Tris-buffer에 첨가되는 당의 종류에 따른 동결융해정자의 생존율 및 운동성에 관한 연구

유대중,정수룡,오인석,이정우,손병훈,서재석,서진성,조성균,배인휴,오동환,공일근 한국동물번식학회 2002 Reproductive & Developmental Biology(Supplement) Vol.26 No.1s

Tris-buffer에 첨가되는 당의 종류가 동결·융해정자의 운동성에 미치는 영향

유대중,정수룡,오인석,김흥률,이계웅,조성균,배인휴,양철주,공일근 韓國受精卵移植學會 2002 한국동물생명공학회지 Vol.17 No.2

본 연구는 개의 동결정액 제조 시 동결보호 희석액 내에 첨가되는 당의 종류와 조합이 동결융해 후 정자의 생존율 및 운동성에 미치는 영향과 정자동결 시 straw size가 생존율에 미치는 영향에 대하여 조사하고자 실시하였다. 희석액은 Tris-citric acid extender (Tris-buffer)의 기본용액에 20% Egg-yolk, 8% glycerol, 1% Equex STM paste등을 첨가하였으며, 당 성분으로는 monosaccharid This study was conducted to evaluate the effect of sugar kinds and combination of various sugars, and straw size and pre-freezing time on motility of post-thaw spermatozoa in canine. In general, the extender was supplemented with fructose or glucose for semen freezing. The extender used in .this study was Tris-citric acid extender (Tris-buffer) supplemented with 20% Egg-yolk, 8% glycerol, 1% Equex STM paste, and 70 mM sugars such as monosaccharide (fructose and xylose) and disaccharide(trehalose). To evaluate of sugar combination, the sugars supplemented in Tris-buffer. were combined such as control (fructose, xylose, trehalose), two combinations (Fru+Tre, Fru+Xy1, Tre+Xy1) and three combinations (Fru+Tre+Xy1). The motility after CASA analysis in Fru+Tre+Xy1 was higher than those in fructose, trehalose, xylose, Fru+Tre, Fru+Xy1, Tre+Xy1 (69 vs. 58, 61, 50, 65, 20, 54). However, the progressive motility after CASA analysis in Fru+Tre group was higher than those in fructose, trehalose, xylose, Fru+Xy1, Tre+Xy1, Fru+Tre+Xy1 (59% vs. 47, 55, 42, 13, 49, 44%). The survival rate of post-thaw spermatozoa in 0.25 straw for 10 min pre-freezing was significantly higher than those in 0.25 straw for 10 min, 0.25 and 0.5 for 5 min (80+0.0 vs. 65+7, 68+16, 58+8%; P<0.05). The results indicated that the progressive motility of post-thaw spermatozoa in 70 mM Fru +Tre (two combination) following CASA analysis and 0.25

흑염소 동결정액에 첨가되는 당의 종류가 동결융해 후 생존율에 미치는 영향

유대중,최영선,김상욱,김기수,구민정,이기호,박상국,성환후,이성수,김관우 한국수정란이식학회 2016 한국수정란이식학회 학술대회 Vol.2016 No.10

본 연구는 흑염소 동결정액 생산을 위해 활용되는 당의 종류가 동결융해 후 정자 생 존성 및 운동성 등에 미치는 영향을 조사하고자 수행하였다. 공시축의 사양관리는 개체별 별도 사육공간에서 사료 및 음수를 자유 채식케 하였으며 정액채취를 위해 12개월령 이 상의 성성숙(Sexual Maturity)이 완료된 흑염소 5두를 공시하였고 정액채취 빈도는 주 1 회로 하였다. 정액 채취는 보정 후 충전식 전기 자극기(11900, Mini-tube, Germany)를 활용하였고 Probe를 직장(Rectum) 내 삽입 후 숫 흑염소의 부생식선이 위치하는 부위에 밀착시켜 자동 전기자극 모드(0~10V)에서 2~3초당 0.5V씩 전압이 증가되도록 하여 2∼5회간 사출된 정액을 채취하였다. 정액의 탁도, 운무상을 현장에서 확인한 다음 실험실로 이 동 후 위상차 현미경(LABOPHOT-2, NIKON, Japan) 및 Markler-Chamber(Sefi-medical, USA)를 활용하여 원정액의 생존율 및 운동성을 하였다. 동결보존 희석액 조성은 Tris(hydroxymethyl)amino-methane 250mM, Citric-acid monohydrate 80mM, Sugar Supplements 60mM, Penicillin G Streptomycin 1%, Egg-Yolk 20%, Glycerol 7%로 하 였다. 동결정액의 생산은 당의 종류별로 원정액을 1차 희석한 다음 저온실로 이동하여 2차 희석 및 Glycerol 평형을 유도한 다음 0.25ml Straw에 충진시켜 액체질소를 활용한 동결을 실시하였다. 융해 후 정자 특성분석은 위상차 현미경과 컴퓨터정자분석기 (Computer Assisted Sperm Analysis)를 활용하였다. 생존율, 운동성, 선형성, 직진도 등 의 검사를 실시한 결과 생존율은 Glucose, Trehalose, Fructose(80%, 80%, 75%)였고, 운 동성은 Trehalose, Glucose, Fructose(97.8%, 94%, 88%)순 이였으며, 선형성은 Trehalose, Glucose, Fructose(31.4%, 31.9%, 34%)순으로 낮은 경향을 보였다. 직진도는 Glucose, Fructose, Trehalose(51.3%, 53.1%, 53.5%)순으로 조사되었다. 동결보존 희석액에 첨가되 는 당류의 분자량은 동결 과정 중 삼투압조절, 탈수, 원형질막의 보존과 융해 이후 생존 율 운동성 등에 영향을 미치는 측면을 감안한다면 위 연구결과와 같이 당류 별로 각각 상이한 결과를 나타낸 것은 당류가 정자의 생존율 및 운동성 등에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다. 이에 동결보존 희석액내 첨가되는 당류의 선정이 매우 중요하며 더불어 동결보존 시 활용되는 항동해제의 적정농도와 생존율 향상을 위한 흑염소 동결보 존의 표준화가 확립된다면 흑염소 개량과 번식효율 향상으로 농가소득 향상에 기여할 것 으로 사료된다.

지용성 비타민 첨가 급여가 칡소 정액의 성상에 미치는 영향

유대중,최영선,구민정,김상욱,김기수,박상국 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2017 Reproductive & Developmental Biology(Supplement) Vol.41 No.2

본 연구는 희소 재래가축으로 지정된 칡소의 생식세포 유전자원 중 동결정액 생산 · 보 존을 위해 활용되는 씨숫소를 대상으로 지용성 비타민제 첨가급여에 따른 동결정액 생산 시 채정량 및 정자 생존성 등에 미치는 영향을 조사하고자 수행하였다. 공시축의 사양관 리는 한우사양관리(국립축산과학원, 2007) 기준에 준하여 사육하였다. 지용성 비타민 Vitamin- A 35,000 IU, Tocopherol acetate 10 IU/일을 최초 정액채취일 30일 전부터 급이 하였다. 공시축은 정액채취를 위해 승가훈련 및 성성숙이 완료된 칡소 5두를 공시하였고, 정액채취 빈도는 월 2회로 하였다. 정액 채취는 암소 보정 후 공시축의 승가를 유도한 다음, 인공질에 음경을 삽입하여 채 정을 실시하였다. 동결정액 생산용 원정액은 현미경 검사결과, 정자의 생존율이 80∼85% 이상 확인되는 것을 활용하였다. 동결정액 생산용 희석액 조성은 Tris amino-methane 250 mM, Citric-acid monohydrate 80 mM, Fructose 60 mM, Penicillin G+Streptomycin 1%, Egg-Yolk 20%, Glycerol 7%로 하였다. 동결정액의 생산은 원정액을 1차 희석한 다음, 저 온실로 이동시켜 5℃로 온도 하강을 실시한 이후, Glycerol이 첨가된 희석액으로 2차 희 석을 실시한 이후 항동해제 평형을 유도하였다. 동결정액의 생산은 액체질소를 활용한 간이동결로 실시하였다. 동결이후 생존율 검사는 38℃에서 15초 이상 융해 후 현미경 검 사로 실시하였으며, 운동성 직진도 등은 컴퓨터정자분석기(Computer Assisted Sperm Analysis) 를 활용하여 조사하였다. 정액채취 결과, 지용성 비타민 처리군에서는 13.5 mL 내외 로 채정되었고, 무처리군은 9.0 mL 내외였다. 원정액의 생존율은 처리군 및 무처리군 모 두 85% 내외였다. 동결융해 이후 생존율을 검사한 결과, 생존율은 처리군 72.0%, 무처리 군 72.5%로 조사되었다. 운동성은 처리군 92.6%, 무처리군 94.8%로 조사되었고, 선형성 은 처리군 31.2%, 무처리군 32%였다. 직진도는 처리군 50%, 무처리군 51.3% 각각 조사 되었다. 이와 같은 결과는 지용성 비타민 급여가 칡소 생식기능에 영향을 미치는 것으로 판단되며, 추가적인 연구를 진행하여 지용성 비타민의 적정 급여 수준을 설정하고, 동결 정액 생산을 위한 표준화기술에 적용한다면 가축 유전자원 보존 · 증식에 기여할 것으로 사료된다.

한우 난자생검시 지용성 비타민 급여가 난자 회수에 미치는 영향

유대중,최영선,구민정,김기수,정광욱 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2017 발생공학 국제심포지엄 및 학술대회 Vol.2017 No.10

본 연구는 한우 수정란 생산에 활용되는 난자생검기술(Ovum Pick-Up) 적용 시 시험축 의 지용성 비타민(Vitamin-A, Tocopherol acetate) 급여에 따른 난자 회수효율을 조사하고 자 수행하였다. 공시축의 사양관리는 한우사양관리(국립축산과학원, 2007) 기준에 준하여 사료 및 음수를 자유 채식케 하였다. 시험구는 지용성비타민인 Vitamin A를 35,000 IU/ 일, Tocopherol acetate 100 IU/일을 급여하였으며 24개월령 이상의 성성숙(Sexual Maturity) 이 완료된 암소를 공시하였다. 난자생검을 위한 암소는 보정틀을 활용하여 난자채취 에 적합하게 보정을 실시한 다음 직장질법으로 내부생식기의 이상유무를 확인하였다. 이 후 질내로 난자채취를 위한 초음파진단기(Mylab one, Esaote,) Vaginal Probe를 주입 후 난소를 Probe 탐촉 부위에 밀착시켜 채취가능한 가시난포(3~10 mm)를 Vacumm Pump 로 음압을 유지시키고 Biopsy Neddle(19G, WTA, Brazil)을 활용하여 가시난포를 천자하 여 난자를 채취하였다. 채취된 난자는 실험실로 이동하여 TCM-199를 활용하여 세척한 다음 실체현미경(SMZ800, NIKON, Japan)하에서 회수된 난자를 검경하였다. 난자채취 결 과는 대조구에서 가시난포 천자수 대비 회수 난자율은 60%였으며, 시험구에서는 67%로 조사되었다. 위 결과는 난자생검기술 적용을 위한 암소의 지용성 비타민제 급여가 난소 내 난자 발육에 영향을 미치는 것으로 판단되며 난자 생검을 위한 시술자의 회수능력 향 상 및 체외배양 조건을 최적화시켜 한우수정란 이식기술에 적용한다면 향후 한우 개량 및 번식효율 향상에 기여를 통해 한우농가 소득향상에 기여할것으로 사료된다.

Tris-buffer에 첨가되는 당의 종류에 따른 동결융해정자의 생존율 및 운동성에 관한 연구

유대중,정수룡,오인석,이정우,손병훈,서재석,서진성,조성균,배인휴,오동환,공일근 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2002 Reproductive & developmental biology Vol.26 No.1

흑염소 발정유도 시 질내 상피세포 변화 양상에 관한 연구

유대중,최영선,구민정,김기수,정광욱,이성수,김관우 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2017 발생공학 국제심포지엄 및 학술대회 Vol.2017 No.10

본 연구는 흑염소 발정유도 시 인공수정 적기 판독에 활용을 위한 질내 상피세포의 변 화양상을 조사하고자 수행하였다. 흑염소 사양관리는 사육사에서 사료 및 음수를 자유 채식케 하였으며 공시축은 12개월령 이상의 성성숙(Sexual Maturity)이 완료된 흑염소 16 두를 공시하였다. 흑염소 발정유도를 위한 호르몬처리는 외관상 비발정으로 확인된 공시 축을 CIDR(Sheep & Goat Divice, Pfizer, USA)를 질내 7일간 삽입한 이후 제거하면서 PGF2α 15 mg (Lutalyse, Zoetis, USA)을 주사하고 2일 경과 후 GnRH 1 mL (Receptal, Intervet, USA)주사하였다. 질상피세포는 시험축의 발정유도 개시일부터 14일간 질내 심 부에 면봉을 삽입 후 채취하고 Slide Glass에 도말시킨 다음, Giemsa 염색액(Karyo Max Giemsa Stain Stain Solution, Gibco, USA)으로 염색 후 증류수 세척 및 풍건을 시켰다. 이후 위상차 현미경(DM6 B, Leica, Germany)400배율에서 염색된 상피세포의 검사를 실 시하였다. 상피세포의 검사결과는 발정유도 개시일로부터 4일차에는 비발정기에서 관찰 되는 Parabasal Cell이 주로 관찰되었으며 5일차부터 7일차 사이에는 Intermediate Cell이 가장 많이 관찰되면서 8일차에는 Intermediate Cell과 Superficial Cell이 검경되었다. 9일 차와 10일차 사이에는 발정기에 주로 관찰되는 Anuclear Cell이 검경되다가 11일차부터 14일차 사이에는 Parabasal Cell 주로 검경되었다. 위의 일자별 질 상피세포 검경 결과는 흑염소 발정유도 후 인공수정을 위한 적기 판정기준의 참고자료로 활용이 가능할것으로 판단된다. 향후 발정유도 처리에 따른 일자별 혈액내 Progesterone 농도 및 외음부의 종 창정도를 종합하여 인공수정 적기를 제시하고 흑염소 인공수정을 위한 발정유도 처리 메 뉴얼을 개발한다면 흑염소 개량과 번식효율 향상으로 농가소득 향상에 기여할 것으로 사 료된다.

칡소 동결정액 제조 시 저온 저장 시간이 정자 생존율에 미치는 영향

유대중,최영선,구민정,김기수,정광욱,조창연,김승창,김관우 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2018 발생공학 국제심포지엄 및 학술대회 Vol.2018 No.06

본 연구는 칡소의 동결정액 생산 시 항동해제 첨가 후 저온 저장 시간이 정자 생존성 및 운동성 등에 미치는 영향을 조사하고자 수행하였다. 공시축의 사양관리는 한우사양관 리(국립축산과학원, 2007) 기준에 준하여 사육하였다. 공시축은 정액채취를 위해 승가훈 련이 완료된 칡소 3두를 공시하였고 정액채취 빈도는 주 1회로 하였다. 정액 채취는 공시축의 승가 유도 후 인공질을 활용 채정을 실시하였고 위상차 현미경 하에서 생존율이 80∼90%로 검경된 원정액으로 동결정액 생산에 활용하였다. 동결보존 희석액의 기본조성은 Tris(hydroxymethyl)amino-methane 250 mM, Citric-acid monohydrate 80 mM, Fructose 60 mM, Penicillin G Streptomycin 1%, Egg-Yolk 20%, Glycerol 7% 농도로 하여 본 실험에 공시하였다. 동결정액의 생산은 채취된 원정액을 1차 희석 한 다음 저온 저장실로 이동하여 2차 희석 및 Glycerol 평형을 1시간 유도한 다음 0.5 mL Straw에 충진시켜 액체질소를 활용한 간이 급속 동결을 실시하였다. 융해 후 정자 특 성분석은 위상차 현미경과 컴퓨터정자분석기(Computer Assisted Sperm Analysis)를 활용 하여 생존율, 운동성, 선형성, 직진도 등을 Glycerol 평형직후, 4, 8, 12, 24시간 경과 후 각각 검사한 결과 생존율은 평형직후, 4, 8, 12, 24시간(75, 75, 70, 70, 55%)였고 운동성 은 12, 8시간, 평형직후, 24, 4시간(78.8, 78.5, 77.5, 76, 74.6%) 순이었으며, 선형성은 4 시간, 평형직후, 12, 8, 24시간(47.1, 49.5, 51.6, 51.8, 53%) 순으로 낮은 경향을 보였다. 직진도는 평형직후, 4, 8, 12, 24시간(61.2, 66.3, 68, 70.8, 70.8%) 순으로 낮은 경향을 보였다. 금번 연구 결과는 동결보존 희석액에 첨가되는 항동해제인 Glycerol을 첨가한 이 후 저온 저장 조건을 유지함으로써 정자의 가사상태 유지 및 정자의 운동성 등을 억제시 킨 결과로 항동해제 평형시간이 경과함에 따라 생존율 등은 다소 낮아지는 것으로 조사 되었다. 이는 정자의 체외 배출 이후 온도, 삼투압충격 및 대사에너지 소모에 따른 자연 사멸 등의 요인으로 저장시간이 경과함에 따라 생존율에 영향을 미쳤을 것으로 판단된 다. 위와 같은 결과는 동결정액 생산 기반 시설이 없는 농가 또는 타기관 보유 칡소 동 결정액 공유를 위해 사육 현장에서 채정 및 동결보존 희석 처리 시킨 다음 저온 조건을 유지시켜 생산이 가능한 장소로 이동 동결정액을 생산함으로써 시·공간적인 제약 해결이 가능하여 가축유전자원 보존·증식에 기여할 것으로 사료된다.

칡소 동결정액 제조 시 항산화제 첨가가 정자 생존율에 미치는 영향

유대중,최영선,김상욱,김기수,구민정,이기호,박상국,성환후,김성우,김동교 한국수정란이식학회 2016 한국수정란이식학회 학술대회 Vol.2016 No.10

본 연구는 칡소의 동결정액 생산 시 항산화제 첨가가 정자 생존성 및 운동성 등에 미 치는 영향을 조사하고자 수행하였다. 공시축의 사양관리는 한우사양관리(국립축산과학원, 2007) 기준에 준하여 사육하였다. 공시축은 정액채취를 위해 승가훈련이 완료된 칡소 5두 를 공시하였고 정액채취 빈도는 주 1회로 하였다. 정액 채취는 암소 보정 후 공시축의 승가를 유도한 다음 인공질에 음경을 삽입하여 채 정 후 원정액 정자가 80∼90% 생존율을 나타내는 것을 동결정액 생산에 활용하였다. 동 결보존 희석액의 기본조성은 Tris(hydroxymethyl)amino-methane 250mM, Citric-acid monohydrate 80mM, Fructose 60mM, Penicillin G Streptomycin 1%, Egg-Yolk 20%, Glycerol 7%에 항산화제인 Ascorbic-acid를 무처리, 0.5mM, 1.0mM, 2.0mM로 농도로 하 여 본 실험에 공시하였다. 동결정액의 생산은 처리군별로 원정액을 1차 희석한 다음 저온 실로 이동하여 2차 희석 및 Glycerol 평형을 유도한 다음 0.5ml Straw에 충진시켜 액체 질소를 활용한 동결을 실시하였다. 융해 후 정자 특성분석은 위상차 현미경과 컴퓨터정자 분석기(Computer Assisted Sperm Analysis)를 활용하여 생존율, 운동성, 선형성, 직진도 등을 검사한 결과 생존율은 2.0mM, 무처리, 1.0mM, 0.5mM(83.3%, 81.6%, 65%, 60%)였 고 운동성은 무처리, 2.0mM, 1.0mM, 0.5mM(97%, 96.5%, 94.4%, 91.3%)순이였고, 선형성 은 2.0mM, 무처리, 1.0mM, 0.5mM(29%, 29.7%, 32.9%, 36.4%)순으로 낮은 경향을 보였 다. 직진도는 2.0mM, 무처리, 1.0mM, 0.5mM(65.6%, 62.5%, 62.2%, 60.4%)순으로 낮은 경향을 보였다. 동결보존 희석액에 항산화제인 Ascorbic-acid 첨가함으로써 정자의 대사 과정에 따라 생성되는 활성산소의 발생 억제 등으로 인하여 동결융해 후 생존율에 영향 을 미치는 것을 감안하여 분석한다면 항산화제의 농도별로 각각 상이한 결과를 나타낸 것은 Ascorbic-acid의 첨가가 정자의 동결 융해 후 생존율 및 운동성 등에 영향을 미쳤 을 것으로 판단된다. 이와 같은 결과를 바탕으로 칡소 동결정액 생산 시 생존율 극대화를 위해 적정 항산화제 및 첨가 농도를 확립하고 이를 활용한다면 가축유전자원 보존·증식 에 기여할 것으로 사료된다.

칡소 동결정액 제조 시 항산화제 첨가가 정자 생존율에 미치는 영향

유대중,최영선,김상욱,김기수,구민정,이기호,박상국,성환후,김성우,김동교 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2016 발생공학 국제심포지엄 및 학술대회 Vol.2016 No.10