Partial Purification of apolipophorin-III in Galleria mellonella

윤화경 한서대학교 산학협력연구원 부설 환경연구소 1988 환경연구소 논문집 Vol.1 No.-

꿀벌부채명나방(Galleria mellonella L.)의 종령유충혈림프에서 아포리포포린-Ⅲ를 부분정제하여 이들의 분자량을 조사하였다. 아포리포포린-Ⅲ의 정제는 gel filtration (Sephadex G-100, G-50)과 ion exchange chromatography(CM-52)로 분리한 후, 이들의 순수도를 12% SDS-PAGE로 확인하였다. 정제된 아포리포포린-Ⅲ의 분자량은 약 18kDa로 측정되었다. Apolipophorin-Ⅲ(ApoLp-Ⅲ) was partially purified from last instar larval hemolymph of Galleria mellonella and their molecular weight was investigated. ApoLp-Ⅲ purification was performed by gel permeation chromatography(Sephadex G-100, G-50) followed by ion exchange chromatography(CM-52) and their purity was confirmed on 12% SDS-PAGE. ApoLp-Ⅲ has the molecular weight of 18kDa.

Biosynthesis of apolipophorin-Ⅲ in Galleria mellonella L

윤화경 한서대학교 산학협력연구원 부설 환경연구소 1999 환경연구소 논문집 Vol.2 No.-

꿀벌부채명나방(Galleria mellonella L.)의 종령유충혈림프에서 아포리포포린-Ⅲ를 정제하여 이외 분자량 및 생합성 장소를 조사하였다. 아포리포포린-Ⅲ의 정제는 gel filtration (Sephadex G-100), ion exchange chromatography(DE-52)한 후, 아포리포포린-Ⅲ가 존재하는 부분율 90℃에서 30분간 열처리하여, Mono S FPLC로 분리한 후, 이들의 순수도를 SDS-PAGE로 확인하였다. 정제된 아포리포포린-Ⅲ의 분자량은 약 18kDa로 측정되었다. 또한 아포리포포린-Ⅲ는 유충 지방체에서 뿐만 아니라 용 시기의 난소에서도 합성이 되었다. Apoplipophorin-Ⅲ(ApoLp-Ⅲ) was purified from last instar larval hemolymph of Galleria mellonella and its molecular weight and biosynthetic place were investigated. The purification of the apoLp-Ⅲ was performed by gel permeation chromatography(Sephadex G-100), ion exchange chromatography(DE-52), heat-treatment(90℃ for 30min) and Mono S FPLC and their purity was confirmed on SDS-PAGE. ApoLp-Ⅲ has the molecular weight of 18kDa. Also, apoLp-Ⅲ is synthesized in larval fat body as well as pupal ovaries.

꿀벌부채명나방 종령 유충 지방체에 의한 아포리포포린-III의 흡수

윤화경(Yun, Hwa-Kyung) 한국산학기술학회 2013 한국산학기술학회논문지 Vol.14 No.8

아포리포포린-III (apoLp-III)를 꿀벌부채명나방 종령 유충 혈림프에서 KBr 농도구배 초원심분리와 겔크로마 토그래피 (Sephadex G-100)를 이용하여 분리, 정제하였다. 본 연구에서는 아포리포포린-III가 꿀벌부채명나방의 종령 유충 지방체에 의해 흡수되는 지를 조사하였다. 종령 유충 지방체 조직을 FITC로 표지한 아포리포포린-III (FITC-apoLp-III)와 상온에서 30분간 배양하였다. 배양 후 형광현미경과 전기영동을 이용하여 FITC-apoLp-III가 지방체 조직으로 들어가는 지의 여부를 확인하였다. 그 결과 FITC-apoLp-III가 유충 지방체로 흡수된다는 사실을 알 수 있었다. Apolipophorin-III (apoLp-III) was isolated and purified from the last larval hemolymph of Galleria mellonella by the KBr gradient ultracentrifugation and gel chromatography (Sephadex G-100). In this paper, we examined that apoLp-III is taken up into the last larval fat bodies in Galleria mellonella. The last larval fat body tissues were incubated at room temperature for 30 min with fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled apoLp-III (FITC-apoLp-III). Fluorescein microscopy and sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) revealed that the last larval fat body tissues internalize FITC-apoLp-III. The results show that the apoLp-III is taken up by the last larval fat body.

Apolipophorin-Ⅲ uptake by the adult ovary in the wax moth Galleria mellonella

윤화경(Yun, Hwa-Kyung) 한국산학기술학회 2009 한국산학기술학회논문지 Vol.10 No.3

아포리포포린-Ⅲ를 꿀벌부채명나방 종령유충 혈림프에서 젤크로마토그래피 (Sephadex G-100)와 이온교환크로마토그래피 (CM-52)방법을 이용하여 분리, 정제하였다. 본 연구에서는 아포리포포린-Ⅲ가 꿀벌부채명나방의 성충 난소에 의해 흡수되는 지를 조사하였다. 성충난소조직을 형광물질로 표지한 아포리포포린-Ⅲ와 상온에서 30분간 배양하였다. 배양결과를 형광현미경과 전기영동을 이용하여 확인한 결과 형광물질로 표지된 아포리포포린-Ⅲ가 성충난소로 흡수된다는 사실을 알았다. Apolipophorin-Ⅲ (apoLp-Ⅲ) was isolated and purified from the last instar larval hemolymph of Galleria mellonella by gel chromatography (Sephadex G-100) and ion exchange chromatography (CM-52). In the present study, I wanted to show that apoLp-Ⅲ is taken up into the adult ovary in Galleria mellonella. Adult ovary tissues were incubated at room temperature for 30 min with fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled apoLp-Ⅲ. Fluorescence microscopy and sodium dodecylsulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) revealed that adult ovary tissues internalize fluorescence-labeled apoLp-Ⅲ. The results suggest that apoLp-Ⅲ is taken up by the adult ovary.

유충 Manduca sexta 리포포린에 의한 지방체로의 디아실글리세리드 운반

윤화경(Yun, Hwa-Kyung) 한국산학기술학회 2011 한국산학기술학회논문지 Vol.12 No.4

본 논문은 리포포린에 의해 디아실글리세리드(DAG)가 Manduca sexta 유충 지방체로 운반되는 과정을 조사하였. [3H]-DAG 표지 리포포린([3H]-DAG-Lp)을 시간별로 유충 지방체와 배양하여 지방체로 운반되는 DAG의 방사능을 결정하 였다. [3H]-DAG-Lp와 지방체를 배양하면 지방체에 DAG가 축적되며 이의 일부는 지방체에서 트리아실글리세리드(TAG) 로 전환되는 것을 알 수 있었다. Suramin과 표지되지 않은 리포포린(unlabeled Lp)의 존재 하에서는 지방체로 운반되는 DAG가 억제되는 데, 이는 DAG를 운반하는 데 리포포린 수용체가 관여한다는 사실을 알 수 있었다. Suramin의 효과는 다소 복잡하지만 리포포린 수용체에 결합하여 막의 특성을 변화시켜 DAG 운반속도에 영향을 주는 것 같다. 지질 운반과 정이 수용체-매개 내포작용이라는 사실을 조사하기 위하여 내포작용 억제자인 ammonium chloride와 chloroquine을 처리하 였다. 그 결과 리포포린과 지방체사이에서의 지질 운반 기작이 수용체-매개 과정이라는 사실을 보여준다. This paper was to characterize the transfer of diacylglycerol(DAG) from lipophorin to Manduca sexta larval fat bodies. [3H]-DAG-labeled Lp([3H]-DAG-Lp) was incubated with the larval fat bodies under different times and the time of DAG transfer was determined. Incubation of fat bodies with [3H]-DAG-Lp resulted in accumulation of DAG and TAG in the tissue. The transfer of [3H]-DAG was inhibited in the presence of suramin and unlabeled lipophorin, which would be consistent with a lipophorin receptor. The effects of suramin may be complex because it can change membrane properties when bound to the lipophorin receptor and affect the rate of DAG transfer. To investigate the lipid uptake via receptor-mediated endocytosis, we treated with endocytosis inhibitors, ammonium chloride and chloroquine. The results show that the transfer process of lipid by lipophorin and fat bodies is receptor-mediated endocytosis.

꿀벌부채명나방 성충 정소에 의한 아포리포포린-III의 흡수

윤화경(Hwa-Kyung Yun) 한국산학기술학회 2016 한국산학기술학회논문지 Vol.17 No.10

아포리포포린-III (apoLp-III)를 꿀벌부채명나방 종령 유충 혈림프로부터 KBr 농도구배 초원심분리와 겔크로마토그래피(Sephadex G-100)를 이용하여 분리, 정제하였다. KBr 농도구배 초원심분리가 끝난 후, 리포포린을 제외한 분획(lipophorin-free fractions)을 겔크로마토그래피 시료로 사용하였으며, 겔크로마토그래피를 행한후 sodium dodecyl sulfate(SDS)-전기영동으로 apoLp-III의 정제를 확인하였다. 또한, 본 연구에서는 유충 혈림프로부터 정제된 apoLp-III가 꿀벌부채명나방의 성충 정소에 의해 흡수되는 지를 조사하였다. 우화한 지 1일 또는 2일된 성충으로부터 성충 정소를 차가운 링거액에서 분리한 후 조직 배양의 시료로 사용하였다. 순수 정제한 apoLp-III를 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹인 형광물질 fluorescein isothiocyanate (FITC)와 상온에서 계속 저어가면서 1시간 동안 배양하였다. FITC로 표지된 apoLp-III(FITC-labeled apoLp-III)를 Sephadex G-25 PD-10 column을 이용하여 정제하고 확인하였다. 정제된 FITC-labeled apoLp-III와 성충 정소 조직을 상온에서 30분간 배양하였다. 배양 후 형광현미경 (fluorescence Axioskop microscope)과 SDS-전기영동을 이용하여 FITC-labeled apoLp-III가 정소 조직으로 들어가는 지의 여부를 확인하였다. 그 결과 FITC-labeled apoLp-III가 성충정소로 흡수된다는 사실을 알 수 있었다. Apolipophorin-III (apoLp-III) was isolated and purified from the last larval hemolymph of Galleria mellonella by KBr gradient ultracentrifugation and gel chromatography (Sephadex G-100). After KBr gradient ultracentrifugation, the lipophorin-free fractions were used as the samples for gel chromatography. The purity of the finally purified apoLp-III was confirmed by SDS-PAGE after gel chromatography. In this study, we found that apoLp-III is taken up into the adult testes in Galleria mellonella. The testes were dissected from day-1 or -2 adults in cold Ringer"s solution and used for tissue culture. The protein moiety of apoLp-III was labeled with FITC dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at room temperature under conditions of continuous stirring for 1 h. The FITC-labeled apoLp-III was purified with a Sephadex G-25 PD-10 column. The tissues of the adult testes were incubated at room temperature for 30 min with fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled apoLp-III. Fluorescein microscopy and sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) revealed that the adult testis tissues internalize the FITC-labeled apoLp-III. The results showed that apoLp-III is taken up by the adult testes.

Establishment of In Vitro 3-Dimensional Culture System of Mouse Endometrial Cells;I. Cytohistological Study on Mouse Endometrium

남화경,김은영,이금실,박세영,박은미,권중균,윤산현,박세필,임진호,Nam, Hwa-Kyung,Kim, Eun-Young,Lee, Keum-Sil,Park, Sae-Young,Park, Eun-Mi,Kwon, Jung-Kyun,Yoon, San-Hyun,Park, Se-Pil,Lim, Jin-Ho The Korean Society for Reproductive Medicine 2000 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.27 No.1

연구배경: 본 연구는 마우스의 자궁에 있어 착상시 일어나는 자궁내막의 변화를 미세구조적 측면에서 관찰하고, 이러한 기초 자료를 바탕으로 마우스 자궁내막세포를 이용한 3차원적 체외 배양시스템을 확립하는데 있다. 실험동물은 임신이 유도된 $6{\sim}8$ 주령의 ICR을 이용하였다. 연구재료 및 방법: 생검 조직은 hCG 접종 후 D1과 D5에 자궁 전체를 적출하여 획득하였다. 채취된 조직은 2.5% glutaradehyde와 1% osmium tetroxide를 이용하여 고정시킨 후, 탈수, 포매 및 절편 과정을 거쳐 염색시키고, 광학현미경, 투과전자현미경을 이용하여 관찰하였으며, 주사전자현미경을 이용한 관찰을 위한 표본은 고정된 조직을 탈수, 건조 및 코팅 과정을 거쳐 획득하였다. 결과: 1) 광학현미경상에서, 후기 분비기인 D5의 생검 조직은 초기 분비기인 D1의 조직에 비해 결합조직의 증가에 따른 기질층의 확장이 두드러졌으며, 이와 함께 자궁내막선과 혈관이 크게 발달되어 있었다. 2) 투과전자현미경상에서, 마우스 자궁내막의 미세구조는 단충원주형의 표면상피세포층, 기저층 및 기질층의 3층을 이루고 있었다. 또한, D5에서는 미세융모, 소포체, 골지체, 지질, 글리코겐 및 분비 과립 그리고 기저층의 표면적이 크게 확장되어 있었다. 3) 주사전자현미경상에서, 분비기가 진행될수록 마우스 표면상피세포의 주름의 정도와 미세융모의 분포가 크게 증가함을 알 수 있었으며, 특히 마우스의 착상시기인 D5에서는 자궁 수용성의 표지자인 자궁돌기의 출현이 두드러졌다. 마우스의 자궁돌기는 자궁내벽을 따라 불규칙적으로 좁은 지역에 분포하고 있었으며, 동일표본 내에서도 서로 다른 발달 단계를 보여주고 있었다. 결론: 마우스 자궁내막의 형태학적 변화에 관한 이러한 관찰 결과는 마우스의 자궁내막이 발정주기 중 특히 착상직전의 시기에 커다란 형태학적 변화를 경험함을 보여주었다. This study was designed to identify the ultrastructural changes of mouse endometrium during peri-implantation period and obtain the fundamental information for the establishment of 3-dimensional culture system of mouse endometrial cells in vitro. The used female ICR mice ($6{\sim}8$ wks) were conducted on pregnant. The biopsies were obtained from whole uterus at cycle day 1 (D1) and day 5 (D5) after hCG injection and mating. The biopsies materials were fixed 2.5% glutaraldehyde and 1% osmium tetroxide. Subsequently, for observation using light and transmission electron microscopy (LM and TEM), they were dehydrated and embedded in Epon and the embedded biopsies were sectioned and stained. For scanning electron microscopy (SEM), the fixed specimens were dehydrated, dried and coated with gold. 1) For LM, the biopsied materials at D5 (late secretory phase) were appeared the extended stromal layer by increased connective tissues and the fully developed endometrial glands and vessels compared with D1 (early secretory phase). 2) For TEM, the mouse endometrium was consisted of 3-layers, a simple polarized columnar epithelial cells, basement membrane and stromal cells. At D5, the distribution of microvilli, endoplasmic reticulum, Golgi body, lipid and glycogen deposits, secretory granules and surface area of basement membrane were increased. 3) For SEM, the degree of folding and microvilli of surface of mouse epithelial cells was became more and more according to the process of secretory phase, and at D5, implantation time of mouse, the appearance of pinopodes as a specific marker of uterine receptivity was found. The uterine pinopodes of mouse were found in narrow sites at the luminal surface, irregularity and appeared the different stages in the same sample. Therefore, these results indicated that the mouse endometrium was experienced dramatic morphological changes during peri-implantation period.

Cryopreservation of Bovine IVM/IVF/IVC Blastocysts by Vitrification

남화경,김은영,이금실,윤산현,박세필,임진호,Nam, H.K.,Kim, E.Y.,Lee, K.S.,Yoon, S.H.,Park, S.P.,Lim, J.H. The Korean Society for Reproductive Medicine 1999 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.26 No.2

본 연구는 체외생산된 소 배반포기배를 발달 단계 및 배양일에 따라 구별하여 초자화 동결 및 융해하였을 때, 그 발달능을 유지하는지 확인하고자 실시하였다. 체외수정 후 8일간 배양된 배반포기 배는 20% ethylene glycol에 3분 동안 평형시키고, EFS40 (40% ethylene glycol, 18% ficoll, 0.3M sucrose 그리고 10% FBS가 함유된 mDPBS) 동결액에 30초 동안 노출한 후, 액체질소에 침지하여 초자화 동결되었다. 체외 생존 여부는 응해 24시간 및 48시간에 재팽창 및 탈출 또는 완전탈출로써 평가하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 체외수정 후 8일간 배 양하였을 때, 난할된 배의 배반포기 배로의 발달율은 41.0%였다 (초기 ; 7.6%, 팽창; 22.9%, 탈출; 4.6%, 완전탈출; 5.9%). 2) 배반포기배를 동결액에 노출 또는 초자화 동결하였을 때, 초자화 동결된 배반포기배의 재팽창율 (73.3%)은 대조군 및 동결액에 노출된 경우 (100, 97.0%)보다 낮았다 (p<0.05). 그러나 융해 48시간 후 탈출 또는 완전탈출 배반포기배 형성율은 초자화 동결된 경우 (66.7, 46.7%)와 노출된 경우 (66.7, 39.4%)는 유의한 차이를 나타내지 않았으나, 대조군(100, 100%)과는 차이를 보였다 (p<0.01). 그러나, 완전탈출까지 발달한 배반포기배의 총 세포수를 조사하였을 때, 각 처리군간의 유의한 차이는 없었다. 3) 배반포기배의 발달 단계에 따른 체외 생존율을 비교하였을 때, 재팽창율은 실험군간에 유의한 차이를 보이지 않았다 $(64.5{\sim}75.6%)$. 그러나 융해 48시간 후, 탈출 또는 완전탈출로써 평가된 초기 배반포기배의 발달율 (25.8, 9.7%)은 팽창 (69.7, 39.4%)및 탈출 배반포기배 (53.3, 43.3%)의 발달율보다 낮게 나타났다 (p<0.05). 4) 또한, 배양 7, 8 그리고 9일의 팽창 배반포기배를 초자화 동결하였을 때, 8일 및 9일간 배양된 배반포기배의 재팽창율은 7일간 배양된 경우보다 낮게 나타났다 (7일; 93.9%, 8일; 75.8%, 9일; 87.5%) (p<0.05). 그러나 완전탈출 배반포기배로의 발달율에서는 처리군간에 유의한 차이를 보이지 않았다 (7일; 36.4%, 8일; 36.4%, 9일; 31.3%). 이러한 결과는 EFS40을 이용한 2단계 초자화 동결 방법이 체외생산 된 팽창 및 탈출 배반포기배의 동결에 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다. The objective of this study was to examine the effect of developmental stage and embryo age of in vitro produced bovine blastocysts after vitrification and thawing. In vitro cultured day 8 blastocysts after IVF were equilibrated 20% ethylene glycol (EG) for 3 min. and were vitrified using EFS40, which is consisted of 40% EG, 18% ficoll, 0.3M sucrose and 10% FBS added in mDPBS for 30 sec. before being plunged into $LN_2$. Also, survival in vitro was assessed by re-expansion and hatching or hatched at 24 hand 48 h postwarming, respectively. The results obtained in these experiments were summarized as follows; 1) When the embryos were cultured for 8 day after IVF, 41.0% of the cleaved embryos developed to the blastocysts (early; 7.6%, expanded; 22.9%, hatching; 4.6% and hatched; 5.9%). 2) When the embryos were exposed or vitrified to the freezing solution, the re-expansion of vitrified embryos (73.3%) was significantly lower than that of control and exposed embryos (100, 97.0%) (p<0.05). But the formation rate of hatching or hatched blastocysts of vitrified embryos (66.7, 46.7%) at 48h after thawing was similar to that of exposed embryos (66.7, 39.4%) but not control (100, 100%) (p<0.01). However, in the total cell numbers of those developed hatched blastocysts, there were not significantly different among the treatment groups. 3) When the embryo survival rates by different developmental stage were examined, the re-expansion was not different among the groups $(64.5{\sim}75.6%)$. After warming 48 h, the hatching and hatched formation of early blastocysts (25.8, 9.7%) was significantly lower than those of expanded (69.7, 39.4%) and hatching blastocysts (53.3, 43.3%) (p<0.05). 4) In addition, when the expanded blastocysts at day 7, 8 and 9 were vitrified, the re-expansion of day 8 and 9 embryos was significantly lower than that of day 7 (day 7; 93.9%, day 8; 75.8% and day 9; 87.5%) (p<0.05). However, the rates of development to hatched blastocysts were no difference among the groups (day 7; 36.4%, day 8; 36.4% and day 9; 31.3%). These results suggested that in vitro produced expanded or hatching blastocysts can be efficiently cryopreserved by the two-step vitrification method using EFS40.

아로마 해충기피제의 기피력 테스트

이종권,윤화경 한국산학기술학회 2004 한국산학기술학회논문지 Vol.5 No.4

100%천연향을 이용하여 제작, 개발된 해충기피제의 기피력을 테스트하였다. 해충기피제를 착용한 그룹과 착용하지 않은 그룹으로 구분하여 실험실에서 사육한 모기와 서해안에 위치한 몽산포 해수욕장, 동해안에 위치한 낙산 및 설악 해수욕장과 천안에 있는 태조산에서 해충에 대한 기피력을 측정하였으며, 각 그룹별로 5명씩 5회에 걸쳐 각 회당 1시간동안에 흡혈 개체로부터 물린 갯수를 확인하여 이들의 평균값을 계산하였다. 그 결과, 실험실에서는 91%, 몽산포 해수욕장에서는 78%, 낙산 및 설악 해수욕장에서는 93%, 태조산에서는 90%의 기피력을 보여주었으며. 이는 상당히 탁월한 기피효과를 나타내었다. The pulp fabric impregnanted 100% natural insect repellent was evaluated in an environmental chamber (laboratory, mongsanpoo beach, taejo Mt, naksan and seolak beach) for their repellent efficacy against insects. The results showed significant average repellency of 91 %, 78%, 90%, and 93% of laboratory, mongsanpoo beach, taejo Mt, naksan and seolak beach, respectively, during the 1hour of exposure period.

Purification of Major Hemolymph Protein of Great Wax Moth, Galleria mellonella

조준호,윤화경 한국곤충학회 2004 Entomological Research Vol.34 No.3

Major hemolymph protein (MHP) was purified from larval hemolymph of Galleriamellonella by KBr density gradient ultracentrifugation, ion exchange chromatography (DEAETrisacrylM), YM-50 ultrafiltration and gel permeation chromatography (Sephadex G-100). MHPis composed of two subunit (MHP-1 and MHP-2). The molecular weights of each subunit weredetermined (MHP-1 = 86 kDa and MHP-2 = 84 kDa). MHP is present in both hemolymph and fatbody during developmental stages, indicating this protein is carrying out some functions differentfrom other major protein such as storage protein and lipophorin.