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갯봄맞이(Glaux maritima L.)의 캘루스 배양을 통한 식물체 재분화
한증술,Han, Jeung-Sul 한국식물생명공학회 2017 식물생명공학회지 Vol.44 No.2
우리나라에서 멸종위기 해안식물로 지정된 갯봄맞이의 캘루스배양을 통한 재분화 프로토콜을 보고한다. 마디배양을 통해 육성한 기내 유식물체의 절편은 유전자형, 절편의 종류, 광조건 및 2,4-D 첨가농도에 따라 캘루스 형성에 상이한 반응을 보였다. 특히, 다른 처리와는 무관하게 연속 암배양이 절편으로부터 캘루스 유도에 결정적인 영향을 미쳤다. 2,4-D 0.1-3.0mg/L 농도 범위의 배지에서 유도된 캘루스를 동일한 조성의 배지로 이식하여 암배양했을 때왕성하게 캘루스가 증식하였다. 연속 암조건에서 zeatin 1.0mg/L 첨가배지에 'Pistachio' 유전자형의 캘루스를 배양했을 때만 유일하게 정상적인 신초가 재분화 되었고, 이 때 신초는 캘루스로부터 형성된 마디구조에서 발달하였으며 신초의 재분화율은 24.4%였다. 재분화 신초를 식물호르몬 무첨가 배지로 이식하여 명배양 했을 때 지상부 녹화와 더불어 뿌리가 발생하여 유식물체로 발달하였다. 기내 유식물체를 기 보고된 마디배양 프로토콜(Bae et al. 2016)에 따라 배양했을 때 효과적으로 유식물체를 증식시킬 수 있었다. 기외 순화시킨 유식물체는 내륙 자연 환경하에서 성숙식물체로 생육하였으며 이듬 해 4월에 개화하였다. 본 연구의 결과는 Bae et al. (2016)이 제안한 마디배양 프로토콜과 통합하여 운용될 수 있고, 통합된 프로토콜은 갯봄맞이의 기내 번식 시스템으로서 갯봄맞이 자생지 복원에 기여할 수 있을 것이다. A callus-mediated regeneration protocol for sea-milkwort, an endangered coastal plant species in South Korea, is reported here. The explants of in vitro-plantlets generated from a node culture revealed distinguishable responses in callus induction depending on genotype, explant source, light condition, and 2,4-D concentration. Especially, continuous darkness exclusively facilitated callus induction from explants prior to other treatments. The calli initiated on the media with 2,4-D ranging from 0.1 mg/L to 3.0 mg/L in the dark vigorously proliferated when subcultured on the same media in continuous darkness. Given 1.0 mg/L zeatin in addition to darkness to the calli of the 'Pistachio' genotype, normal adventitious shoots were only regenerated from nodular structures that formed earlier from the calli at the frequency of 24.4 percent. Regenerated shoots easily grew into plantlets with roots and green color on a phytohormone-free MS medium under lighted condition, that were used for node culture as plant materials. Node culture effectively multiplied plantlets in accordance with protocol by Bae et al. (2016). Acclimatized plantlet clusters developed mature plant clusters under inland environment, followed by flowering the following April. Results were merged with node culture protocol suggested by Bae et al. (2016), which, as an in vitro propagation system for sea-milkwort, may contribute to natural habitat restoration.
한증술(Jeung-Sul Han),김진화(Jin-Hwa Kim) 한국원예학회 2009 원예과학기술지 Vol.27 No.3
기내 파종한 고추(Capsicum annuum L.) 실생의 유아로부터 직접 체세포 배발생을 통한 식물체 재분화 체계를 개발하였다. 고추의 체세포 배발생을 유도하기 위해 다양한 배양조건과 고추 유전자형의 효과가 탐색되었다. 고추 성숙종자를 2,4-D, BA 및 고농도 sucrose가 첨가된 변형 MS 배지(MMSP)에 직접 파종하여 발아율, 캘루스 발생, 체세포 배발생을 조사하였다. 이로부터 선발한 ‘MC-12’과 ‘CCA323’의 실생은 식물생장조절제(PGR) 무첨가 MMSP로 이식하여 체세포 배발생률을 조사하였다. 고추 실생의 유아로부터 체세포 배발생은 특정 유전자형의 경우 첨가한 cytokinin에 영향을 받았는데, 파종용 배지에 BA를 1㎎ㆍL?¹를 초과하여 첨가하거나 발아 실생 이식용 배지에 zeatin을 첨가하면 그 빈도가 저하되었다. 또한 고농도 자당의 일부를 D-mannitol로 대체하는 것은 체세포 배발생에 영향을 미치지 않았다. ‘MC-12’ 내혼 계통의 종자를 2㎎ㆍL?¹ 2,4-D, 1㎎ㆍL?¹ BA 및 80gㆍL?¹ sucrose를 첨가한 MMSP에 파종하여 명배양한 후 30gㆍL?¹ sucrose가 공급된 PGR 무첨가 MMSP로 이식하였을 때 38.3%의 가장 높은 빈도로 실생의 유아로부터 체세포배가 유도되었다. 체세포배는 PGR 무첨가 MMSP로 이식함으로써 정상 유식물체로 생장하였다. 재분화된 식물체는 용이하게 온실에서 순화되었으며 성숙식물체로 생장하였다. 1개체의 체세포 변이체를 제외하고 대부분의 재분화 식물체는 모 식물체와 동일한 표현형을 나타내었고, 모든 체세포배 유래 식물체는 정상적으로 발육하여 착과하고 후대종자를 생산하였다. 본 연구의 결과는 고추의 형질전환체계와 통합되어 유용하게 활용될 것으로 생각된다. A regeneration protocol via direct somatic embryogenesis from the plumules of in vitro-sown seedlings was developed in hot pepper (Capsicum annuum L.). To induce somatic embryogenesis of hot pepper, the effects of various culture conditions and genotypes were evaluated. After mature seeds were directly sown on a modified Murashige and Skoog’s medium for pepper (MMSP) supplemented with 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 6-benzylaminopurine (BA), and high sucrose, the germination rate, formation of callus, and somatic embryogenesis were checked. The germinated seedlings of selected MC-12 and CCA323 among tested genotypes were transferred to plant growth regulator (PGR)-free MMSP, and then the frequency of somatic embryogenesis was investigated. The somatic embryogenesis from plumules of hot pepper seedlings was affected by cytokinins in particular genotypes: the frequency of somatic embryogeneis was decreased on the sowing media with more than 1 ㎎ㆍL?¹ BA and the transplanting medium with zeatin. Meanwhile, the partial substitution with D-mannitol for high sucrose did not influence the somatic embyrogeneis. Collectively, the highest rate (38.3%) of somatic embryo induction from plumule was obtained when the seeds of ‘MC-12’ inbred line were sown on the MMSP with 2 ㎎ㆍL?¹ 2,4-D, 1 ㎎ㆍL?¹ BA, and 80 gㆍL?¹ sucrose at 25℃ with illumination for 16 hours each day, and then transferred into the MMSP with no PGR and 30 gㆍL?¹ sucrose. Isolated somatic embryos germinated into normal plantlets after sub-culturing to PGR-free MMSP. The regenerants were easily acclimatized in a greenhouse and grew into mature plants. Most of the somatic embryo-derived plants were undistinguishable from the wild-type ones by their phenotypes except for only one somaclonal variant. In addition, all of the somatic embryo-derived mature plants normally set the fruits and generated the next progenies. We believe that the present results might be helpful for incorporating into a genetic engineering system in hot pepper.