미강에 함유된 tocotrienol의 항산화 효과

우기민,이영상,김용호 한국작물학회 2003 한국작물학회 학술발표대회 논문집 Vol.2003 No.-

단백질 및 1가 양이온을 통한 proteasome의 활성조절에 관한 연구

우기민,이상한,조만희 순천향의학연구소 2004 Journal of Soonchunhyang Medical Science Vol.10 No.1

Proteasome은 일반적으로 세포내 환경과 매우 상이한 조건하에서 연구된다 (실험용 완충액에는 1기가 이온들이나 여러 단백질들이 결여되어 있다). 특이하게도 본 연구결과 낮은 농도의 Na^(+)와 K^(+)는 20S proteasome의 단백질 분해 활성을 현저히 저하시키지만 26S proteasome의 단백질 분해 활성에는 크게 영향을 미치지 못하였다. Na^(+)와 K^(+)는 20S proteasome의 chymotrypsin 유사 분해활성을 1-2 mM의 Ki 값으로 매우 민감하게 억제하였다. 이에 비해 기타 다른 1가 양이온 (Li^(+), Rb^(+), 또는 Cs^(+))은 미미한 억제효과를 나타내고, 2가 양이온 (Mg^(2+))은 20S proteasome의 chymotrypsin 유사 분해활성을 오히려 활성화시켰다. 이러한 이온들은 trypsin 유사 활성과 post-acidic 활성에도 유사한 억제효과를 보였다. 또한, Na^(+)와 K^(+)는 20S proteasome에 의한 casein, oxidized RNase A, a-lactalbumin 같은 단백질들의 분해를 강력하게 억제시키지만, 26S proteasome에 의한 ATP-의존적 단백질 분해 활성에는 영향을 미치지 못한다. 일반적으로 세포내 단백질농도는 매우 높은 것으로 알려져 있는 바, proteasome의 분해활성에 미치는 단백질의 영향을 조사한 결과, 무작위의 다양한 단백질들(0.1㎎/㎖)도 1가 양이온(Na^(+)와 K^(+))의 경우와 같이 20S proteasome의 펩타이드 분해활성을 억제하였지만 26S proteasome의 활성에는 아무런 영향을 미치지 않았다. 이러한 억제작용은 경쟁적이지 않다. BSA나 ovalbumin 같은 비가수분해 단백질들이 20S proteasome의 펩타이드 분해활성을 강력히 억제한였으므로 이러한 억제현상이 비경쟁적이라는 것을 알 수 있다. 비록 Na^(+), K^(+)와 단백질들이 20S proteasome을 비활성화 형태로 유지시키지만, 0.02% SDS에 의한 20S proteasome의 활성증가를 막거나 억제시키지는 못하였다. 이 결과로 고농도의 이온과 단백질이 존재하는 세포내 조건에서는, 독립적인 20S proteasome은 잠재적으로 비활성화된 형태로 존재하며, 19S ATPase 복합체나 11S 같은 proteasome 활성복합체가 결합한 후에 비로소 26S proteasome의 활성화된 형태로 전환되는 기작을 갖는 것으로 여겨진다. 또한, Na^(+)나 K^(+), BSA나 ovalbuim의 첨가는 비활성화 형태의 20S proteasome을 이용한 많은 연구를 보다 용이하게 할 것으로 기대된다.

포유동물의 26S 및 20S Proteasome에 의한 단백질 분해 산물에 관한 연구

우기민 순천향의학연구소 2004 Journal of Soonchunhyang Medical Science Vol.10 No.1

Knowledge about the sizes of peptides generated by proteasomes during protein degradation is essential to fully understand their degradative mechanism and the subsequent steps in protein turnover and generation of major histocompatibility complex class I antigenic peptides. We demonstrate here that 26S and activated 20S proteasomes from rabbit muscle degrade denatured nonubiquitinated proteins in a highly processive fashion but generate different patterns of peptides (despite their containing identical proteolytic sites). With both enzymes, products range in length from 3 to 22 residues, and their abundance decreases with increasing length according to a log-normal distribution. Less than 15% of the products are the length of class I presented peptides (8 or 9 residues), and two-thirds are too short to function in antigen presentation. Surprisingly, these mammalian proteasomes, which contain two "chymotryptc", two "tryptic," and two "post-acidic." active sites, generate peptides with a similar size distribution as do archaeal 20S proteasomes, which have 14 identical sites. Furthermore, inactivation of the "tryptic" sites altered the peptides produced without significantly affecting their size distribution. Therefore, this distribution is not determined by the number, specificity, or arrangement of the active sites (as proposed by the "molecular ruler" model); instead, we propose that proteolysis continues until products are small enough to diffuse out of the proteasomes.

Lumbricus rubellus에 존재하는 Lumbrokinase의 Ubiquitin-conjugate 분해활성에 관한 연구

우기민,이상한,조만희 순천향의학연구소 2004 Journal of Soonchunhyang Medical Science Vol.10 No.1

본 연구에서 Lumbricus rubellus에 존재하는 강력한 fibrinolytic 효소인 Lumbrokinse들을 여러 크로마토그래피법을 이용하여 부분정제하고 그들의 생화학적 성질들을 조사하고 비교하였다. L. rubellus의 단백질 추출물은 fibrinogen, lactalbumin, BSA, casein 등 다양한 단백질들을 분해하는 활성을 가졌으며, 그들의 활성은 poly-lysine같은 poly-cation들에 의하여 활성화되었다. 또한 이러한 활성화 정도는 poly-cation들의 길이에 의존적이며 poly-lysine의 경우 이성체에 상관없이 모두 활성화시켰다. DEAE-Sepharose를 통하여 확인된 3 종류의 분해활성으로부터 2 종류의 서로 다른 Lumbrokinse들을 Phenyl-Sepharose, Superose-12 크로마토그래피들을 통하여 부분정제하여 E-I, E-III라고 명명하였다. SDS-PAGE와 gel filtration을 시행하였을 때 그들은 각각 33 kD과 38 kDa의 폴리펩타이드로 구성된 단일체로 규명되었다. E-I의 fibrinogen을 분해하는 특이적 활성은 poly-lysine이 없을 경우 3.75 ng hydrolysis/ng enzyme/20 min으로 상대적으로 낮았으나 poly-lysine이 첨가될 경우 75 ng hydrolysis/ng enzyme/20 min로 활성이 20배가량 증가하였다. 반면 E-III는 poly-lysine이 없을 경우 20 ng hydrolysis/ng enzyme/20 min으로 상대적으로 높았지만 poly-lysine의 첨가시 129 ng hydrolysis/ng enzyme/20 min로 약 6.5배의 증가를 보였다. 0.2 M의 KCI은 poly-lysine에 의한 fibrinogen 분해활성을 강하게 억제하였으며 펩타이드 분해활성은 E-I와 E-III가 서로 다른 영향을 받았다. E-III는 poly-lysine에 의해 증가된 활성이 억제받는 반면, E-I는 오히려 펩타이드 분해활성이 KCI에 의하여 10배가량 증가되었다. 이러한 상반된 결과는 두 효소가 서로 다른 분해기작과 조절기작을 가짐을 의미한다. 정제된 E-I와 E-III는 놀랍게도 ubiquitin이 결합된 일련의 단백질들을 분해하였으며, 이 활성도 또한 poly-lysine에 의하여 증가되었다. 또한 ubiquitin-conjugate의 분해활성은 PMSF에 의하여 억제받으므로 serine계의 단백질 분해효소이며 IAA에 의하여 억제받지 않으므로 활성화 부위에 sulfide 기가 관여하지 않는 것으로 판명되었다. 또한 fibrinogen의 분해에서와 같이 이들의 활성도 KCI에 의해 억제되었다. Ubiquitin-conjugate들은 분해된 후 자유 ubiquitin이 반응산물로 나타났으므로 E-I과 E-III는 포유동물들에 존재하는 ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH)의 새로운 종류이거나 26S proteasome을 대신할 수 있는 또 다른 형태의 단백질 분해효소일 가능성을 제공해준다.

정제된 26S Proteasome의 펩타이드 분해활성에 미치는 nucleotide와 단백질의 영향

우기민 순천향대학교 교수학습개발센터 2004 Journal of Soonchunhyang Medical Science Vol.10 No.3

26S proteasome은 진핵세포에서 ubiquitin이 결합된 단백질들을 분해하는 ATP-의존성 단백질 분해복합체로서 19S ATPase 복합체와 20S core proteasome으로 구성되어있다. Proteasome의 단백질 분해활성과 ATP와의 상관성을 규명하기 위해 토끼의 근육조식으로부터 26S proteasome을 순수분리하고, 펩타이드 분해활성에 영향을 주는 요인들을 분석하였다. 이 연구에서 nucleotide 결합이 26S proteasome을 안정화시키고, 또한 chymotrypsin-like, trypsin-like, post-acidic 펩타이드 분해활성을 3-5배 증가시키는 것으로 나타났다. ATP와 CTP 및 분해되지 않는 ATP유사체인 AMPPNP도 펩타이드 분해를 활성화시켰다. 26S proteasome의 ATP분해를 위한 K_(m)은 42 μM인 반면, 펩타이드분해 활성화를 위한 ATP의 K_(a)는 1 μM이하로 나타났다. Nucleotide가 결핍 시, 26S proteasome은 실온에서 3-5분의 반감기로 비가역적으로 비활성화되었다. 그러므로, ATP와 높은 친화성을 가진 구성성분이 ATP 분해없이 단지 결합만으로 26S proteasome을 안정화시키고, 펩타이드 분해를 지속적으로 가능하게 해주는것으로 사료된다. 여러 가지 단백질들이 proteasome의 펩타이드 분해활성에 미치는 영향을 조사해본 결과, 몇몇 단백질들이 ATP와 매우 유사하게 26S proteasome의 펩타이드 분해활성을 증가시켰다. 이러한 활성은 선택성을 보이며 특히 26S proteasome에 의해 분해되거나 인식될 수 있는 단백질이 보다 큰 활성화를 나타내는 것으로 보아, 구조의 안정화와 더불어 펩타이드 기질들이 proteasome의 분해활성 부위에 보다 잘 인식될 수 있도록 구조의 변화도 유발하는 것으로 사료된다. 또한, 잠재적인 활성을 가지는 20S proteasome은 이들 단백질에 의해 그 활성이 오히려 억제되므로, 이들의 결합부위는 26S proteasome의 조절부위(19S ATPase complex)에 있다고 예상된다.

Lumbricus rubellus에 존재하는 키틴분해효소에 관한 연구

우기민,이상한,조만희 순천향의학연구소 2004 Journal of Soonchunhyang Medical Science Vol.10 No.1

본 연구를 통하여 Lumbricus rubellus 지렁이가 chitinase, N-acetylglucos aminidase, 그리고 cellulase 등의 탄수화물 분해효소들을 지니고 있는 것으로 밝혀졌다. 30~80% Ammonium sulfate 분획법, 이온교환수지법, 소수성수지법, 젤여과수집법들을 이용하여 chitinase와 N-acetylglucosaminidase들을 부분적으로 정제하였다. 4-Methyl umberriferone이 결합된 형광성 기질을 이용하여 키틴 분해효소의 활성을 측정한 결과 triacetyl-chitotrioside, diacetyl-chitobioside와 N-acetylglucosamine등의 대표적인 기질들을 매우 높은 활성도로 분해하였다. 또한 키틴 분해효소들은 60℃의 높은 온도에서도 한 시간이상 변성되지 않고 기질분해 능력을 잃지 않았다. 더 놀라운 사실은 많은 효소들을 변성시키고 활성을 감소시키는 여러 가지 억제제들(SDS, sodium deoxycholate, Triton X-100, NaCl과 DTT)이 효소의 활성에 거의 영향을 미치지 않는다는 것이다. 특히 대부분의 효소를 완전히 변성시키는 4% 농도의 SDS도 chitinase의 활성을 겨우 30% 정도만 억제하였다. Lumbricus rubellus chitinase의 이러한 특이하고 독특한 생화학적 성질들은 Lumbricus가 산업적으로 매우 유용한 대사효소들(chitinases, lipases와 proteases)을 지니고 있으며, 의학을 비롯한 환경정화, 생물공정, 건강보조식품, 식품, 세제 등의 다양한 산업에 적용 가능하게 할 것으로 기대된다.

흰쥐에서 자유 radical 투여에 의해 유발된 간독성화의 생화학적 연구

우기민 순천향대학교 교수학습개발센터 2004 Journal of Soonchunhyang Medical Science Vol.10 No.3

In this study, liver damage was induced by injection of carbon tetrachloride(CCl_(4)) or azobis (2-amidinopropane(dihydrochloride(AAPH) into rats, and their biochemical analysis was carried out from the serum and urine. Upon the treatment of these free radical-inducing reagents, nonfunctional plasma enzymes (AST, ALT, ALP, and γ-GTP) and serum bilirubin levels were significantly elevated (p<0.05). Also, in indocyanin green(ICG) excretion test, ICG T_(1/2) of all the treatment groups were prolonged but those of CCl_(4) treatmetn groups were shown more significant. Urinary biopterin levels were increased from 24 hour treatment, and more significant in AAPH treatmetn groups. Correlations between the increasing rates of urinary biopterin levels and serum enzyme activities (AST, ALT, AlP, and γ-GTP) and serum bilirubin levels in CCl_(4) or AAPH-induced hepatotoxicity were statistically significant (p<0.05). Also, The increasing rates of ICG T_(1/2) were significantly correlated with those of serum enzyme activities and erum bilirubin in CCl_(4) or AAPH-induced hepatotoxicity (p<0.05) except for no significant correlations with serum ALT activities in CCl_(4)-induced hepatotoxicity. The increasing rates of ICG T_(1/2) were significantly correlated with those of urinary biopterin in CCl_(4) or AAPH-induced hepatotoxicity (p<0.05). From the results, ICG excretion test and urinary biopterin levels might be suggested as reliable early indictors for detection of acute liver damages especially induced by free radicals. Also, considering the biological roles of biopterin in celluar immune system, further studies might be helpful for the therapeutic development related to antioxidants.

Sphingomonas sp. KS 301로부터 정제된 Superoxide Dismutase의 분류 및 생화학적 특성

우기민 순천향대학교 의학연구소 2009 Journal of Soonchunhyang Medical Science Vol.14 No.3

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Sphingomonas sp. KS 301로부터 정제된 Superoxide Dismutase의 순수분리

우기민 순천향대학교 의학연구소 2009 Journal of Soonchunhyang Medical Science Vol.14 No.3

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동물 식이 실험을 통한 미강 추출 Tocotrienol의 생리활성 효과

우기민,이영상,김용호 한국자원식물학회 2007 한국자원식물학회지 Vol.20 No.2