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Caspase-3-facilitated Stoichiometric Cleavage of a Large Recombinant Polyprotein
Moonil Kim(김문일) 한국생명과학회 2015 생명과학회지 Vol.25 No.4
선행연구에서 카스파제-3 효소가 DEVD 기질을 완전히 절단하는 반면 IETD 기질은 DEVD의 약 50%정도만을 부분적으로 분해한다는 사실을 보고하였다. 본 연구에서는 정제된 폴리-단백질이 카스파제-3 단백질 분해효소의 기질에 따른 차별적인 분해활성에 의해 프로세싱 되는 양상을 분석하였다. 모델 단백질로서 GST, MBP, RFP 세 종류의 단백질을 DEVD 및 IETD 펩타이드로 연결시킨 폴리-단백질을 제작하였으며, 폴리-단백질은C-말단에 6개의 히스티딘 태그가 결합되도록 클로닝 되었다. IMAC 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제된 재조합 단백질은 SDS-PAGE 분석을 통해 분자량이 약 93 kDa으로 나타났으며, 카스파제-3 효소의 처리에 의해 각각 MBP:RFP, MBP 그리고 GST 3종류의 단백질 절편으로 절단 및 분리되었다. 이 연구를 통해 단백질 분해효소와 기질 간의 반응성의 차이를 이용하여 폴리-단백질을 정량적으로 프로세싱 할 수 있다는 예를 보여주었다. In this study, it is reported that a large polyprotein can be stoichiometrically cleaved by the use of caspase-3-dependent proteolysis. Previously, it has been shown that the proteolytic IETD motif was partially processed when treated with caspase-3, while the DEVD motif was completely cleaved. The cleavage efficiency of the DEVD-based substrate was approximately 2.0 times higher than that of the IETD substrate, in response to caspase-3. Based on this, 3 protein genes of interest were genetically linked to each other by adding two proteolytic cleavage sequences, DEVD and IETD, for caspase-3. Particularly, glutathione-S transferase (GST), maltose binding protein (MBP), and red fluorescent protein (RFP) were chosen as model proteins due to the variation in their size. The expressed polyprotein was purified by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) via a hexa-histidine tag at the C-terminal end, showing 93 kDa of a chimeric GST:MBP:RFP fusion protein. In response to caspase-3, cleavage products, such as MBP:RFP (68 kDa), MBP (42 kDa), RFP (26 kDa), and GST (25 kDa), were separated from a large precursor GST:MBP:RFP (93 kDa) via SDS-PAGE. The results obtained from this study indicate that a multi-protein can be stoichiometrically produced from a large polyprotein by using proteolytic recognition motifs, such as DEVD and IETD tetra-peptides, for caspase-3.
선별이적처리를 통한 사용종료 비위생매립지 정비방안 연구
김동오(Kim Dongoh),김태경(Kim Taekyoung),김미화(Kim Mihwa),김문일(Kim Moonil) 한국지반환경공학회 2009 한국지반환경공학회논문집 Vol.10 No.1
본 연구의 목적은 사용종료 비위생매립지의 안정화 정도를 평가하고 안정화되지 않은 사용종료 매립지의 재정비 방안을 도출하는데 있다. 안정화 정도는 기존 사용종료 비위생매립지 21개소의 매립폐기물 시료를 채취하여 그 성상을 분석하여 평가하였다. 물리적 성상으로는 토사, 유기물, 가연성 및 불연성으로 분석하였다. 그 결과 매립폐기물 시료를 채취한 9개소의 비위생매립지는 사용종료 후 10년 이상 경과되었음에도 완전한 안정화가 이루어지지 않았으며, 사용종료 비위생매립지의 재정비가 시급함을 알 수 있었다. 비위생매립지의 물리적 성상중 토사 함량이 높았으며 가장 높은 함량은 89.96%이었다. 이와는 달리 위생매립지의 경우는 9.89~11.12%로 토사함량이 낮았다. 따라서 선별이적처리에 의해 회수된 토사는 재정비를 해야하는 비위생매립지의 복토재나 건설재료로의 재활용할 수 있을 것으로 평가되었다. The aim of this study was an evaluation of closed non-sanitary landfill's stabilization degree and a determination of its an optimal reclamation method. In order to evaluate the stabilization degree, physical compositions of landfill wastes in 21 closed non-sanitary landfills were analyzed. There were 4 major items such as cover soils, organics, combustibles and incombustibles. With respect to the results of physical compositions, it was determined that the waste in 9 sampling sites of closed non-sanitary landfills after 10years of the relief time was not fully stabilized. The closed non-sanitary landfills must be reclaimed as soon as possible. The main material in closed non-sanitary landfills was cover soils and the highest content was 89.96%. Otherwise, the contents in sanitary landfills was small and 9.89~11.12%. Therefore, it was evaluated that the recovered soil by sorting transfer treatment could be reused as on-site cover soils of the reclamating non-sanitary landfills and/or constructing materials.