인공수정에 의한 Urechis unicinctus 난자의 난할형식

신길상,이대희,고태영,Shin, Kil-Sang,Lee, Dae-Hee,Ko, Tae-Young 한국현미경학회 2004 Applied microscopy Vol.34 No.1

본 연구에서는 등황란인 U. unicinctus 수정란의 난할과정과 형식에 대하여 관찰된 바를 보고하였다. U unicinctus성숙란을 인공수정했을 때 난할은 핵 개방(germinal vesicle breakdown)과 제1, 2감수분열 후에 수행되었으며, 유생기 까지 난할은 등할(equal cleavage), 전할(holoblastic cleavage)이었고 난할형식은 나선형 난할(spiral cleavage)인 것으로 관찰되었다. 최초 3회의 난할이 경할$\rightarrow$경할$\rightarrow$수평할이었고, 이후 경할-수평할이 반복되는 것으로 보였다. 4세포기에 할구의 배열에서 일부 할구들이 동물극으로 융기한 것과 8세포기에서 식물극 할구 배열이 동물극 할구 배열에 대하여 사선 배열한 것 등은 나선형 난할에서만 볼 수 있는 특징이었으나 제 3차 난할인 수평할에서 등할, 전할인 것이 관찰되므로서 나선형 난할을 수행하는 Spiralian의 전형에 속하지는 않는 것으로 보였다. 4세포기 이후의 할구 배열이 사선배열, 즉 나선형인 근거를 항-$\alpha$-,-$\beta$-튜블린 처리에 의해 관찰된 유사분열 기구의 행위로서 볼 수 있었다. 4$\rightarrow$8세포기의 유사분열 기구는 동물극-식물극 축에 수직으로 발생하고 사선방향으로 선회한 후 난할하므로서 결과에서 수평할 및 할구의 사선배열이 가능한 것을 볼 수 있었다. When U. unicinctus mature oocytes were fertilized in vitro, germinal vesicle breakdown (GVBD) and meioses occurred and the zygotes entered cleavage stage. A modified pattern of spiral cleavages, suggestively based on behavior of mitotic spindles, have been observed in this work. The first and second cleavages were meridional and the third was equatorial, and then followed by repetitions of meridional-equatorial cleavage. The cleavage of the isolecithal egg were equal and holoblastic and its patterns were spiral. The anti-${\alpha}-,-{\beta}$- tubulin reactions and confocal microscopy revealed mitotic apparates tilted obliquely at each mitosis causing oblique displacements of the blastomeres. Despite isolecithal distribution of yolk, this observations implicated that tilting of mitotic apparates induced spiral cleavage and the displacements of blastomeres. However, these features would not be the typical spiral cleavage, but represented a modified pattern of known Spiralian s in the sense of the equal cleavage. During the first cleavage, heart-shaped eggs have been produced. Electron microscopies exhibited the first cleavage furrow extended with its membranous structure deeply into the cytoplasm. Contractile ring has not been observed.

HeLa세포 허족의 액틴 미세섬유에 대한 면역 형광현미경적 연구

신길상,김호진,김완종 순천향대학교 기초과학연구소 2000 순천향자연과학연구 논문집 Vol.6 No.1

Actin cytoskeletons of HeLa cell-pseudopodia are observed in confocal laser scanning microscopic field after the treatment with monoclonal anti-actin and anti mouse IgG-FITC. The cytoskeletons are then compared with the control group stained with coomassie blue. The network of actin microfilaments in lamellae and meshwork in leading edge can be observed while stress fiber are observed on ventral surface of the cells which are intimately associated with substrate. The meshworks are fine microfilaments embedded in peripheral pale cytoplasm of the pseudopodium, the networks are composed of rather thick cross linked actin microfilaments in the lamellae in the middle cytoplasm. The thicker stress fibers are often adhered to the inside of ventral undulating cell membrane at the peripheral psuedopodium. These actin filaments are conserved especially in microwave field(microwave fixator KC600A). The features of the microfilaments and suggested functions are discussed.

항-α-Tubulin 면역 반응에 의한 한국산 개불(Urechis unicinctus) 정자에서의 α-Tubulin 분포

신길상 순천향대학교 기초과학연구소 1997 순천향자연과학연구 논문집 Vol.3 No.1

The Urechis unicinctus sperm prepared from storage sac are investigated to identify α-tubulin of axoneme microtubules using mouse monoclonal anti-α-tubulin as the first Ab and Gold(10nm) conjugated goat anti-mouse IgG as the Ab marker. The Ag-Ab reaction analyzed excellently the distributions of α-tubulin and the gold particles incorporated with proximal and distal centriols, flagella, manchette microtubules. The reactions were performed after paraformaldehyde fixation, the samples are embedded in plastics and further treated with electron microscopical methods. The general morphology, shape of manchette and especially the degree of compaction of the head, indicate that many sperm are yet in differentiation process. On the other hand, some features of the sperm, such as acrosome and nuclear fossa, are highly differentiated in comparison with mammalian sperm and it is known that some sperm from the proximal portion of storage sac are capable to fertilize egg in sea water.

개불(Urechis unicinctus) 전장 섬모 상피세포의 미세구조와 여과기능

신길상,이순희,Shin, Kil-Sang,Lee, Sun-Hee 한국현미경학회 1998 Applied microscopy Vol.28 No.4

It is suggested that Urechis unicinctus is a filler feeder as like many tide and watery invertebrates which filtrate food materials by ciliary movement. However, the structure of the filter is not yet known in U. unicinctus, nor the filtering mechanism is not well understood. This study reveals ciliated epithelial cells in the foregut and the features of the cilia are good accord with that of known filtrating apparatus of other tide animals. This may implies that the foregut is in function of filtration and the food materials are filtrated by the ciliary movement. With the observation of the filtrating apparatus in the foregut, the intestine of U. unicinctus can be functionally compartmented into 3 parts. These are already known midgut and hindgut in function of digestion and respiration respectively, and the foregut in function of filtrating apparatus for foods. The filtrating apparatus of U. unicinctus is composed of the pseudostratified columnar epithelial cells with numerous cilia. The cilia are well differentiated kinocilia with the typical microtubule pattern, kinetosome and cilia roots. There are two kinds of striated cilia roots, the main root and the accessory root. The main root is extended perpendicularly from the cell surface to basement membrane and the short accessory root is branched with an acute angle of about $80^{\circ}$ from the main root at level of basal plate of the kinetosome. The spacial approaches of the main root with the large fused form of mitochondria is one of the characteristic features which might be in structural consideration an intimate association between energy source and energy mass consuming cell organelles.

적외선 온도감응기를 장착한 마이크로파 오븐의 생체물질 고정효과

신길상 한국통합생물학회 1994 동물학회지 Vol.37 No.2

마이크로파 에너지로서 현미경 관찰을 위한 생체물질을 고정할 때, 고정효과는 화학 고정액을 사용할 때와 비교하여 보다 우수한 또는 적어도 동일한 고정효과를 볼 수 있다는 것은 알려진 사실이다. 그러나 기존의 마이크로파 오븐을 사용하여 생체물질을 고정하면 고정 정도에 일정성이 없는데, 이는 마이크로파가 균일하게 조사되지 않고 고정에 적절하도록 마이크로팍의 강도를 조절하기 어려우며, 이로 인하여 정확한 고정온도의 측정이 불가능하기 때문으로 생각된다. 이 연구에서는 마이크로파가 조사되는 동안 시료의 온도를 측정할 수 없는 기존의 마이크연.파 오븐의 단점을 보완하기 위하여 비접촉식 적외선 온도 감응기를 장착한 마이크로파 오븐을 개발하였으며 고정효과를 관찰하기 위하여는 포유류의 기준 조직으로 알려진 생쥐의 신장을 고정하였다 고정효과는 전체적인 구조와 세부 구조의 보존이 모두 우수하였고 최적의 고정온도는 28$\pm$1$^{\circ}C$(완충용액 20 ml, 10초) 이었다. 이와같이 고정된 재료는 고정효과 뿐만 아니라 염색성이 좋아서 조직화학 반응이 우수하고, 냉동절편법과 연계했을 때 전체 절편제작 과정이 2~4시간 내에 완료될 수 있었다 이때 절편의 질(질)은 화학 고정액이나 냉동절편 법에 의하여 제작된 것 보다 우수하였다.

개불(Urechis unicinctus) Sperm Ball과 정자의 미세구조와 금 입자 면역 반응에 의한 $\alpha-Tubulin$의 분포

신길상,Shin, Kil-Sang 한국현미경학회 1998 Applied microscopy Vol.28 No.2

The Urechis unicinctus sperm and spermatogenic cells prepared from the testis are investigated to identify $\alpha-tubulin$ of axoneme microtubules using mouse monoclonal $anti-\alpha-tubulin$ as the first Ab and Gold(10nm) conjugated goat anti-mouse IgG as the Ab marker. The Ag-Ab reaction analyzed excellently the localization of $\alpha-tubulin$ and the gold particles incorporated with the proximal and distal centrioles, manchette microtubules, and flagellum. The gold particles can be also observed in the spermatogenic cells while the cells are still in sperm ball which is composed of a somatic cell and spermatogenic cells. The sperm ball is the functional unit of sperm production in U unicinctus testis. The spermatids are developed from the spermatogenic cells in the sperm ball and released into the testis cavity through a cortical cytoplasmic opening. The spermatid architectures are similar with the mature sperm of the testis cavity in aspects of shape of discoid acrosome, degree of nuclear condensation and ring type of mitochondrion. However, the distal centriole connecting with the flagella can be observed from the mature sperm while the both proximal and distal centrioles reveal only in the spermatids. The proximal centriole is directly connected with nuclear outer membrane during the stage of nuclear condensation and oriented perpendicularly to the distal centriole whose axis coinciding with the longitudinal axis of the spermatozoon. There are indications that the distal centriole is intimately associated with the polymerization of the flagellum. The manchette microtubules appear during spermatid development but the mature sperm have round head and no conspicuous middle piece.

항-액틴-금 입자 표지에 의한 개불(Urechis unicinctus) 정자 및 정세포 핵 Actin의 분포

신길상,김호진,김완종,Shin, Kil-Sang,Kim, Ho-Jin,Kim, Wan-Jong 한국현미경학회 2000 Applied microscopy Vol.30 No.4

1. 아메바 항-액틴의 Ag-Ab 반응과 이를 항-생쥐 IgG-금 입자로 표지한 결과는 주로 정세 포 및 정자의 핵질에 특이적으로 표지되었고 첨체에서는 그 반응을 볼 수 없었다. 2. 표지된 항-액탠 금 입자로 볼 때 정자 핵질의 G-액틴 또는 G-actin oligomer는 정세포의 F-액틴에서 유래되는 것으로 사료된다. 3. 첨체의 액틴은 주로 F-액틴으로 첨체돌기 형성에 참여하지 않는 위상인 것으로 관찰된다. 4. 미세구조의 변화, 정세포 체적의 감소, 정세포 및 정자 핵에 표지되는 금 입자의 증가와 이들 현상이 나타나는 동시성으로 볼 때 정세포 핵의 형태변화의 내용은 응축이고 이는 F-actin의 탈중합 반응에 의한 G-액틴의 생성이 원인일 것으로 사료된다. Urechis unicinctus spermatogenic cells, sperm and spermatids, prepared from testis are investigated to identify nuclear actin using amoeba monorlonal anti-actin as the first Ab and gold particles (10 nm) conjugated mouse IgG (immunogold) as the Ab marker. The Ag-Ab reactions analyzed the localization of nuclear actin of the spermatogenic cells and the immunogold particles incorporated mainly with nuclear matrices. A few immunogold particles are merged into the acrosomes and the other architectures of spermatogenic cells, such as mitochondrion and centrioles. It is often observed and there is a tendency in which the incorporated immunogold particles are increased in number in the nuclear matrices of sperm compared with that of spermatids The increments and decrements of the incorporated immunogold particles according to developmental stages and the spermatogenic architec-tures are interpreted and discussed in aspect of acrosomal function and of nuclear condensation of spermatids.

적외선 온도감응기를 장착한 마이크로파 고정기에 의한 생체조직 고정효과와 조직화학적 특성

신길상,민소연,김완종,손태호 한국통합생물학회 1995 동물학회지 Vol.38 No.3

적외선 온도 감응기를 장착한 기존의 마이크로파 고정기의 단점을 보완하기 위해서 주변 온도를 보상할 수 있는 고정기를 개발하였다. 이를 이용하여 흰쥐의 혀, 췌장 및 소장을 고정(물리고정)한 후 몇 가지 염색법을 적용하여 염색성을 관찰하였고, 췌장의 내, 외분비 세포의 미세구조를 전자현미경으로 검경하였으며 단백질의 양과 bands의 양상을 조사하였다. 또한 이 결과들을 통상적인 화학고정을 시행한 경우와 비교하여 마이크로파에 의한 생체물질의 고정효과를 검증하고 조직화학에 응용될 수 있는지를 조사하였다. 흰쥐 혀의 횡단면을 H-E 염색하였을 경우, 두 고정법에서 염색성은 유사하였으나 물리고정에 비해 화학고정에 의한 관찰된 조직은 근육층의 분리가 관찰되었다. 췌장조직을 Feulgen 반응을 이용하여 염색하였을 경우, 물리고정한 군에서 반응산물이 보다 명확하게 관찰되었으며, 십이지장 융모에서 PAS 반응에 의한 염색성도 물리고정의 경우에서 배상세포에 특이적으로 강하게 나타났다. 물리고정을 한 후 짧은 시간동안 2차로 화학고정했을 경우, 췌장 내, 외 분비세포들의 전자현미경적 미세구조는 막 구조 및 세포기관이나 분비과립등의 보존상태 등에서 통상적인 화학고정법의 결과와 유사하게 관찰되었다. 물리고정한 시료의 질과 염색성이 우수하다는 사실에 근거하여 단백질 함량을 조사한 결과, 물리고정시 단백질의 추출이 비교적 적은 것으로 조사되었다. 이상과 같은 결과들은 마이크로파로 생체조직을 고정할 경우 대부분의 단백질들의 불용성화가 일어남으로써 미세구조의 고정 및 염색성이 증대되는 것으로 판단되었다. 현상에는 반드시 rosy transformant의 염색체 삽입에 의해서 만이 아니라 세포질내에서도 construct내의 rosy 유전자의 발현이 가능한 것으로 분석되었다. 또한 형질전환율에 있어서는 Pc[(ry+)B]와p[(ry+)$\Delta$SX9] construct 간에 유의한 차가 없는 것으로 나타났다. 이상의 결과로 볼 때, 실험 목적에 따라 자율적인 P element 또는 helper DNA를 이용한 비자율적인 P element를 효과적인 vector 로 선택 이용함으로써 특정 유전자를 곤충집단내로 침투 및 고정시킬 수 있다고 판단된다. The present study was carried out to investigate the effect of microwave fixation in comparison with that of chemical fixation in preparing the microscopic samples. The microwave fixator was equipped with infrared-temperature sensor, and that was designed to compensate air temperature in the microwave fixator. In the microwave fixation, rat tongue was well preserved in terms of muscular fasciculus and pancreas stained by Feulgen reagents showed clear reaction products in the nucleus. Reaction products by PAS method in duodenal villi appeared specifically at the goblet cells. In electron microscopy, pancreatic cellular components such as secretory granules and collagen bundles were well preserved in both fixations. In aspect of histochemical reaction and electron microscopy, high quality was due to the protein content of microwave fixed specimen. The microwave fixation method saved total duration engaging microscopic preparation.

개불 (Urechis unicinctus) 체강에서의 단위집단 정자형성(Solitary Spermatogenesis)에 관한 미세구조 연구

신길상,김완종,Shin, Kil-Sang,Kim, Wan-Jong 한국현미경학회 2002 Applied microscopy Vol.32 No.2

U. unicinctus의 초기 정자형성 과정은 체액 부유성 웅성 생식세포 집단(cluster)에서 수행되는 것으로 관찰되었다. 이들 웅성 생식세포 집단은 체강의 체액 속에 산재하고 다른 체세포와 특정 구조 또는 조직을 형성하지 않았으므로 분산형 정자형성(diffuse spermatogenesis) 또는 단위집단 정자형성 (solitary spermatogenesis) 과정을 거치는 것으로 볼 수 있었다. 단위집단 정자 형성과정은 생식세포들이 체세포와 함께 조직을 형성하는 포유동물의 집단 정자형성(localized spermatogenesis)과 비교하여 미세구조 측면에서 여러 가지 특징을 갖는 것으로 관찰되었다. U. unicinctus의 단위집단 정자형성에서 웅성 생식세포 발생단계는 핵의 크기, 핵질(nuclear matrices)의 위상 그리고 핵 응축도 및 웅성 생식세포 기관의 발달 상태를 고려하여 따로 분류하였다. 정원세포와 제1 정모세포의 차이는 핵질의 위상에서 분명하였고, 정모세포와 정세포는 핵 응축도에서 차이를 볼 수 있었다. 단위집단을 형성하는 시기는 정원세포기로서 각 정원세포 돌기들이 서로 융합한다는 증거를 볼 수 있었다. 제1, 제2 정모세포 그리고 정세포들은 단위집단의 외곽에 부착하고 있었으며 내부에는 웅성 생식세포 응축 과정에 수반되어 분리된 또는 제거된 세포질 성분(cytoplasmic mass)이 채워지는 것으로 볼 수 있었다. 성숙 후 단위집단에서 체강으로 분리되는 시기는 정세포기이며, 체강에서 관찰된 성숙정자는 물질농도에서 구획이 형성된 원반형 첨체, 미토콘드리아와 편모의 구조로 보아서 운동성과 수정력이 있는 것으로 보인다. 이와 같은 단위집단 생식세포 형성은 체액을 통한 간접 방법에 의해 대사 작용에 필요한 정보와 물질을 교환하기 때문에 가능한 것으로 추측하였으며, 이를 응용하면 적절한 양의 체액을 공급하여 in vitro에서 생식세포 배양이 가능할 것으로 사료되었다. Early spermatocytes of U. unicinctus are found in cluster floating in the coelomic fluid. The spermatocytes in a cluster form a syncytium or cytoplasmic mass, but there are no indications that the cytoplasmic mass is a component of a somatic cell. This work suggested that this type of spermatogenesis can be subordinated to solitary spermatogenesis in the sense excluding structural and functional support of a somatic cell for sperm developments. The solitary spermatogenesis in U. unicinctus is different in appearances and developmental details of sperm organelles and stage distributions from that of localized spermatogenesis. The acrosomal rudiments and centrioles can be observed in the early single cells of spermatogonia and clearly disclosed in the primary spermatocyte. In the stage of secondary spermatocyte, the acrosomal precursor and the centrioles begin to move to each cytoplasmic poles. The polarities of the organelles are attained at stage of spermatids. The spermatocytes and spermatids are arranged circumferentially along the cytoplasmic mass in which some amorphological cytoplasmic components are included. The spermatids reveal to be detached from the cytoplasmic mass into coelomic fluid. It suggests that the spermatogenesis are progressed in support of coelomic fluid, and the fact take into consideration that the spermatogenic cells can be in vitro cultured without somatic cells and with supplements of coelomic fluid.

마이크로파 조사에 의한 세포 미세구조의 고정 효과

신길상,김완종,전진석,Shin, Kil-Sang,Kim, Wan-Jong,Jeon, Jin-Seok 한국현미경학회 1996 Applied microscopy Vol.26 No.4

The microwave fixator has recently been introduced in morphological research. The present study was carried out to investigate the ultrastructural effects of microwave fixation of rat brain. kidney, liver and skeletal muscle tissues. The results are as follows: In the case of microwave fixed cerebrum. the cytoplasmic processes of neurons and the various membranous organelles such as nuclear envelope, mitochondria, rough endoplasmic reticulum and Golgi apparatus were well preserved, The myelin sheath wrapping neuronal axon was prominent. Microwave fixed hepatocytes showed the microvilli on the free surface of bile canaliculus, the evident nucleolar components, and typical organelles. In nephron, ultrastructures of glomerulus and Bowman's capsule were preserved, and also tubular wall were structurally observed. Among the skeletal muscle cells, plentiful collagen fibers were appeared, myofibrils and mitochondria were typically observed. In conclusion, the microwave fixation procedures result in an good preservation of the tissues and would be time- and reagent-saving.