사람의 백혈구 내에 있는 Elestase: 순수부리, 금속이온의 화학량, 그리고 Chelating 효과에 의한 활성도 조절

강구일(Koo-Il Kang) 대한약리학회 1988 대한약리학잡지 Vol.24 No.1

사람의 혈액으로부터 Elastase를 분리하는 새로운 방법을 개발하여 순도 높은 효소를 얻고 이 효소에 의하여 발생되어지는 질병의 예방과 치료에 응용하기 위하여 이 효소의 근본적인 성질규명을 시도하였다. 정제 방법으로는 Sephodex G-75를 이용한 1회의 액체 크로마토그라피와 HPLC을 이용한 2회의 코마토그라피를 거치는 2단계 방법을 사용하였다. 이때 얻어진 효소는 분자량이 26,000 ~ 29,700 사이에 있는 3개의 다른 분자량을 가진 물질로 확인되었으며, 항체 반응에서 사람의 결구내 Elastase의 특성을 나타내었다. 함유하고 있는 미량의 금속이온을 분석한 결과 정제하는 단계에 따라 Zn 이온의 효소분자에 대한비는 증가하였으며 가장 순수한 분자내의 효소분자와 Zn 이온과의 비는 1 : 2였다. 이 효소는 chelating agent에 의하여 활성도를 잃게 되었으며, 반대로 chelating agents에 의하여 활성도를 잃고 있는 반응 medium에 그 chelaing agents의 농도를 초과하는 2가 이온 즉 Zn 이온, Ca 이온, 그리고 Mn 이온을 넣으면 그 활성도는 원상복귀되나 Mg이온에 의하여는 그 활성도가 원상회복 되지 않았다. 이 모든 성질을 종합하면 사람의 Neutrophil granule에 있는 Elastase는 지금까지 알려진 바와 같이 Serine pretense임과 동시에 metalloenzyme으로 제고되어야 한다고 제안한다. 나아가서chelating agents에 의하여 이 효소의 활성도를 조정할 수 있다는 것은 이 효소에 의하여 일어나는 질병의 치료에 응용할 수 있는 가능성도 보여준다. Neutrophil elastases were purified by a three step procedure consiting of one Sephadex G-75 and two HPLC elutions. The elastases cross-reacted with antibodies to human neutrophil elastase. Three bands with molecular weights between 26,000 and 29,700 were observed by gel electrophoresis. At each stage of purification the quantity of Zn increased, reaching molar ratio of 2:1 with elastase in the most purified samples. Calcium content. was seletively elevated during the earlier stages of purification but decreased to a ratio of 0.25 to 1 with elastase at the final step of purfication. Neutrophil elastase could be inhibited by EDTA, EGTA and 1,10-phenanthroline. EGTA inhbition was noncompetitive inhibition and reversible only if the time of preincubation was relatively short, indicating the instability of the apoenzyme. The concentration of chelator required to show significant inhibition of elastase was also dependent upon the stage of purity and the ionic strength of the reaction mixture. Inhibition by EGTA, followed by the removal of EGTA, could be reversed by Zn. In the presence of EGTA the enzyme could be returened to full activity by the addition of Zn, Mn and Ca, but not Mg or Na. All of the above evidence strongly supports human neturophil elastase could be a metalloenzyme as well as a serine protease.

Purification and Characterization of Human Neutrophil Elastase and Cathepsin G

강구일,김사열,정혜영,배성준,Kang, Koo-Il,Ghim, Sa-Youl,Joung, Hye-Young,Bae, Sung-Jun 생화학분자생물학회 1989 한국생화학회지 Vol.22 No.4

사람의 중성구 elastase와 cathepsin G를 젤 여과법과 이온교환크로마토그라프에 의하여 분리하였다. 이들 두 효소는 각각 항체에 대한 특이한 면역반응을 보였다. Elastase의 분자량은 29K, 30K, 30.5K이며 cathepsin G의 분자량은 28.5K, 29K이었다. 이 두 효소들의 분자량보다 2 kilodalton 큰 분자들도 존재하나 이들 분자는 분자 내의 s-s 결합의 분해에 의한 SDS-PAGE상의 분자이동의 차이에서 생긴 현상으로 생각된다. 일가이온인 $Na^+$, $Li^+$, $K^+$ 및 $Cs^+$는 농도에 따른 elastase의 활성도에 영향을 주고 2가이온은 40 mM까지는 농도에 비례하여 활성도를 증가시키고 그 이후는 plateau에 도달하였다. lmM 미만의 DIFP, PMSF, ${\alpha}_1-PI$ 및 ${\alpha}_2-MG$은 사람 중성구 elastase의 활성도를 완전히 억제하였으나 같은 부류에 속하는 leupeptin은 별영향이 없었다. 이것으로 보아 elastase의 활성도 억제는 active site 이외의 다른 기전이 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다. Human neutrophil elastase(HNE) and human neutrophil cathepsin G (HNCG) were purified by a two-step procedure involving gel filtration through Ultrogel AcA54 and ion-exchange chromatography through CM-sephadex C-25. The purified elastase and cathepsin G cross-reacted with anti-HNE antibody and anti-HNCG antibody respectively. Three elastases have molecular weights of 29,000, 30,000, and 30,500 determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Two cathepsin Gs have the molecular weights of 28,500 and 29,000. There was another group of elastases which showed molecular weights of 2000 dalton higher than the other group of elastase. The discrepancy or the diversity of molecular weights of HNE seems to be caused mainly by the disparity of intra-molecular disulfide bonds of HNE. Monovalent ions including $Na^+$, $Li^+$, $K^+$ and $Cs^+$ stimulated HNE by concentration dependency. Divalent ions also stimulated HNE very effectively at the concentration of less than 40 mM and then reached the plateau. HNE was completely inhibited by less than 1 mM of diisopropyl fluorophosphate (DIFP), phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), ${\alpha}_1$-protease inhibitor $({\alpha}_1-PI)$, and ${\alpha}_2$-macroglobulin$({\alpha}_2-MG)$ which are catagorized as general endoprotease inhibitor. But leupeptin, which is known as serine and thiol-protease inhibitor, was ineffective on inhibition of HNE.

Inhibition of Human Neutrophil Elastase by NSAIDs and Inhibitors, and Molecular Pharmacological Mechanism of the Inhibition

강구일,김우미,홍인식,이무상,Kang, Koo-Il,Kim, Woo-Mi,Hong, In-Sik,Lee, Moo-Sang The Korean Society of Pharmacology 1996 대한약리학잡지 Vol.32 No.3

염증 질환의 원인이 되는 사람 중성구 elastases는 혈액에 존재하는 ${\alpha}_1-PI$나 ${\alpha}_2-macroglobulin$과 같은 단백질 분해효소 억제제에 의하여 조절되어진다. 그러나 특수한 병리적 상황에서 과다하게 분비되는 효소나 또는 단백질 분해효소 억제제의 비정상적 작용으로 말미암아 다양한 염증질환이 유발된다. 비스테로이드성 항염증제는 염증 질환을 치료하기 위하여 이미 임상에 적용 하고 있으며, prostaglandin 합성하는 효소인 cyclooxygenases의 활성도를 억제하는 것이 그 작용 기전으로 잘 알려져 왔다. 사람 중성구 elastase의 활성도는 naproxen, phenylbutazone, oxyphenbutazone 등에 의하여 억제되었으나, ibuprofen, ketoprofen, aspirin, salicylic acid, tolmetin 등에 의하여서는 억제되지 않았다. 또한 사람 중성구 elastase의 활성도는 EDTA, EGTA, tetracycline 등에 의하여서도 억제되었다. EDTA에 의하여 2가 이온 $Ca^{++}$나 $Zn^{++}$등을 elastase 분자로부터 일부 제거함으로 효소 활성도가 억제되었고 Raman spectra의 변화도 강하게 일어났으며, 금속이온 $Zn^{++}$를 새로 충진함으로 그 활성도는 원래대로 회복되고 Raman spectrum도 원래 상태와 유사한 상태로 회복되었다. 이런 현상은 chelator나 chelator-like agents가 효소분자안에 존재하는 $Zn^{++}$ 이온을 제거하거나 chelation함으로 활성 부위나 그 인접 부위의 4차원 구조의 변화를 일으켰음에 기인하며 특히 -C=O나 -COOH기의 관여에 의한 것으로 생각된다. Human neutrophil elastases (HNElastase, EC 3.4.21.37), a causative factor of inflammatory diseases, are regulated by plasma proteinase inhibitors, alpha-proteinase inhibitor and ${\alpha}_2-macroglobulin$. Under certain pathological conditions, however, released enzymes or abnormal function of inhibitors may cause various inflammatory disease. NSAIDs have been clinically applied for treatment of inflammatory diseases. Inhibition of cyclooxygenase is a known mechanism of action of NSAIDs in the treatment of inflammatory disease. In in vitro experiments, HNElastase was inhibited by naproxen, phenylbutazone, and oxyphenbutazone, but ibuprofen, ketoprofen, aspirin, salicylic acid, and tolmetin did not inhibit elastase. HNElastase was also inhibited by chelating agents, EDTA & EGTA, and tetracyclines. Removal of divalent metal ions by EDTA caused inhibition of elastase, and reconstitution of the metal ions recovered the enzyme activity to a certain level. Frequencies and contours in the Raman spectra of various conditions of human neutrophil elastase undergo drastic changes upon partial removal and/or reconstitution of calcium and zinc ions. The metal ion content dependent activities and change of the contour of the Raman spectrogram suggest us that the mechanism of action of a chelator or chelator-like agents on neutrophil elastase may be related to the conformational change at/or near the active site, especially -C=O radical or -COOH radical.

Human Neutrophil Elastase: Rapid Purification, Metal binding Stoichiometry and Modulation of the Activity by Chelating Agents

강구일,Kang, Koo-Il The Korean Society of Pharmacology 1988 대한약리학잡지 Vol.24 No.1

사람의 혈액으로부터 Elastase를 분리하는 새로운 방법을 개발하여 순도 높은 효소를 얻고 이 효소에 의하여 발생되어지는 질병의 예방과 치료에 응용하기 위하여 이 효소의 근본적인 성질규명을 시도하였다. 정제 방법으로는 Sephodex G-75를 이용한 1회의 액체 크로마토그라피와 HPLC을 이용한 2회의 코마토그라피를 거치는 2단계 방법을 사용하였다. 이때 얻어진 효소는 분자량이 $26,000{\sim}29,700$ 사이에 있는 3개의 다른 분자량을 가진 물질로 확인되었으며, 항체 반응에서 사람의 결구내 Elastase의 특성을 나타내었다. 함유하고 있는 미량의 금속이온을 분석한 결과 정제하는 단계에 따라 Zn 이온의 효소분자에 대한비는 증가하였으며 가장 순수한 분자내의 효소분자와 Zn 이온과의 비는 1 : 2였다. 이 효소는 chelating agent에 의하여 활성도를 잃게 되었으며, 반대로 chelating agents에 의하여 활성도를 잃고 있는 반응 medium에 그 chelaing agents의 농도를 초과하는 2가 이온 즉 Zn 이온, Ca 이온, 그리고 Mn 이온을 넣으면 그 활성도는 원상복귀되나 Mg이온에 의하여는 그 활성도가 원상회복 되지 않았다. 이 모든 성질을 종합하면 사람의 Neutrophil granule에 있는 Elastase는 지금까지 알려진 바와 같이 Serine pretense임과 동시에 metalloenzyme으로 제고되어야 한다고 제안한다. 나아가서chelating agents에 의하여 이 효소의 활성도를 조정할 수 있다는 것은 이 효소에 의하여 일어나는 질병의 치료에 응용할 수 있는 가능성도 보여준다. Neutrophil elastases were purified by a three step procedure consiting of one Sephadex G-75 and two HPLC elutions. The elastases cross-reacted with antibodies to human neutrophil elastase. Three bands with molecular weights between 26,000 and 29,700 were observed by gel electrophoresis. At each stage of purification the quantity of Zn increased, reaching molar ratio of 2:1 with elastase in the most purified samples. Calcium content. was seletively elevated during the earlier stages of purification but decreased to a ratio of 0.25 to 1 with elastase at the final step of purfication. Neutrophil elastase could be inhibited by EDTA, EGTA and 1,10-phenanthroline. EGTA inhbition was noncompetitive inhibition and reversible only if the time of preincubation was relatively short, indicating the instability of the apoenzyme. The concentration of chelator required to show significant inhibition of elastase was also dependent upon the stage of purity and the ionic strength of the reaction mixture. Inhibition by EGTA, followed by the removal of EGTA, could be reversed by Zn. In the presence of EGTA the enzyme could be returened to full activity by the addition of Zn, Mn and Ca, but not Mg or Na. All of the above evidence strongly supports human neturophil elastase could be a metalloenzyme as well as a serine protease.

사람의 중성구 elastase 와 cathepsin G 의 순수분리와 성질

강구일,김사열,정혜영,배성준 ( Koo Il Kang,Sa Youl Chim,Hye Young Joung,Sung Jun Bae ) 생화학분자생물학회 1989 BMB Reports Vol.22 No.4

Human neutrophil elastase(HNE) and human neutrophil cathepsin G (HNCG) were purified by a two-step procedure involving gel filtration through Ultrogel AcA54 and ion-exchange chromatography through CM-sephadex C-25. The purified elastase and cathepsin G cross-reacted with anti-HNE antibody and anti-HNCG antibody respectively. Three elastases have molecular weights of 29,000, 30,000, and 30,500 determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Two cathepsin Gs have the molecular weights of 28,500 and 29,000. There was another group of elastases which showed molecular weights of 2000 dalton higher than the other group of elastase. The discrepancy or the diversity of molecular weights of HNE seems to be caused mainly by the disparity of intra-molecular disulfide bonds of HNE. Monovalent ions including Na^+, Li^+, K^+ and Cs^+ stimulated HNE by concentration dependency. Divalent ions also stimulated HNE very effectively at the concentration of less than 40 mM and then reached the plateau. HNE was completely inhibited by less than 1 mM of diisopropyl fluorophosphate (DIFP), phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), α₁-protease inhibitor (α₁-PI), and α₂-macroglobulin (α₂-MG) which are catagorized as general endoprotease inhibitor. But leupeptin, which is known as serine and thiol-protease inhibitor, was ineffective on inhibition of HNE.

Inhibition of Human Neutrophil Elastase by Tetracyclines and Mechanism of the Inhibition

김우미,강구일,Kim, Woo-Mi,Kang, Koo-Il The Korean Society of Pharmacology 1993 대한약리학잡지 Vol.29 No.1

Tetracycline계 약제가, 류마치양 관절염을 비롯한 염증성 질환들의 주된 병인으로 알려지고있는 호중구 elastase의 활성도를 억제하였으며, 특히 oxytetracycline, demeclocycline, 그리고 tetracycline 등은 분자 구조적 차이에 따라 elastase의 효소 활성도에 대하여 다양한 억제율을 나타내었다. 측쇄 구조의 5번 위치에 $OH{^-}$기가 첨가된 oxytetracycline이 가장 높은 억제율을 나타내었다. 억제 양상에 있어서도 tetracycline이 비경쟁적 저해 형태를 보인 반면에, oxytetracycline은 경쟁적 저해 형태를 나타내었으며, Ki값은 각각 4.9mM과 0.39mM로 산출 되었다. 또한 항균 효과를 나타내는 활성 부위를 제거시킨 de-dimethylaminotetracycline을 합성하여 효소 활성도 억제 실험에 사용한 결과, tetracycline과 유사한 효소 억제 작용을 나타냄을 확인하였다. 이상의 연구 결과에서, tetracycline의 효소 활성도 억제 작용은 항균 효과를 나타내는 활성 부위와 상관없이 독립된 기전에 의해서 일어나는 약리 작용이며, 측쇄 구조의 $OH{^-}$기가 이 작용에 영향을 주는 일부 원인인 것으로 추정할 수 있으며, 이를 tetracycline계 약제가 염증 부위에서 나타내는 분자 단계에서의 새로운 약리 기전으로 제시하고자 한다. 또한 de-dimethylaminotetracycline은 항균제의 장기 사용시에 발생할 수 있는 저항균의 출현과는 무관하므로, 다른 부작용에 대한 연구가 선행될 경우, elastase에 의해 야기되는 만성 질환들의 치료제로써 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. Human neutrophil elastase (HNE, EC 3,4,21, 11), a mediator of tissue breakdown, was inhibited by tetracycline, oxytetracycline and demeclocycline. Among them, oxytetracycline showed the most potent inhibitory effect on the activity of HNE. IC50 of this drug at our specific condition was less than 1 mM. Tetracycline inhibited human neutrophil elastase non-competitively, and oxytetracycline inhibited competitively. Ki values of tetracycline and oxytetracycline were 4.9 mM and 0.39 mM, respectively. Structural modified tetracycline, de-dimethylaminotetracycline, which showed no antibiotic activity since the active dimethylamino radical was removed from the position #4 of the tetracycline, showed similar inhibition effect on the activity of human neutrophil elastase to that of tetracycline. Thus, we speculated that inhibition of human neutrophil elastase by tetracyclines was not depended on the dimethylamino radical which is a critical active site for antibiotic effect, rather it was depended on the hydoxyl radical of tetracyclines. Therefore, the property of inhibiting elastase may be an additional molecular biochemical mechanism of action of these drugs at the inflammatory sites.

Effects of Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs on the FMLP-Induced Migration of Neutrophil

김우미,강구일,Kim, Woo-Mi,Kang, Koo-Il The Korean Society of Pharmacology 1994 대한약리학잡지 Vol.30 No.1

본 연구는 7종의 비스테로이드성 항염증제가 FMLP에 의한 사람 중성구의 이동에 미치는 영향을 약물의 농도별로 관찰하고자, Hypaque-Ficoll step gradient centrifugation방법에 의하여 중성구를 분리하고, 48-well micro chemotaxis assembly를 이용하여 chemotactic assay를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. Oxyphenbutazone, phenylbutazone, zomepirac, ibuprofen은 약물의 치료 농도하에서 중성구의 이동에 대한 강력한 억제작용을 나타내었으며, indomethacin은 중성구의 이동을 오히려 증가시키는 작용을 나타내었다. 이 약제들은 모두 100uM미만의 약물 농도에서 각각 IC50를 나타내었으며, oxyphenbutazone, phenylbutazone은 10uM에서 최대 억제효과를 나타내었고, zomepirac, ibuprofen은 각각 0.luM과 100uM에서 가장 강한 억제 작용을 나타내었다. 또한 상기 약제를 FMLP와 함께 하단 구획에 첨가하였을 때에는 세포와 함께 상단구획에 첨가하였을 때와는 상이하게 세포의 이동에 전혀 영향을 미치지 못하였다. 이러한 결과는 이 약제가 FMLP와의 분자적 상호 작용을 통하여 FMLP의 작용을 저하시키는 것보다는 세포에 직접적인 영향을 미침으로서 세포의 이동을 억제하였음을 나타내어 준다. 이상의 연구 결과에서, oxyphenbutazone등의 약제가 100uM미만의 저농도에서 FMLP에 의한 중성구의 이동을 강력하게 억제하는 작용이 있음을 보고, 이 작용은 지금까지 비스테로이드성 함염증제의 작용 기전으로 말려진 cyclooxygenage 억제 작용과는 별개의 기전으로 사료되므로, 이를 상기 약제가 세포 수준에서 나타내는 제 2의 약리 기전으로 제시한다.denosine의 효과를 길항함을 볼 수 있었으나 $K{^+}$-통로 차단제인 glibenclamide는 adenosine의 효과에 영향을 미치지 못하였다. 8-Bromo-cAMP (100과 $300{\mu}M$) 그 자체로는 ACh 유리에 별다른 영향을 미치치 못하였으나 $300\;{\mu}M$ 8-bromo-cAMP 전처리에 의하여 $30\;{\mu}M\;adenosine$의 효과가 억제됨을 볼 수 있었다. 이상의 실험결과로 흰쥐 해마에서 $A_1-adenosine$ 수용체를 통한 adenosine의 ACh유리 감소는 G-단백에 의존적이며, 이러한 효과에 nifedipine에 예민한 $Ca^{++}$-통로와 adenylate cyclase계가 일부 관여함은 확실하나 proteinkinase C 및 glibenclamide에 예민한 $K{^+}$통로는 관여하지 않는 것으로 사료된다.(新稱), Phellinus pomaceus), 회주름구멍버섯(신칭(新稱), Antrodia crassa), 층주름구멍버섯(신칭(新稱), Antrodia serialis), 흰그물구멍버섯(신칭(新稱), Ceriporia reticulata), 겹친손등버섯(신칭(新稱), Oligoporus balsameus), 점박이손등버섯(신칭(新稱), Oligoporus guttulatus), 무른흰살버섯(신칭(新稱), Oxyporus cuneatus), 각목버섯(신칭(新稱), Rigidoporus microporus), 및 주름옷솔버섯(신칭(新稱), Trichaptum laricinum)으로서 우리말 이름과 영문 기재(記載)와 함께 우리나라의 균류목록(菌類目錄)에 새로이 추가되었다. 이였으며, White+NAA Enhancement or diminution of leukocyte migration to the specific site might be important factors for the development of inflammatory diseases. To investigate the effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) on chemotaxis of neutrophil, we obtained neutrophils by Hypaque-Ficoll step gradient centrifugation and tested the effects of seven drugs on the n-formyl-leucyl-phenylalanine (FMLP)-induced migration of neutrophil using a 48-well micro chemotaxis assembly. Oxyphenbutazone, phenylbutazone, sulindac, zomepirac, and ibuprofen suppressed the migration of neutrophil at the therapeutic concentrations, however, indomethacin showed stimulation effect. IC50s for inhibition of neutrophil migration by these drugs are less than 100uM. When drugs were preincubated with FMLP, no inhibition on migration of neutrophil was observed. These results indicated that inhibitory effects of these drugs on migration of neutrophil might be related to the receptor sites of neutrophil rather than molecular inactivation of chemoattractant (FMLP). In conclusion, we suggested that the property of inhibition effects on neutrophil migration of several NSAIDs might be another mode of pharmacological action for anti-iflammatory effect, which showed significant effects at concentrations below therapeutic levels, in addition to cyclooxygenase inhibition.

NSAIDs (Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs)에 의한 사람 중성구 Cathepsin G의 활성도 억제

배성준,감사열,강구일,Bae, Sung-Jun,Ghim, Sa-Youl,Kang, Koo-Il The Korean Society of Pharmacology 1990 대한약리학잡지 Vol.26 No.1

사람 중성구내의 azurophil granule 내에 존재하는 serine protease인 cathepsin G는 정상 반응에서는 항 박테리아 작용을 나타내는데 관여하지만, 이들의 효소활성이 비정상적으로 증가되었을 때는 오히려 인체 정상 조직을 파괴함으로써 rheumatoid arthritis를 비롯한 여러가지 염증성 질환을 야기시킨다고 알려져 있다. 항염증제로 작용하는데 있어서 prostaglandin 합성을 억제하는 작용 이외에 다른 작용 기전이 있는가 하는것은 대단히 흥미있는 연구 과제이었으므로 neutral protease 중의 하나인 cathepsin G와 이 염증반응에 직접적으로 관여하는지 알아보기 위하여 본 연구에서는 두 단계의 크로마토그라피를 거쳐 순수한 cathepsin G를 분리하고, 여러가지 비스테로이드성 항염증제를 이용하여 cathepsin G에 대한 억제 정도를 관찰하였다. 이중 sulindac, salicylate, phenylbutazone, oxyphenbutazone 그리고 salicyluric acid가 각각 4.3mM, 14.3mM, 6.5mM, 11mM, 15mM의 $IC_{50}$로써 cathepsin G의 활성도를 억제하였다. 따라서 NSAIDs의 항염증 작용 기전은 기존에 알려지고 있는 cyclooxygenase 억제에 따른 prostaglanndin 합성, 분비 억제 기전이외에 rheumatoid arthritis 부위에 직접적 원인으로 작용할 가능성이 있는 cathepsin G를 억제 함으로써 조직 파괴를 막는 역할을 하고 있을 가능성이 있는 것으로 사료된다. Human leukocyte cathepsin-Gs are active participant in the active phase of inflammations like rheumatoid arthritis, emphysema and glomerular injury. Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) are widely used for treatment of these inflammatory diseases. Mechanism of action of NSAIDs for treatment of inflammatory diseases, especially like rheumatoid arthritis, are known as the inhibitors of prostaglandin synthesis. Inhibitions of the activities of human leukocyte cathepsin-Gs by non-steroidal anti-inflammatory drugs, however, were not same as the known pharmacological effects (inhibition of cyclooxygenase) of these drugs. Among them, especially, sulindac, salicylate, phenylbutazone, oxyphenbutazone, and salicyluric acid inhibited human leukocyte cathepsin-Gs effectively. $IC_{50}s$ of each drug were 4.3mM, 14.3mM, 6.5mM, 11mM and 15mM respectively. The drugs which have same chemical structure and same degree of inhibition effect on cyclooxygenase showed different degree or no effect on inhibition of cathepsin G. These inhibition effect might be, beside of inhibition of cyclooxygenase in the prostaglandin synthesis pathway, another benefitial antiinflammatory effect of NSAIDs by direct protection against tissue destruction in inflammatory diseases.

Human Neutrophil Cathepsin G: In Vivo Synthesis of Anti-HNCG Antibody, Inhibition of the Activity of HNCGs and Mechanism of the Inhibitions

배성준,김우미,김기찬,장명웅,강구일,Bae, Sung-Jun,Kim, Woo-Mi,Kim, Ki-Chan,Chang, Myung-Woong,Kang, Koo-Il The Korean Society of Pharmacology 1991 대한약리학잡지 Vol.27 No.2

염증성 질환의 원인 인자중 하나로 알려진 사람 호중구 Cathepsin G를 두단계의 크로마토그라피를 거쳐 분리하였다. 이 순수 분리된 효소를 이용하여 토끼에서 항체를 In Vivo 합성하고 그 혈액으로부터 순수 항체를 분리하였다. NSAIDs 약제중 phenylbutazone, sulindac, oxyphenbutazone, salicilic acid등은 이 효소를 강력하게 억제하였으며 $IC_{50}$은 $0.3{\sim}0.8\;mM$ 이었다. 고려인삼의 지용성분획도 tetracycline, novobiosin, rifamycin이 Cathepsin G의 효소 활성도에 대해서 강력한 억제 작용을 나타내었으나 다른 항생제는 그 작용이 무시할 수 있을 정도였다. 그러나 tetracycline계열의 항생제의 경우 실제 치료 효과를 나타내는 혈중농도에서 강한 억제 작용을 보였다. 특히 항균 작용과 관계하는 tetracycline의 4번 위치의 N-dimethy radical을 제거한 tetracycline은 감염군의 약제 저항성을 피할 수 있을 것으로 생각되므로 만성 염증성질환의 장기 치료에 이용될 수 있는 새로운 약제로써 제시한다. Human neutrophil cathepsin-G, which has been known as one of the active enzymes causing inflammatory diseases, was purified by two steps procedure involving one size exclusion (Ultorogel AcA54) and one ion exchange (CM-Sephadex) chromatography. Purified HNCGs were cross-reacted with Anti-HNCathepsin-G antibodies which were radised in rabbits and purified by cathepsin-G labeled Sepharose 4B affinity chromatography. HNCGs were effectively inhibited by NSAIDs including phenylbutazone, sulindac, oxyphenbutazone, salicylic acid and salicyluric acid. $IC_{50}_s$ of these drugs for inhibition of Cathepsin G were 0.3-0.8 mM. Other NSAIDs including aspirin showed little or no inhibition effect on the activity of Cathepsin G. These results strongly indicated that NSAIDs which showed inhibition effect on the activity of HNCGs possibly be at least a part of mechanism of action which might be related to direct inhibition of cathepsin G at the tissue destruction sites beside of their known mechanism of action as an anticyclo-oxygenase in treatment of inflammatory diseases. Lipid soluble component of Korean Red Ginseng which was known as an anti-inflammatory agent inhibited HNCGs strongly, but no other fractions did inhibited HNCGs. Antibiotics including novobiosin and rifamycin showed some inhibition effect on HNCGs, i. e.., $IC_{50}$ of these drugs were 2.6 mM and 1.5 mM respectively, and other antibiotics including penicillin G showed no or negligible inhibition effect on the activity of HNCGs. However. tetracyclines inhibited HNCGs very effectively at the concentration of therapeutic range. The inhibition effect of the activity of HNCGs by tetracycline are not related to the N-dimethyl radical on the 4 position of the tetracycline molecule. Furthermore, N-dedimethylated tetracyclines may have beneficial effect for long term treatment of chronic inflammatory diseases without developing any drug resistance to microorganisms.

비스테로이드성 항염증제가 FMLP에 의한 사람 중성구의 이동에 미치는 영향

김우미(Woo Mi Kim),강구일(Koo-il Kang) 대한약리학회 1994 대한약리학잡지 Vol.30 No.1

본 연구는 7종의 비스테로이드성 항염증제가 FMLP에 의한 사람 중성구의 이동에 미치는 영향을 약물의 농도별로 관찰하고자, Hypaque-Ficoll step gradient centrifugation방법에 의하여 중성구를 분리하고, 48-well micro chemotaxis assembly를 이용하여 chemotactic assay를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. Oxyphenbutazone, phenylbutazone, zomepirac, ibuprofen은 약물의 치료 농도하에서 중성구의 이동에 대한 강력한 억제작용을 나타내었으며, indomethacin은 중성구의 이동을 오히려 증가시키는 작용을 나타내었다. 이 약제들은 모두 100uM미만의 약물 농도에서 각각 IC50를 나타내었으며, oxyphenbutazone, phenylbutazone은 10uM에서 최대 억제효과를 나타내었고, zomepirac, ibuprofen은 각각 0.luM과 100uM에서 가장 강한 억제 작용을 나타내었다. 또한 상기 약제를 FMLP와 함께 하단 구획에 첨가하였을 때에는 세포와 함께 상단구획에 첨가하였을 때와는 상이하게 세포의 이동에 전혀 영향을 미치지 못하였다. 이러한 결과는 이 약제가 FMLP와의 분자적 상호 작용을 통하여 FMLP의 작용을 저하시키는 것보다는 세포에 직접적인 영향을 미침으로서 세포의 이동을 억제하였음을 나타내어 준다. 이상의 연구 결과에서, oxyphenbutazone등의 약제가 100uM미만의 저농도에서 FMLP에 의한 중성구의 이동을 강력하게 억제하는 작용이 있음을 보고, 이 작용은 지금까지 비스테로이드성 함염증제의 작용 기전으로 말려진 cyclooxygenage 억제 작용과는 별개의 기전으로 사료되므로, 이를 상기 약제가 세포 수준에서 나타내는 제 2의 약리 기전으로 제시한다. Enhancement or diminution of leukocyte migration to the specific site might be important factors for the development of inflammatory diseases. To investigate the effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) on chemotaxis of neutrophil, we obtained neutrophils by Hypaque-Ficoll step gradient centrifugation and tested the effects of seven drugs on the n-formyl-leucyl-phenylalanine (FMLP)-induced migration of neutrophil using a 48-well micro chemotaxis assembly. Oxyphenbutazone, phenylbutazone, sulindac, zomepirac, and ibuprofen suppressed the migration of neutrophil at the therapeutic concentrations, however, indomethacin showed stimulation effect. IC50s for inhibition of neutrophil migration by these drugs are less than 100uM. When drugs were preincubated with FMLP, no inhibition on migration of neutrophil was observed. These results indicated that inhibitory effects of these drugs on migration of neutrophil might be related to the receptor sites of neutrophil rather than molecular inactivation of chemoattractant (FMLP). In conclusion, we suggested that the property of inhibition effects on neutrophil migration of several NSAIDs might be another mode of pharmacological action for anti-iflammatory effect, which showed significant effects at concentrations below therapeutic levels, in addition to cyclooxygenase inhibition.