포스타 전시 발표 : 혈액종양 ; Interleukin-2의 가동화 말초 조혈모세포에 대한 활성화 효과

김현수,이종욱,양말숙,최진혁,남동기,임호영,김효철 대한내과학회 1998 대한내과학회 추계학술대회 Vol.1998 No.1

가동화 조혈 모세포에 대한 Interleukin-2의 활성화 효과

김현수,이종욱,양말숙,정철권,박준성,조도연,김문규,최진혁,남동기,임호영,김효철 대한조혈모세포이식학회 1999 대한조혈모세포이식학회지 Vol.4 No.1

연구배경: 자가말초조혈모세포의 이식은 고용량 항암치료후의 치명적 골수 억제의 부작용을 극복할 수 있는 좋은 수단으로 악성 혈액질환 및 각종의 고형암 환자를 대상으로 그 치료 효과가 기대되고 있다. 그러나 자가 이식은 비교적 높은 암의 재발률이 극복하여야 할 과제로 남아있다. 이러한 암의 재발률은 이식편에 오염된 자가 종양세포의 재주입과 동종이식과는 달리 이식편대종양 반응이 없어 미세 잔류암의 제거가 어렵다는 문제에 기인한다. 최근 이러한 재발의 억제를 위해 자가 이식에서 인위적으로 이식편대종양 효과를 얻고자 하는 시도가 있어 왔다. 본 연구는 가동화된 말초조혈 모세포을 대상으로 Interleukin-2(IL-2)를 이용한 림프구의 활성화 효과를 시험관 내에서 관찰하였다. 방법: IL-2 및 granulocyte macrophage-colony stilmulating factor (GM-CSF)로 가동화된 말초조혈모세포를 활성화시켜 림프구 분획의 변화와 K562 세포주에 대한 세포독성 실험을 시행하였다. 저온의 액체 질소 용기에 보고나 중인 가동화된 말초조혈모세포를 온수조에 급속 해동하여 각각 100 U/ml과 1.000 U/ml의 IL-2를 첨가하여 배양하였으며 GM-CS의 효과를 확인하기 위해 50 ng/ml을 첨가한 군과 안한 군으로 나누어 실험하였다. 배양 후 3일, 6일 14일째 활성화 림프구를 유세포 분석기를 이용하여 분석하였으며 K562 세포주에 대한 세포독성 효과를 관찰하였다. 정상인 3명의 검체를 얻어 위와 같은 방법으로 실험하여 비교하였다. 결과: 배양후 CD8^(+) 세포는 3일째부터 증가하기 시작하였으며 IL-2 1.000 U/ml 과 GM-CSF를 같이 투여한 군에서 가장 높은 증가를 보였다. 자연살상 세포는 환자군에서는 IL-2 1.000 U/ml을 투여한 군에서는 가장 높은 증가를 보였다. 세포독성 실험은 K562 세포주에 대해 3일째부터 전 조건에서 증가하였으며 IL-2 1.000 U/ml 단독 투여 군에서 가장 높은 증가를 보였다. 결론: 가동화 된 말초조혈모세포에 대한 IL-2의 효과는 1.000 U/ml 단독 투여 군에서 가장 높은 증가를 보인 것으로 판단되며 임상적 적용을 위한 배양 조건 및 기간에 적합할 것으로 생각된다. 그러나 인위적인 이식편대종양 효과로 임상적 효과를 얻기 위하여 자연살상 및 다른 면역세포의 활성화의 연구가 병용되어 사용된다면 좀더 높은 효과를 기대할 수 있을 것이다. Background: Autologous peripheral blood stem cell transplantation (AutoPBSCT) has been effectively used for reconstitution of hematopoisis following high dose chemotherapy. However, AutoPBSCT is hampered by somewhat higher incidence of disease recurrence than patients receiving allogeneic grafts due in part to reinfusion of residual tumor cells contained in the AutoPBSC and also to the lack of an graft versus tumor(GVT) effect. In the order to induce the GVT effect using AutoPBSC , the effect of Interleukin-2(IL-2) on PBSC was studied in vitro. Methods: The effect of IL-2 and GM-CSF on PBSC in subsets of lymphocyte and the cytotoxic activity against the K562 cell line were investigated. The mobilized PBSC, stored in liquid nitrogen, thawed rapidly and incubated in serum free media with IL-2 con cen trations of 100, and 1.000U/ml with or without GM-CSG of 50 ng/ml. PBSC samples from 10 patients were incubation for 3 day, 6 and 14 days and 3 sample s from heathy were incubated. At the end of incubation, samples were analyzed for the changes of immunopheotype with a flow cytometry, and examined the cytotoxic function against the K562 cell line. Results: The results were as follows. 1) After incubation, CD8 cells tended to increase from day 3 and showed higher value in the conditions cultured with IL-2(1,000 IU/ml)+ GM-CSF. 2) NK cells(CD56 cells) were higher in samples with IL-2 of 1.000 IU/ml only. 3) Cytotoxic function against K562 cell line increased at day 3 in every incubation conditions and showed the highest value in the condition cultured with IL-2 of 1.000 IL/ml (44.3% vs 10.3% of control). Conclusion: The mobilzed AutoPBSC, when incubated with IL-2 of 1,000 IU/ml for 3 days, retains antitumor potential for NK cell lysis function, Further cilnical study is necessary to elucidate the beneficial clinical activity against the autologous tumor cells for its GVT effect.

제 50 차 대한내과학회 추계학술대회 초록집 : Interleukin - 2 의 가동화 말초 조혈모세포에 대한 활성화 효과

김현수,이종욱,양말숙,최진혁,남동기,임호영,김효철 대한내과학회 1998 대한내과학회 추계학술대회 Vol.55 No.-

인터류킨-2로 활성화한 자가 조혈모세포 이식술

박준성,김현수,이종욱,양말숙,강석윤,김재홍,--,조혜진,정철권,조도연,최진혁,임호영,김효철 대한조혈모세포이식학회 2001 대한조혈모세포이식학회지 Vol.6 No.1

연구배경: 고용량 항암 화학 요법 및 자가 조혈모세포 이식술은 임상적 관해를 유도하기 위한 새로운 치료 접근방법 이지만 미세 잔류암의 제거가 이루어지지 않는다면 재발을 막는 데에 제한적인 치료방법일 수밖에 없다. 최근 자가 조혈모세포 이식과 더불어 IL-2로 체외에서 활성화한 조혈모세포 이식술 및 이식 후 지속적인 IL-2의 주입방법이 시행되고 있으며, 이로 인한 골수 회복의 지연, 발열 등 IL-2의 합병증에 대한 연구가 진행 중이다. 이에 저자 등은 다양한 고형암 및 혈액암 환자에게 자가 조혈모세포 이식과 더불어 IL-2로 활성화한 조혈모세포 이식술을 시행하여 그 경험을 보고하는 바이다. 방법: 1997년 3월부터 2000년 2월까지 3년간 아주대학교병원에서 고용량 항암 화학 요법 및 자가 조혈모세포 이식술을 시행받은 고형암 및 혈액암 환자 중 인터류킨-2로 활성화한 조혈모세포 이식술을 병행했던 환자 39명을 대상으로 하였으며, 그 중 10례는 절대 호중구 수치가 500/ul 이상 되었을 때, 나머지 29례는 그 이전상태에서 IL-2로 활성화한 조혈모세포를 추가로 이식하였다. 이 환자들의 이식과정 중 나타났던 발열, 피부발진 및 골수 생착과정의 지연여부 등을 후향적으로 조사하였다. 결과: 환자는 남자 10례, 여자 29례이었고, 중앙 연령은 39세(1~55세)이었으며, 활성화된 조혈모세포 이식 후 72시간 내에 발열이 있었던 경우를 WHO 기준으로 평가하여 3도 발열이 2례, 2도 발열이 23례, 1도 발열이 3례, 발열이 없었던 경우가 11례 이었다. 피부 발진은 이식을 위한 입원기간 동안 발생한 것을 WHO 기준으로 평가하여 3도 발진은 없었고, 2도 발진이 2례, 1도 발진이 3례 이었고, 나머지 34례는 피부에 이상소견을 보이지 않았다. 골수 생착의 지표인 백혈구 수치와 혈소판 수치는 절대 호중구 수치가 500/ul 이상이 되는 시기와 혈소판 수치가 20,000/ul 이상이 되는 시기가 골수 이식일로부터 각각 평균 11.7일(8~33일) 및 평균 16.1일(7~33일)이었으며, 이는 동일 기간 동안 아주대학교 병원에서 고용량 항암 화학 요법 및 IL-2가 포함되지 않은 자가 조혈모세포 이식술을 시행받은 72명의 무작위 추출군의 골수 생착속도가 각각 평균 11.8 일(p=0.102), 15.3 일(p=0.092)임을 비교해볼 때 IL-2로 활성화한 조혈모세포의 주입은 통계적으로 유의한 골수 생착속도 지연은 없었으며, 무작위 추출군 및 골수 생착 전 과 후의 IL-2 활성화 조혈모세포 이식군 간에 이식된 CD34+ 세포수의 통계학적인 차이는 없었다. 골수 생착이 이루어진 이후에 IL-2 활성화 조혈모세포 이식술을 시행한 경우는 골수 억압이 관찰되지 않았다. 결론: 고용량 항암 치료 및 자가 조혈모세포 이식술에 병행하는 IL-2 활성화 조혈모세포 이식술은 그 부작용으로서 발열, 피부발진 및 골수 생착의 지연 등이 있을 수 있으며, 자가 조혈모세포 이식 후 골수 생착이 이루어지지 않은 상태에서 시행한 IL-2 활성화 조혈모세포 이식술이 의미있는 골수 생착 지연을 초래하지 않는 것으로 나타났다. 본 연구는 IL-2 의 유용성과 합병증에 대한 후향적 연구로서 향후 보다 많은 증례를 통해서 IL-2 면역 요법의 효과에 대하여 비교 연구를 해야할 것으로 사료된다. Background: High dose chemotherapy(HDCT) with autologous peripheral blood stem cell transplantation(PBSCT) provides a higher degree of tumor debulking in various hematologic or non-hematologic malignancies, but it has the limitation in controlling micro-residual disease and in preventing relapse. Adoptive immunotherapy may conjoin to transplantation to prevent relapse after high dose chemotherapy. At present, many transplantation centers investigated the feasiblity of ex vivo activation of autologous PBSC by interleukin-2(IL-2), followed by the parenteral administration of IL-2 posttransplantation. Methodes: We now report the tolerability, feasibility and engraftment sequences using IL-2 ex vivo activated PBSC transplantation after autologous PBSC transplantation and continuous parenteral IL-2 administration posttransplantation in the 39 patients from March 1997 to February 2000. Among them 29 patients received IL-2 activated PBSC on day 3, 10 patients received after engraftment was achieved. Fever and skin rash were graded by WHO toxicity criteria. Results: There was no toxic death. 2 patients developed third degree fever, 23 patients second degree and 3 patients first degree but 11 patients did not develop fever. There was no patient who developed third degree skin rash, 2 patients second degree, 3 patients first degree but 34 patients did not develop any skin rash. The bone marrow engraftment was D+11.7 days(range 8~33 days) with neutrophil and D+16.1 days(range 7~33 days) with platelet. Comparing with the 72 patients who did not receive IL-2 in same duration and same center, bone marrow engraftment did not delayed(p=0.235, p=0.232, respectively). Among the control group, the post-engratment group and pre-engraftment group, there was no difference with transplanted CD 34+ cell count. Conclusions: High dose chemotherapy with autologous PBSC transplantation followed by IL-2 activated PBSC transplantation and continuous parenteral IL-2 administration posttransplatation is a tolerable and feasible treatment as an adoptive immunotherapy.

동종조혈모세포 및 배양확장된 간엽모세포 동시이식의 가능성

강석윤,김재홍,박준성,김현수,최진혁,임호영,박상진,양말숙,김영진,김효철 대한조혈모세포이식학회 2001 대한조혈모세포이식학회지 Vol.6 No.2

배경: 사람의 골수내에 두가지 종류의 모세포가 밝혀져 있고 혈액질환에서 간엽모세포 (mesenchymal stem cell)의 역할에 대한 연구가 활발해지고 있다. 이런 간엽모세포들은 조혈기능에 관여하는 싸이토카인을 분비하고, 이식시 조혈모세포들의 생착 및 기능적 분화에 많은 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 세포의 형태적 변화나 기능의 소실없이 실험실에서 분리하고 배양확장 시킬 수 있는 기술들의 발달로 최근에는 이를 치료에 이용하는 연구들이 확대되고 있다. 현재까지 많은 연구에 있어 조혈모세포의 경우는 이식 후 공여자의 형태로 전환되지만 간엽모세포의 경우에 있어서는 지속적으로 환자의 형태로 남아있음을 보고하고 있다. 본 저자들은 다양한 혈액질환의 치료에 있어 현재까지 사용되고 있는 일반적인 동종조혈모세포 이식술 뿐만 아니라 조혈모세포와 간엽모세포를 동시에 이식하여 이식 후 생착에 도움을 주고 키메리즘에 변화가 있는지를 알아보고자 12명의 환자를 대상으로 연구를 진행하였다. 방법: 12명의 환자에서 9명은 혈연공여자로 부터 동종 조혈모세포이식술을 시행받았고 3명에 있어서는 조혈모세포와 간엽모세포를 동시에 이식하였다. 이식 전 환자 및 공여자의 말초혈액 또는 골수세포로 부터 얻어진 백혈구를 이용하여 키메리즘을 확인하였고 이식 후 3주부터 10개월이 지난 후 공여자의 형태로 전환되었는지를 확인하기 위해 환자의 골수를 채취하여 간엽모세포를 배양하였고 성일치 이식시에는 DNA microsatellite 다형성검사를 성불일치 이식시에는 Y-염샘체를 이용하여 키메리즘의 변화를 확인하였다. 결과: 동종 조혈모세포이식을 받은 환자 9명에 있어서는 이식 후 9일부터 19일까지에 걸쳐 생착 (평균 13.11일)이 되었고 이식 후 3주째부터 10개월째에 걸쳐 시행한 키메리즘 검사상 모든 환자에서 골수는 공여자의 형태로 전환됨이 확인되었으나 배양된 간엽모세포는 지속적으로 환자의 형태로 남아있었다. 동종 조혈모세포와 배양확장된 간엽모세포의 동시이식이 시행된 3명의 환자에서는 평균 10일째 생착이 되었고 이식 후 3주와 4주째 시행한 키메리즘검사에서 골수내 조혈모세포는 모두 공여자의 형태로 바뀌었지만 간엽모세포는 지속적으로 환자의 형태로 확인되었다. 결론: 현재의 이식방법으로는 동종 간엽모세포의 이식이 어렵고 동시이식의 효과도 불명확하므로 향후 기질세포의 생착을 위한 주입양과 주입방법, 환자자신의 골수내 환경을 마련하기 위한 전처치의 방법 등에 대한 연구가 지속되어야 할 것이며 또한 이를 조기에 발견할 수 있는 실험적도구의 개발에 노력해야 할 것으로 사료된다. Background: Human bone marrow contains two kinds of stem cells, hematopoietic stem cells (HSCs) which can differentiate into mature blood cells and multipotential mesenchymal stem cells (MSCs) which are capable of differentiating into a number of mesenchymal cell lineages. We developed an efficient method of isolation and ex vivo expansion of a homogenous population of MSCs from human bone marrow. These MSCs are shown to secrete hematopoietic cytokines and support hematopoietic progenitors ex vivo. Therefore, enrichment of donor MSC in the graft may be useful in the treatment of many hematologic disorders. Methods: To determine if donor derived MSCs can be engrafted in the recipients with hematologic disorders by allogeneic HSC transplantation (CD34+:2.0-16.0×10^(6)/kg) or cotransplantation of both HSC (CD34+:1.98-12.53×10^(6)/kg) and enriched MSC (1.44-13.79×10^(5)/kg) of donor origin, we investigated MSCs after conventional allogeneic HSC transplantation in 9 patients and in 3 patients with cotransplantation of both enriched MSC and HSC at 1 to 10 months after transplantation. Marrow derived MSCs before and after transplantation were genotyped either by polymerase chain reaction using Y chromosome in gender-mismatched or by microsatellite DNA polymorphism in gender-matched transplantation. Results: We found that MSCs isolated from recipients after allogeneic HSC transplantation or cotransplantation remained as the recipient types in all patients, not of donor genotype, despite successful engraftment by donor type hematopoietic cell. Conclusions: These findings indicate that with current allogeneic HSC transplantation or cotransplantation procedures, the stromal compartment of hematopoiesis is not transplantable in humans. Therefore, the reasons for difficulty of engraftment with donor MSCs needs to be further elucidated.

Rapid Isolation of Adipose Tissue-Derived Stem Cells by the Storage of Lipoaspirates

Young Woo Eom,Hyun Soo Kim,이종은,양말숙,장인근,김효은,이두훈,김영진,박원진,공지현,심광용,이종인 연세대학교의과대학 2011 Yonsei medical journal Vol.52 No.6

Purpose: This study examined a rapid isolation method decreasing the time and cost of the clinical application of adipose tissue-derived stem cells (ASCs). Materials and Methods: Aliquots (10 g) of the lipoaspirates were stored at 4°C without supplying oxygen or nutrients. At the indicated time points, the yield of mononuclear cells was evaluated and the stem cell population was counted by colony forming unit-fibroblast assays. Cell surface markers, stem cell-related transcription factors, and differentiation potentials of ASCs were analyzed. Results: When the lipoaspirates were stored at 4°C, the total yield of mononuclear cells decreased, but the stem cell population was enriched. These ASCs expressed CD44, CD73, CD90, CD105, and HLA-ABC but not CD14, CD31, CD34, CD45, CD117, CD133, and HLA-DR. The number of ASCs increased 1×1014 fold for 120 days. ASCs differentiated into osteoblasts, adipocytes, muscle cells, or neuronal cells. Conclusion: ASCs isolated from lipoaspirates and stored for 24 hours at 4°C have similar properties to ASCs isolated from fresh lipoaspirates. Our results suggest that ASCs can be isolated with high frequency by optimal storage at 4°C for 24 hours, and those ASCs are highly proliferative and multipotent, similar to ASCs isolated from fresh lipoaspirates. These ASCs can be useful for clinical application because they are time- and cost-efficient, and these cells maintain their stemness for a long time, like ASCs isolated from fresh lipoaspirates.

혈액질환치료에 있어 동종말초조혈모세포와 배양확장된 간엽모세포(Mesenchymal Stem Cell)의 동시이식 2예

강석윤,김재홍,박준성,김현수,최진혁,임호영,양말숙,김영진,김효철 대한조혈모세포이식학회 2001 대한조혈모세포이식학회지 Vol.6 No.1

Human bone marrow contain two kinds of stem cells. One is hematopoietic stem cell, and the other is multipotential mesenchymal stem cells which are capable of differentiating into a number of mesenchymal cell lineages. These mesenchymal stem cells are shown to secrete hematopoietic cytokines and support hematopietic progenitors in vitro. Animal models suggest that the transplantation of healthy stromal elements, including mesenchymal stem cells, may enhance the ability of the bone marrow microenvironment to support hematopoiesis after stem cell transplantation. Therefore, We hypothesized that cotransplantation of hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells after high dose chemotherapy would facilitate engraftment of hematopietic stem cells and reduce complications caused by delayed engraftments. And we investigated the safety, feasibility, side effects and hematopoietic effects of in vitro-expanded mesenchymal stem cells in hematologic malignancies receiving allogeneic peripheral stem cell transplantation.

검사방법에 따른 냉동보관 제대혈 내 CD34+세포의 생존력의 차이

안미선,박준성,최진혁,강석윤,이현우,장인근,김영진,정성현,이종은,김효철,양말숙,김효은,엄영우 대한혈액학회 2009 Blood Research Vol.44 No.2

배경: 제대혈 이식에 있어서 신속한 생착이 더 나은 임상 결과를 가져온다. 제대혈 내의 이식된 생존세포의 수는 생착과 관계가 있으므로 냉동 보관된 제대혈에서 CD34+ 세포의 생존능을 정확히 평가하는 것은 임상적으로 중요하다. 저자 등은 냉동보관 된 제대혈에서 냉동보관기간과 측정방법에 따른 세포생존능을 측정하였다. 방법: 본 연구에서는 1∼4년간 냉동보관 되었던 60예의 제대혈을 사용하였다. Trypan blue, DNA 함량 분석, caspase-3 활성 조사, 세포내 esterase 활성도, annexin-V/PI 염색을 통해 냉동 보관되었던 제대혈 내 생존세포를 조사하였다. 결과: Trypan blue 배재 분석을 통해 확인된 바로는 해동 후에 89%의 MNC와 84%의 CD34 양성세포가 생존하였다. CD34 양성세포 중에서는 세포 사멸율이 annexin-V/PI 염색에서는 47%, DNA 함량 분석에서는 5% 미만이었다. Caspase-3 활성화가 거의 관찰되지 않았고, 세포내 esterase 활성도 측정에서 해동 후 2, 4, 6시간에 약 10∼20%의 세포사멸을 보여주었다. 결론: 제대혈 내의 생존세포의 측정은 하나의 방법보다는 몇 개의 상호보완적인 방법들로 측정되어야 한다. Annexin-V/PI 염색과 trypan blue, DNA 함량 분석, caspase-3 활성 조사, 세포내 esterase 활성도 간의 검사결과의 불일치를 볼 때 추후 제대혈 이식의 임상결과들과의 상호분석이 필요할 것으로 생각한다.

독성 및 약물대사 연구를 위한 한국인 부분 간 유래 간세포의 품질 및 활용성 평가

노정권(Jeong-Kwon Noh),장인근(In Keun Jang),김효은(Hyo Eun Kim),이종은(Jong Eun Lee),양말숙(Mal Sook Yang),장은미(Eun Mi Jang),이지현(Ji-Hyun Lee),박혜정(Hey-Jung Park),김영아(Young-A Kim),이석구(Suk-Koo Lee),정호상(Ho-Sang Jeong),안준 한국생물공학회 2014 KSBB Journal Vol.29 No.1

Demand for in vitro pharmacological evaluation and toxicity test using human hepatocytes has been increasing. In USA and Europe, human hepatocytes obtained from donated whole liver unsuitable for transplantation were distributed to researchers and deposited in cell bank facility as cryopreserved vial. In Korea, however, incidence of transplantation-inappropriate whole liver has been quite low and the whole livers almost have so severe liver disease such as fatty or fibrotic liver that cannot meet the demand. In this study we aimed to isolate human hepatocytes from liver resection surgery-originated partial liver, and assure the isolated human hepatocytes and its cryopreserved hepatocytes to be qualified for the in vitro pharmacological evaluation and drug toxicity tests. We compared those with commercially available human hepatocyte, BD GenTest<SUP>TM</SUP> by cell morphology, hepatic gene expression, urea synthesis, albumin secretion, ammonia removal, and cytochrome P450 induction activities. Changes in hepatotoxic gene expression after cryopreservation are evaluated with a typical hepatotoxic drug, acetaminophen. Consequently, the fresh hepatocytes from the partial liver and its cryopreserved hepatocytes expressed their intrinsic hepatic functions well and showed equal hepatotoxicity gene expression trend regardless to cryopreservation. Therefore, liver resection surgery-originated partial liver can be used as a useful source of human hepatocytes for various pharmacological and hepatotoxicity test.