many neurons. Recent advances in multi-electrode recording have brought us closer to understanding how visual information is encoded by population of retinal ganglion cells. We examined how ganglion cells act together to encode a visual scene with multi-electrode array (MEA). With light stimulation (on duration: 2 sec, off duration: 5 sec) generated on a color monitor driven by custom-made software, we isolated three functional types of ganglion cell activities; ON (35.0$\pm$4.4%), OFF (31.4$\pm$1.9%), and ON/OFF cells (34.6$\pm$5.3%) (Total number of retinal pieces = 8). We observed that nearby neurons often fire action potential near synchrony (< 1 ms). And this narrow correlation is seen among cells within a cluster which is made of 6~8 cells. As there are many more synchronized firing patterns than ganglion cells, such a distributed code might allow the retina to compress a large number of distinct visual messages into a small number of ganglion cells.