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목화 GST 유전자 생성물에 의한 CDNB의 세포독성 제거 및 토마토 식물체의 보호
강원희,김종화,김일섭 한국원예학회 2002 원예과학기술지 Vol.20 No.3
Glutathione S-transferase (GST) cDNA from cotton plant was cloned and expressed in Escherichia coli. The expressed GST enzyme conjugated reduced glutathione with 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB), which had the cytotoxicity to prokaryotic and eukaryotic cells. Expressed GST had about two-fold glutathione peroxidase and about 40-fold GST specific activity. Cytotoxicity of CDNB was detoxicified by the products of cotton GST cDNA on tomato plants. This result can provide the possibility of cloning plant gene, expressing the functional product of plant gene in microbe, protecting horticultural plants from toxic chemicals by the gene products, and using this gene to improve the tolerance to herbicide by overexpressing in horticultural plants. 글루타치온 S-트랜스포레이제(GST) 유전자를 목화 섬유 cDNA 라이브러리에서 클로닝한 뒤 미생물인 대장균에서 발현시켰다. 발현된 GST 단백질은 약 40배 이상의 GST효소 반응을 나타냈고, 동시에 glutathione peroxidase(GPX)의 활성도 약 2배 이상 보였다. 발현된 GST 단백질(효소)는 미생물과 진핵 생물체에 세포독성이 있는 1-chloro-2,4-dinitrobenzene(CDNB)의 독성을 완전히 제거하였다. 대장균에서 발현된 목화의 GST 유전자 생성물은 기질인 CDNB를 글루타치온과 결합을 시켜 CDNB의 독성을 완전히 제거하여 토마토 식물체를 보호하였다. 이 실험 결과는 식물의 유전자가 미생물로 옮겨진 뒤 미생물 내에서 발현되고, 발현된 단백질은 기능을 갖는 효소로서의 역할을 한다는 것과 기능이 있는 효소는 토마토 식물체에 독성을 갖고 있는 CDNB의 특성을 글루타치온과 결합시켜 변형시킬 수 있었는데, 이는 앞으로 식물체 내에서 GST유전자의 발현을 적당히 조절하면 유용한 식물체를 얻는 데 기여할 수 있다고 판단된다.
목화 Glutathione S-Transferase (GST) 유전자로 형질 전환된 현삼의 내병성 특성
강원희,임정대,이성호,유창연 한국식물생명공학회 2001 식물생명공학회지 Vol.28 No.6
Scrophularia buergeriana Misrule has been contaminated with various pathogens in condition of field and storage period. This study was carried out for production of multiple stress resistance plant containing disease resistance that CGST gene expressed in transgenic Scrophularia buergeriana Misrule genome. Glutathione S-Transferases (GSTs) detoxify endobiotic and xenobiotic compounds by covalent linking of tripeptide glutathione to hydrophobic substrate. GST enzymes have been identified and characterized in insects, bacteria, and many plant species. A cDNA clone of GST was introduced into Scrophularia buergeriana Miquel by transformation with Agrobacterium tumefaciences. In coporation of the CGST gene into S. buergeriana Misrule was confirmed by PCR analysis of genomic DNA. Influence of exposure to darkness on the regeneration potential and transformation frequence were assessed. The activity of GST in transgenic plants was two times higher than that of non-transgenic plants. As a result of anti-microbe assays, the crude extract protein of transgenic plants showed the antimicrobial effects higher than control plants. 현삼의 기내배양에서 TDZ처리가 비교적 재분화에 효율적이었고 형질전환 식물체를 선발하기 위하여 선발표지 유전자로 사용되는 NPTII gene이 항생제 kanamycin에 대한 저항성은 50 mg/L가 적당하였다. 선발배지에서 자란 현삼 식물체에서 DNA를 추출하여 PCR 분석을 통하여 특정 유전자 Gh-5 gene을 검정한 결과 형질전환되지 않은 식물체에서는 볼수가 없는 988 bp의 band가 형질전환된 식물체에서는 관찰되어 GST 유전자가 현삼의 염색체 안으로 삽입되었음을 확인하였다. 형질전환 효율 증진을 위하여 선발과정에서 암상태를 30일까지 유지할 경우 높은 형질전환 효율을 나타내었으나 그 이상의 처리는 오히려 형질전환 효율이 감소하는 결과를 나타내었다 (Table 5). 형질전환 식물체에서 GST의 활성이 형질전환 되지 않은 식물체의 2배로 나타났고 유도체의 적정 처리 농도는 50$\mu$M이며 유도체 처리 시간에 따라서는 12시간까지는 점차적으로 높아지는 경향이었으나 그 이상의 시간에서는 활성이 저하됨이 확인되었다. Fungus 피검균인 Asperigillus awamori에서 6, 12시간 처리 시 비교적 높은 활성을 보여주었으며 그 이상의 시간처리에서는 명확한 균사 억제를 나타내지 못하였으며, 특히 12시간에서 상대적으로 높은 활성을 나타내었다. Cladosporium herbarum에서 형질전환된 식물체의 활성이 훨씬 높게 나타났으며 6시간 처리에서 다른 처리에 비하여 높은 활성을 나타내었다. 피검균인 Saccharomyces cerevisiae에서는 형질전환 식물체에서 높은 활성을 보여주었으며 6, 12시간 처리에서 비슷하게 높은 활성을 보여 주었다. 박테리아 피검균 Bacillus subtillis에서는 50$\mu$M 이하의 유도체 처리에서 비교적 높은 활성을 나타내었다.