유전자 진단을 위한 초내열성 DNA ligase의 개발

전숭종 동의대학교 산업기술개발연구소 2005 産業技術硏究誌 Vol.19 No.-

The ligase chain reaction (LCR)[1] is a DNA amplification technique which can be used to detect trace levels of known nucleic acid sequences. Use of a thermostable DNA ligase allows the LCR reaction to be cycled easily in conventional thermocyclers. We have developed an extremely thermostable DNA ligase (Ape ligase) from a hyperthermophilic archaeon Aeropyrum pernix K1. The new ligase remained stable for ~1 h at 100 ℃, and the half-life was about 1 h even at 105 ℃. It will provide enhanced product yields and shorter diagnostic times in the LCR reaction.

Cloning and Expression of a Full-Length Glutamate Decarboxylase Gene from Lactobacillus brevis BH2

전숭종,김연희,남수완,Se-Hee Kim,Bo-Hye Shin 한국생물공학회 2007 Biotechnology and Bioprocess Engineering Vol.12 No.6

A bacterium (BH2) that was found to produce a large amount of γ-aminobutyric acid (GABA) was isolated from Kimchi, a traditional fermented food in Korea. Phylogenetic analysis based on the 16S rDNA sequence and biochemical studies indicated that BH2 belonged to the genus Lactobacillus brevis. Under controlled conditions in MRS broth (Difco) with 5% monosodium glutamate, this strain produced GABA at a concentration of 194 mM with a 73% GABA conversion rate after 48 h. A full-length glutamate decarboxylase (gad) gene was cloned by the rapid amplification of cDNA ends (RACE) PCR. The open reading frame (ORF) of the gad gene was composed of 1,407 nucleotides and encoded a protein (468 amino acids) with a predicted molecular weight of 53.5 kDa. The deduced amino acid sequence of GAD from L. brevis showed 97.5 and 82.7% identities to the L. brevis OPK-3 GAD and L. plantarum WCFS1 GAD, respectively. The gad gene was expressed in Escherichia coli cells and the expression was confirmed by SDS-PAGE analysis and enzyme activity studies.

메밀 및 다시마를 포함하는 유산균 발효액의 생리적 기능

전숭종(Sung-Jong Jeon),김애령(Ae-Ryoung Kim),이종환(Jong-Hwan Lee) 한국생명과학회 2015 생명과학회지 Vol.25 No.10

본 연구에서는 각종 곡물(메밀, 귀리, 검은깨, 검은콩, 율피, 현미, 보리, 들깨, 밀) 및 다시마를 포함하는 Lactobacillus brevis AR1의 발효물 중에서 섬유아세포의 콜라겐 합성을 촉진하는 화장품 소재를 조사하였다. 그 결과 메밀 및 다시마를 포함하는 Lb. brevis AR1의 발효물을 처리한 섬유아세포에서 효과적으로 콜라겐 합성이 증가하였다. 특히, 다시마 함유 Lb. brevis AR1의 발효물은 양성 대조구인 β-glucan 보다 높은 콜라겐 합성능을 나타내었다. Lb. brevis AR1은 메밀 또는 다시마와 함께 4% MSG를 첨가한 배지에서 72시간 배양한 후, 180 mM의 GABA를 생산하여 84.5%의 GABA 전환율을 나타내었다. 메밀 및 다시마를 포함하는 Lb. brevis AR1의 발효물은 생쥐 피부의 염증 반응을 감소시키는 효과를 가졌고 섬유아세포에서는 세포 독성을 나타내지 않았다. 이 결과들은 메밀 및 다시마를 포함하는 Lb. brevis AR1의 발효물이 피부 주름 개선과 항염증 효과를 가지는 기능성 화장품 소재로서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. In this study, we investigated the potential of Lactobacillus brevis AR1 fermented broth containing various grains (Fagopyrum esculentum, Scotch oat, Sesamum indicum, Glycine max Merr, Castanea crenata, Oryza sativa L., Hordeum vulgare L., Perilla frutescens var. japonica Hara, or Triticum aestivum L.) or Saccharina japonica as a source of collagen synthesis in cosmetic products. The treatment of Lb. brevis AR1 fermented broths containing F. esculentum or S. japonica water extracts was markedly increased the synthesis of collagen in fibroblasts. The collagen synthesis capacity of the S. japonica fermentation product was higher than that of β-glucan, which was used as a positive control. Under controlled conditions in broths containing F. esculentum or the S. japonica extracts with 4% monosodium glutamate(MSG), Lb. brevis AR1 produced γ-aminobutyric acid (GABA) at a concentration of 180 mM, with an 84.5% GABA conversion rate after 72 h. Both the F. esculentum and S. japonica fermentation broths produced by Lb. brevis AR1 reduced inflammatory responses on mouse skin and did not show cell cytotoxicity in fibroblasts. These results suggest that both the F. esculentum and S. japonica fermentation products of Lb. brevis AR1 could be used as functional materials in cosmetic products to combat wrinkles and skin inflammation.

Thermus thermophilus HJ6 유래 N-말단 결실 DNA Polymerase의 정제 및 특성

전숭종 ( Sung Jong Jeon ),서민호 ( Min Ho Seo ) 한국미생물생명공학회 2010 한국미생물·생명공학회지 Vol.38 No.2

수소생산균 Enterobacter sp. ES392의 분리 및 배양조건

전숭종 ( Sung Jong Jeon ),이언석 ( Eon Seok Lee ) 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 2010 한국미생물·생명공학회지 Vol.38 No.4

수소 생산 균주 ES392는 부산 소재 동의대학교에 위치한 연못 담수에서 분리하였다. 세포는 직경 0.6μm, 길이 1.4μm의 간균이고 편모와 포자를 형성하지 않았다. 분리된 균주의 16s rRNA 염기서열과 생화학적 특성을 바탕으로 계통 학적으로 분류한 결과, ES392 균주는 Enterobacter sp.에 속하는 것으로 동정되었다. 수소생산을 위한 생육최적 pH와 온도는 각각 7.5와 35oC이었다. 분리한 Enterobacter sp. ES392 균주의 수소생산을 최대화 하기 위해 배지성분을 최적화하였다. 그 결과 4%(w/v) sucrose, 0.5%(w/v) yeast extract, 50mM potassium phosphate를 첨가한 배지 조건에서 최대수소생산량을 나타내었다. 회분식 배양 조건에서 최대 수소 생산량은 3481mL/L이었고, 수소생산수율은 1.33mol/mol sucrose를 나타내었다. A hydrogen-producing bacterium (strain ES392) was isolated from pond water located in the Dong-Eui University, Busan, Korea. The cell was long-rod type (1.4μm) of about 0.6μm in diameter, and not formed flagellum and spore. Phylogenetic analysis based on the 16S rRNA sequence and biochemical studies indicated that ES392 belonged to the genus Enterobacter sp. The optimum pH and temperature for hydrogen production was 7.5 and 35oC, respectively. The optimization of medium compositions which maximize hydrogen production from Enterobacter sp. ES392 was determined. As a result, the maximum hydrogen production was obtained under the conditions of 4% (w/v) sucrose, 0.5% (w/v) yeast extract and 50mM potassium phosphate buffer (pH 7.5). Under batch culture conditions, the maximal hydrogen production and yield were obtained as 3481mL/L and 1.33mol/mol sucrose, respectively.

Trametes velutina JS18 유래 멜라닌 탈색 효소의 생산, 정제 및 특성

전숭종 ( Sung-jong Jeon ),김태윤 ( Tae-yun Kim ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2020 한국미생물·생명공학회지 Vol.48 No.4

삼림지역의 고목에서 분리한 JS18 균주는 합성 멜라닌을 탈색하는 세포 외 분비효소를 생산했다. JS18 균주의 internal transcribed spacer (ITS) 염기서열을 분석하고 계통학적으로 확인한 결과 본 균주는 Trametes velutina로 동정되었다. JS18 균주는 laccase 활성을 나타냈지만 manganese peroxidase 및 lignin peroxidase 활성은 나타내지 않았다. 본 균주를 회분배양한 결과 멜라닌 탈색 활성은 laccase 활성으로부터 유래하는 것으로 확인되었다. Laccase 유도인자로써 Syringic acid 및 CuSO4를 첨가하고 25℃에서 7일간 배양한 결과 배양상등액에서 98 U/ml의 laccase 활성을 나타내었다. GYP 배지에서 배양한 T. velutina의 배양상등액에서 ammonium sulfate 침전, Hi-trap Q Sepharose 컬럼 및 gel filtration을 이용하여 효소를 정제하였고, SDS-PAGE에서 약 67 kDa의 분자량을 나타내었다. 정제된 효소의 멜라닌 탈색율은 효소 단독으로는 24 시간 만에 단지 4% 만을 나타내는 반면, HBT의 존재 하에서는 80%로 향상되었다. 또한 1.5 mM HBT의 농도에서는 최대 81%의 멜라닌 탈색율을 나타내었다. 본 효소의 멜라닌 탈색에 대한 최적 pH 및 온도는 각각 5.0와 37℃를 나타내었다. 본 연구에서는 T. velutina JS18 유래 laccase가 촉매하는 멜라닌 탈색 반응에서 redox mediator로써 HBT의 적용 가능성을 확인하였다. The JS18 strain was isolated from an old tree forest and produced extracellular enzymes that decolorize synthetic melanin. Phylogenetic analysis, based on the internal transcribed spacer (ITS) sequence, indicate that JS18 belongs to the Trametes velutina species. JS18 demonstrated laccase activity but no manganese peroxidase or lignin peroxidase activity. Batch culture indicated that the melanin decolorization activity of JS18 strain originated from the laccase. Syringic acid and CuSO₄ induced maximum laccase production, yielding 98 U/mL laccase activity after cultivation for 7 days at 25℃. T. velutina secretes an extracellular laccase in GYP medium, and this enzyme was purified using (NH₄)₂SO₄ precipitation, Hi-trap Q Sepharose columns and gel filtration. The molecular weight of the purified enzyme was estimated to be 67 kDa using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. This enzyme produced 80% of its melanin decolorization activity within the first 24 h of evaluation in the presence of 1-hydroxybenzotriazole (HBT), while only about 4% of the melanin was decolorized in the absence of the mediator. The greatest decolorization was observed at 1.5 mM/l HBT, which decolorized 81% of the melanin within the first 24 h. The optimum pH and temperature for this decolorization were found to be 5.0 and 37℃, respectively. Our results suggest the possibility of applying HBT induced T. velutina JS18 laccase-catalyzed melanin decolorization.

내열성 extracellular lipase 생산을 위한 Geobacillus kaustophilus DSM 7263의 배양조건

Sung-Jong Jeon(전숭종),Hyun-Woo Kang(강현우) 한국생명과학회 2010 생명과학회지 Vol.20 No.6

고온성 균주로 알려진 Geobacillus 속의 다양한 균주로부터 내열성 extracellular lipase를 생산하는 G. kaustophilus DSM 7263를 선별하였다. 우리는 본 균주로부터 lipase를 대량생산하기 위한 최적 조건을 조사하였다. 배양 배지에 다양한 천연오일을 첨가한 결과, lipase의 최적 생장을 위한 탄소원으로는 0.5% 올리브 오일이 최적 조건으로 확인되었다. 본 균주의 생장을 위한 최적온도와 pH는 각각 55℃와 8.0인 반면, lipase 생산을 위한 최적 온도와 pH는 각각 50℃와 6.0을 나타내어 최적생육조건과는 다른 양상을 나타내었다. 금속이온에 대한 영향에 대해서는 배지에 Mg<SUP>2+</SUP>과 Mn<SUP>2+</SUP>을 첨가한 경우 각각 247%와 157%의 효소 생산이 증가한 반면, Co<SUP>2+</SUP>, Fe<SUP>2+</SUP>, Ni<SUP>2+</SUP>, Cu<SUP>2+</SUP>는 효소 생산을 저해 하였다. 또한 0.1% (v/v) triton X-100을 첨가하면 대조구에 비해 효소생산과 균의 생장이 모두 증가하는 것으로 나타났다. A producer of thermophilic extracellular lipase, Geobacillus kaustophilus DSM 7263, was selected from various microorganisms of the Geobacillus genus. We investigated optimum conditions for mass production of G. kaustophilus lipase. Among the different natural oil media, olive oil was optimal for enzyme production. The maximum amount of enzyme production was obtained when G. kaustophilus was grown in a medium containing 0.5% olive oil as a carbon source. The pH and temperature for optimal growth were pH 8.0 and 55℃, respectively, while the optimum pH and temperature for lipase production were pH 6.0 and 50℃, respectively. In the presence of Mg<SUP>2+</SUP> and Mn<SUP>2+</SUP>, lipase production was dramatically enhanced by 247% and 157%, respectively, whereas enzyme production was inhibited by Zn<SUP>2+</SUP>, Cu<SUP>2+</SUP>, and Cd<SUP>2+</SUP>. The addition of 0.1% (v/v) triton X-100 increased lipase production and cell growth when compared to the negative control.

Saccharomyces cerevisiae에서 Paenibacilius macerans 유래 cycloinulooligosaccha-ride fructanotransferase의 발현

김현철,김정현,전숭종,최우봉,남수완,Kim Hyun-Chul,Kim Jeong-Hyun,Jeon Sung-Jong,Choi Woo-Bong,Nam Soo-Wan 한국생명과학회 2005 생명과학회지 Vol.15 No.3

Paenibacillus macerans 유래의 cycloinulooligosaccharide fructanotransferase (CFTase) 유전자(cft)를 Saccharomyces cerevisiae SEY2102에 발현시키기 위해 대장균과 효모의 shuttle vector인 pYES2.0에 subcloning 하였다. 구축된 pYGECFTN (8.6 kb) plasmid를 S. cerevisiae SEY2102에 형질전환하였고, uracil이 결핍된 SD 배지에서 선별하였다. cft 유전자는 선별된 형질전환체(S. cerevisiae SEY2102/pYCECFTN)에서 GAL1 promoter 조절하에 성공적으로 발현되어 cyclofructan(CF)을 생성함을 TLC로 확인하였다. 그러나, 균체 외로의 효소 분비는 이루어지지 않았고 cytoplasm보다 periplasmic space에 많이 존재하였다 S. cerevisiae에서 발현된 P. polymyxa유래 CFTase보다 P. macerans 유래 CFTase의 CF 생성이 image analyzer로 확인한 결과, 더 많음을 알 수 있었다. 효소반응 5분째부터 CF가 생성됨을 확인하였고, 최적온도와 최적 pH는 각각 $45^{\circ}C$와 pH 8.0로 나타났으며, $55^{\circ}C$까지 효소활성이 안정적으로 유지되었다. Dahlia tubers, chicory root, Jerusalem artichoke 등의 inulin 기질에 따른 반응산물 분석 결과, 모든 기질로부터 CF가 생산되었으며, dahlia tubers와 Jerusalem artichoke로부터 가장 효과적으로 생성되었다. The cycloinulooligosaccharide fructanotransferase (CFTase) gene (cft) from Paenibacillus macerans was subcloned into an E. coli-yeast shuttle vector, pYES2.0, resulting in pYGECFTN. The plasmid pYGECFTN (8.6 kb) was introduced into Saccharomyces cerevisiae SEY2102 cells and then the transformants were selected on the synthetic defined media lacking uracil. The cft gene expression in yeast transformant was demonstrated by the analyses cyclofructan (CF) spots on thin-layer chromatogram. The recombinant CFTase was not secreted into the medium and localized in the periplasmic space. The production of CF was observed after 5 min of the enzymatic reaction with inulin. The optimun pH and temperature for CF production were found to be at pH 8.0 and $45^{\circ}C$, respectively. Enzyme activity was stably maintained up to $55^{\circ}C$. The CF was produced from all inulin sources and was most efficiently produced from dahlia tubers and Jerusalem artichokes.

Large-scale synthesis of ribonucleic acids using the bacteriophage T7 RNA polymerase

김동은,김기선,전숭종 동의대학교 산업기술개발연구소 2005 産業技術硏究誌 Vol.19 No.-

The in vitro T7 transcription system allows one to synthesize biochemical amounts of RNA molecules functionally equivalent or similar to those transcripts normally existing at extremely low levels in vivo. In this study we described a modified method for efficient large-scale preparation of pure '17 RNA polymerase from the recombinant Escherichia coli strain BL21/pAR1219. The procedure, which used ammonium sulfate fractionation and preparative column chromatography on sephadex SP, was shown to be simple, rapid, and cost effective in comparison with other methods reported previously. Using the purified T7 RNA polymerase we were able to synthesize very long RNA transcripts of 1.54 kb length with a large amount, which is not feasible by conventional chemical synthesis.

Effect of temperature and denaturation conditions on protein folding assisted by GroEL-GroES chaperonin

배유진,장경진,전숭종,남수완,이재형,김영만,김동은,Bae, Yu-Jin,Jang, Kyoung-Jin,Jeon, Sung-Jong,Nam, Soo-Wan,Lee, Jae-Hyung,Kim, Young-Man,Kim, Dong-Eun Korean Society of Life Science 2007 생명과학회지 Vol.17 No.2

이 연구의 목적은 대장균 분자 샤페론 GroEL의 시험관 내 단백질 접힘에 있어서 반응온도의 영향과 보조샤페론의 필요 여부를 자발적 재접힘이 가능한 온도와 그렇지 않은 온도조건에서 조사하는 것이다. 여러 조건하에서 GroEL에 의한 두 가지 기질 단백질의 재접힘을 반응속도론적으로 조사하기 위하여 GroEL에 의한 단백질 침전생성억제와 변성된 단백질의 재접힘을 광범위하게 조사하였다. 자발적 재접힘이 가능하지 않은 $37^{\circ}C$에서는 ATP와 완전한 GroEL 시스템이 변성된 폴리펩티드의 재접힘을 위하여 필요하다는 것을 확인하였다. 하지만, 자발적 재접힘이 가능한 낮은 온도에서는 자발적 재접힘과 샤페론 의존적 단백질 재접힘이 서로 경쟁하는 것을 알 수 있었다. 따라서 GroEL은 변성된 폴리펩티드의 자발적 접힘 경로를 더 효율적인 단백질 재접힘 경로인 샤페론 의존적 단백질 재접힘 경로로 유도하는 것으로 보인다. The goal of this study is to investigate effects of temperature and co-chaperonin requirement for in vitro protein refolding assisted by E. coli chaperone GroEL under permissive and nonpermissive temperature conditions. In vitro protein refolding of two denatured proteins was kinetically investigated under several conditions in the presence of GroEL. Effects of temperature and GroES-requirement on the process of prevention of protein aggregation and refolding of denatured protein were extensively monitored. We have found that E. coli GroEL chaperone system along with ATP is required for invitro refolding of unfolded polypeptide under nonpermissive temperature of $37^{\circ}C$. However, under permissive condition spontaneous refolding can occur due to lower temperature, which can competes with chaperone-mediated protein refolding via GroEL chaperone system. Thus, GroEL seemed to divert spontaneous refolding pathway of unfolded polypeptide toward chaperone-assisted refolding pathway, which is more efficient protein refolding pathway.