일반발표 - 생화학 : PCR 에 의한 세포내 insert DNA 의 확인

류기중,유장걸,홍경애 ( S . Y . Yang ) 한국토양비료학회 1993 한국토양비료학회 학술발표회 Vol.1993 No.50

植物 Protoplast의 細胞壁再生과 Cytokinin

柳基中 제주대학교 아열대농업생명과학연구소 1989 아열대농업생명과학연구지 Vol.6 No.-

식물 Protoplast의 세포벽재생과 Cytokinin

류기중 濟州大學校 亞熱帶農業硏究所 1989 亞熱帶農業硏究 Vol.6 No.-

Cytokinin의 하나인 benzyladenine(BA)이 대두 Glycine max(L) Merr, var. ACME)에 있어서 조직수준의 상처치유 즉, 상처 callus형성을 촉진하는 기능이 있다는 것과 protoplast의 세포벽재생에 있어서 BA의 역할을 구명하고자 하였다. 아울러 BA와 결합하는 잎단백을 조사하고 receptor로서의 가능성을 검토하였다.

생화학 및 분자생물학 : PCR 에 의한 세포내 insert DNA 의 확인

류기중,유장걸,홍경애,S . Y . Yang 한국응용생명화학회(구 한국농화학회) 1993 한국응용생명화학회 학술발표회 Vol.1993 No.-

PCR 을 이용한 cDNA 의 cloning

류기중 한국농화학회 1992 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.35 No.4

Polymerase chain reaction(PCR)은 특이성과 증폭율이 매우 높아 각종 DNA의 증폭에 널리 이용되고 있으나, DNA polymerase의 mismatching error가 무시못할 정도로 크기 때문에 sequence가 알려져 있지 않은 cDNA의 cloning에 적용하는 데에는 어려움이 있다. 그러나 gene expression system이 확립되어 있고 gene product의 특성이 알려져 있다면 DNA의 full sequence를 모르는 cDNA의 cloning에도 PCR이 이용될 수 있다. 본 연구에서는, 사람 면역 방어 기전에 중요한 HLA class I 유전자의 cDNA를 model로 PCR을 이용한 cloning 방법을 확립하였다. HLA class I의 A, B, C locus 중 B-locus gene을 대상으로 하였고, 실험에 사용된 cell line은 B-35/B-51 heterozygote로써 이의 gene products의 isoelectric point(pI)가 알려져 있다. PCR을 이용하여 clone된 gene product의 성상은 expression-deficient mutant cell line에 transfection하여 규명하였다. B-35와 B-51 각각의 cDNA는 poly A RNA를 reverse transcription한 후, 두번의 연속적인 PCR로 amplification하여, E. coli에 transformation하는 과정을 거쳐 얻었다. Transformants 중 각각의 cDNA clone은 B-35 또는 B-51 specific primer pair를 이용한 transformant 세퍼추출액의 PCR로써 screening 하였다. 이 방법은 종래의 plasmid DNA 분리/restriction enzyme digestion 과정을 거치지 않고 bacterial colony의 insert존재유무를 확인할 수 있을 뿐만 아니라, DNA sequencing을 시행하지 않거나 insert gene product에 대한 information이 없이도 clone의 allele type을 결정할 수 있다는 장점이 있다. PCR reaction intrinsic error의 존재유무는, HLA class I이 발현되지 않는 mutant cell line과 B-locus antigen-specific monoclonal antibody를 이용한 expression study로 확인하였다. 사용된 RSV. 5(neo) vector는 eukaryotic expression vector로 개발되었으나, 본 연구에서는 expression 뿐만 아니라 cloning과 sequencing에도 이용하여 single vector system 확립을 목적으로 사용하였다. Clone 중 B-35 type의 expression 여부를 Fluorescence Activated Cell Sorter(FACS)로 선정된, cell clone의 plasma membrane에 B-35 type class I protein이 expression됨을 확인하였다. 또한, 이 expression product는 원래 세포의 product와 동일한 pI를 가지며 B-35에 specific한 monoclonal antibody에 의해 인지되는 것이 확인되었다. 이 clone에 대해 DNA sequence를 조사한 결과, 지금까지 sequence가 알려져 B-35 alleles (B-3501, B-3502) 중 B-3501과 유사하였으나, 오직 한 base pair가 다름을 확인하였다. 이로부터 유추된 cloned gene product의 pI는 isolelectrofocusing data와 일치하였다.

Cloning and Expression of Escherichia coli Ornithine Transcarbamylase Gene, argI

류기중,유장걸,고영환,김찬식,송성준,오영선,이선주,Riu, Key-Zung,U, Zang-Kual,Ko, Young-Hwan,Kim, Chan-Shik,Song, Sung-Jun,Oh, Young-Seon,Lee, Sun-Joo 한국응용생명화학회 1995 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.38 No.2

Escherichia coli의 오르니틴 트란스카바밀라제는 오르니틴과 카바밀인산으로부터 시트룰린의 합성을 촉진시키는 효소이다. 이 효소의 기능과 구조와의 상관관계, 반응메카니즘 등 생화학적 연구를 하기 위하여 대량의 효소를 추출할 필요가 있다. 본 연구는 오르니틴 트란스카바밀라제의 대량생산 시스템을 확립하기 위하여 E. coli argI 유전자를 E. coli $DH5{\alpha}$ 세포의 염색체 DNA를 추출한 후에 PCR 방법으로 증폭시켜 얻었다. 증폭된 argI 유전자를 단핵생물 단백질 발현벡터인 pKK223-3에 접합시킨 후, 오르니틴 트란스카바밀라제가 존재하지 않은 E. coli TB2 세포에 클로닝 시켰다. 이 세포로부터 생산된 오르니틴 트란스카바밀라제는 암모늄염에 의한 분할, 열변성, 크로마토그래피 등을 사용하여 순수하게 분리하였다. SDS 단백질 전기영동 결과 약 38 kDa 크기의 효소가 순수하게 얻어졌다. 반응속도론적 실험결과 $K_{cat}$은 $1{\times}10^5m^{-1}$, $K_M$은 오르니틴에 대하여는 0.35 mM, 카바밀인산에 관하여는 0.06 mM이 각각 얻어졌다. 이 결과는 야생형 오르니틴 트란스카바밀라제의 반응속도 인자들과 비슷한 값이다. 본 연구는 이들 결과로부터 오르니틴 트란스카바밀라제의 기능을 하는 E. coli argI 유전자가 클로닝 되었음을 확인하였다. Escherichia Coli ornithine transcarbamylase is the enzyme which catalyzes the L-citrulline biosynthesis from L-ornithine and carbamyl phosphate. To facilitate the purification of enzyme which will be used for many biochemical studies such as structure and function relationships and catalytic mechanisms, the cloning and expression of E. coli argI gene for ornithine transcarbamylase was conducted. argI was amplified from genomic DNA of E. coli strain of $DH5{\alpha}$, by polymerization chain reaction (PCR) method. The amplified argI gene was ligated to the prokaryotic expression vector pKK223-3 and used for transformation of E. coli TB2 which was deficient of ornithine transcarbamylase. The over-produced enzyme by the tnansformant was purified by ammonium sulfate fractionation, heat denaturation and affinity chromatography. The result of SDS denaturation gel electrophoresis for the purified enzyme showed a single band of about 38 kDa of ornithine transcarbamylase. Kinetic data for the expressed enzyme gave almost the s?????? values as those of the wild type enzyme. The $k_{cat}$, of the enzyme was $1.0{\times}10^5min^{-1}$, and $K_ms$ for ornithine and carbamyl phosphate were 0.35 mM and 0.06 mM, respectively.

대두(Glycine max) protoplast의 세포벽재생에 대한 benzyladenine의 영향

박창규,류기중 濟州大學校 放射能利用硏究所 1992 연구보고 Vol.7 No.-

대두(Glycine max)의 β-1,3-glucanase를 분리동정하고 benzyladenine(BA)이 이효소의 세포내 함량과 활동도에 미치는 영향을 조사하였다. 또 세포벽의 callose함량과 protoplast의 세포벽재생에 미치는 BA의 영향을 조사하여, cytokinin이 식물의 세포벽재생을 촉진하는 기능이 있음을 확인하고 세포벽재생에 있어서 cytokinin의 작용기구를 검토하였다. 대두 β-1,3-Glucanase는 21KD의 polypeptide로 동정되었는데 이 polypeptide의 세포내함량과 효소활성은 BA처리에 의하여 저하되었다. 그리고 callus세포벽의 callose함량과 protoplast의 세포벽 재생율이 BA 처리에 의하여 증가되었다. 이 결과들은 cytokinin이 세포의 β-1,3- glucanase 수준을 저하시켜 callose분해를 억제함으로써 세포벽 재생을 촉진할 수 있음을 보여주었다. A β-1,3-glucanase of soybean(Glycine max) was isolated, and the effects of benzyladenine(BA) on celluar levels of the enzyme content and activity were studied. The effects of BA on callose content in cell wall and wall regeneration of protoplasts were also studied to show promoting effect of cytokinin in cell wall regeneration and to elucidate action mode of cytokinin. The palypeptide of 21KD was identified as β-1,3-glucanase, and the cellular content and activity of this polypeptide were decreased by BA treatment. The callose content in cell wall of callus and the wall regeneration of protoplasts were increased by BA treatment. These results indicate that cytokinin promotes cell wall regeneration by inhibition of callose degradation via decreasing β-1,3-glucanase level in cell.

Escherichia coli 오르니틴 트란스카바밀라제의 유전자 argⅠ 의 클로닝 및 발현

류기중(Key Zung Riu),유장걸(Zang Kual U),고영환(Young Hwan Ko),김찬식(Chan Shik Kim),송성준(Sung Jun Song),오영선(Young Seon Oh),이선주(Sun Joo Lee) 한국응용생명화학회 1995 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.38 No.2

Escherichia Coli ornithine transcarbamylase is the enzyme which catalyzes the L-citrulline biosynthesis from L-ornithine and carbamyl phosphate. To facilitate the purification of enzyme which will be used for many biochemical studies such as structure and function relationships and catalytic mechanisms, the cloning and expression of E. coli argI gene for ornithine transcarbamylase was conducted. argI was amplified from genomic DNA of E. coli strain of DH5α, by polymerization chain reaction (PCR) method. The amplified argI gene was ligated to the prokaryotic expression vector pKK223-3 and used for transformation of E. coli TB2 which was deficient of ornithine transcarbamylase. The over-produced enzyme by the tnansformant was purified by ammonium sulfate fractionation, heat denaturation and affinity chromatography. The result of SDS denaturation gel electrophoresis for the purified enzyme showed a single band of about 38 kDa of ornithine transcarbamylase. Kinetic data for the expressed enzyme gave almost the scone values as those of the wild type enzyme. The k_(cat), of the enzyme was 1.0×10^5 min^(-1) and K_ms for ornithine and carbamyl phosphate were 0.35 mM and 0.06 mM, respectively.

Cytokinin과 대두(Glycine max)잎단백질의 결합에 대하여

류기중,박창규,정창조 제주대학교 방사능이용연구소 1986 연구보고 Vol.2 No.-

cytokinin과 단백질의 결합을 간단하게 검정하는 방법으로서 전기영동법을 시도하고, 대두의 잎단백질과 cytokinin의 결합여부, cytokinin에 대한 affinity가 있는 단백질의 종류와 상대적 affinity를 조사하였다. 검토된 전기영동법은 cytokinin과 단백질의 결합 뿐만아니라, cytokinin에 대한 상대적 affinity를 동시에 검정할 수 있는 장점을 가지고 있었다. Ammonium sulfate 침전법, Sephadex G-25 chromatography, paper chromatography, 그리고 전기영동으로 대두의 잎단백질 중에 BA와 결합하는 단백질이 있음을 확인할 수 있었다. 전기영동법으로 검정한 결과 BA와 결합하는 것이 3 group이 있고, 이중에서 전기영동 이동도로 보아 분자량이 작은 단백질 분획과 전기영동 이동도 0.4부근의 분획은 BA에 대한 affinity가 비교적 낮은 반면, 이동도 0.0∼0.2의 분획은 affinity가 큰 것으로 생각되었다. A polyacrylamide gel electrophoresis technique was applied to cytokinin-protein binding assay. Binding of soybean leaf proteins to cytokinin and relative affinities of protein fractions to cytokinin were studied. The electrophoresis technique appeared to be very useful for determination of cytokinin-protein binding, for identification of protein species binding to cytokinin, and for comparison of relative affinities of the proteins to cytokinin. The presence of cytokinin-binding proteins in soybean leaves was confirmed from assays with ammonium sulfate precipitation, Sephadex G-25 chromatography, paper chromatography, and electrophoresis. Three groups of cytokinin-binding proteins were identified in the soybean leaf protein extract and two of the three showed low affinity to cytokinin, however, the third one with mobility between 0.0∼0.2, probably high molecular weight protein (s), showed high affinity in the electrophoretic analysis.

Agrobacterium rhizogenes 를 이용한 Populus tremuloides 의 형질전환

류기중(Key Zung Riu),소인섭(In Sup So),유장걸(Zang Kual U),고영환(Yong Hwan Ko),이선주(Sun Joo Lee),(Wesley P . Hackett) 한국응용생명화학회 1995 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.38 No.2

Several factors affecting on transformation efficiency were studied to establish a Agrobacterium rhizogenes mediated system for the transformation of Populus species, and We could obtaine tansgenic plantlets expressing the introduced gene. Leaf sections were more sensitive than stem sections to kanamycin and thought to be better material for transformant screening. The bacterial density did not affect on the efficiency of transformation over the range of 4×10^5∼7×10^9 cfu. The optimum period for co-cultivation was one day or shorter. Both of the optimum concentrations of cefotaxime and ampicillin in the medium were 250 ㎍/㎖ for elimination of bacteria from the inoculated leaf sections. The addition of acetosyringone in the bacterial culture medium increased transformation rate, and the highest rate was obtained at 50 μM of acetosyringone. The transformed galls could be selectively induced and gown on the growth regulator-free medium or on the medium containing 100 ㎍/㎖ or higher contrition of kanamycin. The roots were induced from the galls incited by A rhizogenes within 3 weeks on the growth regulator-free medium as well as on the medium containing growth regulators. The plantlets were regenerated from the galls cultured for 6 weeks on the medium containing 0.05 ㎎/㎖ of NAA and 0.5 ㎎/㎖ of BA. The expressions of the introduced opine gene in the transformed galls and plantlets were confirmed by the analysis of agropine and mannopine.