TNFα and TNFR2 Immunohistochemistry During Ovarian Follicular Development and Atresia in the Rat

한승로(Seung Ro Han),손성경(Sung Kyong Son),양윤석(Yun Seok Yang),김원식(Won Sik Kim) 대한해부학회 2005 Anatomy & Cell Biology Vol.38 No.6

TNFα는 난소의 발생과 기능에 있어서 중요한 역할을 하는 사이토카인(cytokine)으로 알려져 있다. 그리고 TNFα 수용체의 확인은 TNFα의 역할을 입증하는데 기여하였다. TNFα는 TNF 수용체 1 (TNFR1) 또는 TNF 수용체 2 (TNFR2)와 결합함으로써 기능을 발휘하게 된다. TNFα가 TNFR2와 결합시에는 과립층세포의 증식을 초래하게 된다. 본 연구를 통해 흰쥐 난소에서, 건강한 난포에서는 과립층의 바깥층에서 TNFα와 TNFR2에 강한 반응이 관찰되었고 아울러 많은 증식세포를 관찰했으며 세포자멸사는 관찰되지 않았다. 반면 폐쇄난포에서는 TNFα와 TNFR2의 발현이 과립층에서 급격히 감소하였고 이곳에서 많은 세포자멸사를 볼 수 있었다. 이같은 결과로 볼 때 TNFα는 흰쥐 난소에서 난포폐쇄시 과립층세포의 생존요소로서 작용할 것으로 생각된다. Tumor necrosis factor alpha (TNFα) is an intraovarian cytokine that may play a role in ovarian development and function. Identification of ovarian TNFα receptors provides support for establishing a role of TNFα in ovarian development and function. TNFα exerts its effects by binding to either TNF receptor 1 or 2 (TNFR1 or TNFR2). When TNFα binds with TNFR2, expression of survival genes is up-regulated, resulting in proliferation of granulosa cells. In the present study, the authors identified the changes in localization of TNFα and the expression of TNFR2 in granulosa cells during follicular atresia in rat ovaries. In healthy follicles, intense signals for TNFα and TNFR2 were found in the outer surface of the granulosa layer, where many proliferating cells and no apoptotic cells were observed. In atretic follicles, decreased expression of TNFα and TNFR2 was observed in the granulosa layer, where many apoptotic cells were seen. These findings suggested that TNFα acts as a survival factor in granulosa cells during follicular atresia in rat ovaries.

방사선조사로 유도된 흰쥐태아의 선천성기형 분석

이원정(Won-Jeong Lee),한승로(Seung-Ro Han),정옥(Ok Jeong),김수일(Soo-Il Kim),조문준(Moon-June Cho),김원식(Won-Sik Kim) 대한체질인류학회 2001 해부·생물인류학 (Anat Biol Anthropol) Vol.14 No.2

방사선에 의해 유발되는 선천성 기형을 형태학적으로 관찰 분석하여 기형유발 기전의 일부를 밝히고자 흰쥐(Sprague-Dawley계)를 실험동물로 임신 10.7일에 2Gy의 방사선량을 l회 조사한 후 임신 17.5일에 희생시켜 선천성기형을 관찰 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다. l 임신 10.7일에 방사선을 조사한 바, 태아생존율은 대조군과 실험 군 사이에 유의한 차이가 없었으나, 태아 체중은 대조군에 비해 현저히 감소하였다. 2. 본 실험에서 나타난 선천성기형은 뒷발가락기형이 88예 (51.5%), 눈의 기형이 126예(73.7%), 꼬리기형이 79예(46.2%), 머리 출혈반점이 81예 (47.4%)였다. 3. 눈의 기형에는 눈결여증이 103예 (60.2%), 작은눈증 25예(14.6%), 선천성 수정체결여증 46예(26.9%)가 있었다. 4. 뒷다리의 기형에는 4발가락기형이 96예(56.1%), 3발가락기형이 27예(15.8%), 2발가락기형이 l예(0.6%) 나타났으며, 오른쪽이 79예로서 왼쪽 45예보다 현저하게 많았다. 또한 오른발가락-왼발가락 조합에서는 4-5발가락기형 40마리(23.4%), 3-4 발가락 기형이 17마리(9.9%), 2-3 발가락 기형은 1 마리(0.6%)로, 오른발가락이 1개적은 기형이 58마리였고 같거나 왼쪽이 많은 예는 30예로 나타났다.

돼지난소에서 난포폐쇄와 큰포식세포에 관한 형태학적 연구

김원식(Won-Sik Kim),한승로(Seung-Ro Han),김수일(Soo-Il Kim),박창식(Chang-Sik Park) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.1

난포폐쇄가 과립층세포의 세포자멸사에 의해 이루어지고 이 과정에 큰포식세포가 직, 간접적으로 관여한다는 사실은 널리 알려져 있다. 그러나 난포내에서 일어나는 세포자멸사가 과립층의 어디에서부터 개시되고 어떻게 파급되는지, 세포자멸사 산물과 퇴화된 난모세포의 제거 방법 그리고 난포폐쇄의 완성은 어떻게 이루어지는가에 대해서는 아직 확실히 밝혀져 있지 않다. 이에 저자들은 가임기 돼지(Yorkshire-breed)를 실험동물로 난소내 난포의 광학현미경적 및 투과전자현미경적 관찰과 돼지 대식세포 단크론항체 4E9를 이용한 면역조직화학적 방법으로 본 연구를 실시하였다. 광학현미경적 관찰 결과, 난포폐쇄는 과립층세포의 세포자멸사로부터 개시되고 이어 난모세포의 퇴화와 난포막 속층 세포들의 세포자멸사가 일어나면서 난포폐쇄가 완성되는 것으로 보인다. 과립층세포의 세포자멸사는 핵농축으로부터 시작되고 과립층의 깊이에 관계없이 짧은 시간안에 모든 층으로 파급되고 최종적으로 난모세포의 투명대를 둘러싸고 있는 과립층세포의 세포자멸사로 이어지는 것으로 보인다. 투과전자현미경 관찰에서는 세포자멸사중에 있는 과립층세포들이 인접한 정상적인 과립층세포들과 큰포식세포들에 의해 포식되는 것을 확인할 수 있었고, 난포동내에 산재한 세포자멸사 소체들의 제거에도 큰포식세포들이 관여하고 있음을 알 수 있었다. 난포폐쇄와 큰포식세포와의 관계를 알아보기 위해 실시한 면역조직화학적 관찰에서는, 과립층세포의 세포자멸사 초기에는 큰포식세포가 과립층내에서만 발견되었으나, 세포자멸사의 진행과 함께 난포동과 난모세포를 둘러싸고 있는 투명대 주위에서 각각 순서대로 관찰되었고, 마지막으로 난포막 속층에서도 발견되어, 이들이 과립층세포들의 세포자멸사 소체들을 제거하는 것은 물론 최종적으로는 난포막 속층 세포들의 세포자멸사 소체들을 제거하여 난소 실질화에 관여하는 것으로 보인다. 이러한 본 연구의 결과는 난포폐쇄와 관련된 큰포식세포의 구조, 기능적 연구에 유용한 자료로 생각된다. Apoptosis of granulosa cells leads follicular atresia and macrophages have an important role during the apoptotic process. However, the propagation of apoptosis within the follicle, the ways of elimination of apoptotic bodies and degenerated oocyte, and the completion of follicular atresia are still controversial and unidentified clearly. Using adult porcine (Yorkshire-breed) ovary, in this morphological study, transmission electron microscopic observation and immunohistochemical study with pig macrophage monoclonal antibody 4E9 were performed. In light microscopy, the follicular atresia initiated with apoptosis of granulosa cells, followed by degeneration of oocyte and apoptosis of theca interna cells. Apoptosis occured in random fashion among the granulosa cells and propagated multidirectionally, and finally to the granulosa cells surrounding zona pellucida of degenerating oocyte. Pyknosis of granulosa cells was the first sign of apoptosis. In immunohistochemistry, macrophages were found only in the granulosa layer at the stage of beginning of apoptosis. With progression of apoptosis, they were proliferated greatly in number enough to eliminate all the apoptotic bodies, and found within the follicular antrum. In advanced stage of atresia, macrophages surrounded the zona pellucida of degenerating oocyte, and found also in the theca interna. In transmission electron microscopy, phagocytic granulosa cells maintained characteristic gap junctions with neighboring granulosa cells and contained several apoptotic bodies and lipid droplets within their cytoplasm. Macrophages kept many apoptotic bodies, vacuoles and autophagosomes in their cytoplasm. Apoptotic granulosa cells were ingested by intact granulosa cells and macrophages initially, but lately, all the apoptotic granulosa cells and degenerated oocyte were eliminated by macrophages. Ovarian follicular atresia completed with phagocytosis of apoptotic theca interna cells by macrophages, and the remnants of the atretic follicle became ovarian stroma. It is well known that macrophages may play an important role during follicular atresia, such as elimination of apoptotic granulosa cells, theca interna cells and degenerated oocytes, but, the valid action mechanisms of macrophages on the initiation of granulosa cell apoptosis and on the completion of atresia through the secretion of paracrine factors and autocrine factors still unclear.

흰쥐 가슴샘에서 5-fluorouracil에 의한 종자중심의 신생과 단백질 변화

조근자(Keun-Ja Cho),한승로(Seung-Ro Han),김 선(Sun Kim),김수일(Soo-Il Kim),명평근(Pyung-Keun Myung),김무강(Moo-Kang Kim),김원식(Won-Sik Kim) 대한해부학회 2002 Anatomy & Cell Biology Vol.35 No.5

저자는 5-FU가 가슴샘에 미치는 영향을 형태학적 측면과 단백질 변화의 측면에서 연구하기 위하여, 흰쥐에게 5-FU 100 mg/kg을 투여한 후 3일, 6일 및 9일에 각각 희생시켜 광학 및 전자현미경 관찰, TUNEL면역반응 및 생화학적 연구를 실시하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 5-FU 투여 후 3일까지는 5-FU로 인하여 가슴샘의 겉질 두께가 감소하였고, 겉질의 가슴샘세포들이 현저하게 감소 하여 그 밀도가 속질과 비슷해졌다. 2. 5-FU 투여 후 6일부터는 회복기에 접어들면서 겉질 속에 종자중심이 신생되어 9일까지 계속 신생되고 커졌으며 종 자중심에서는 활발한 세포자멸사가 일어나고 있었다. 3. 전기영동과 Integrin Western Blot을 실시한 바, 5-FU 투여 후 6일부터 α1-integrin과 β1-integrin이 증가되었다. 이상의 결과로 볼 때, 5-FU는 처음에는 흰쥐 가슴샘 겉질에 있는 가슴샘세포에 직접 작용하여 세포자멸사를 일으켜 대량의 가슴샘세포들을 사멸시키는 것으로 보이며, 투여 후 시일이 경과하면 종자중심이 신생되고, 새롭게 형성된 종자중심에서는 대량의 B세포들이 생성되고 또한 B세포들이 활발한 세포자멸사 과정을 통해 선택적으로 제거되며, 동시에 겉질에서 T세포들이 정상밀도로 회복하는 과정에, α1-, β1-integrins가 결정적으로 작용하는 것으로 사료된다. Thymus is a lymphoid organ forming T-cells from hematogenous stem cells. There is no report on the germinal centers in the thymus except the Myasthenia gravis in human. In this study, new germinal centers were experimentally induced from 6 days after 5-FU treatment in the Sprague-Dawley rats. With germinal center formation, proteins of molecular weight 123 kDa on 6 days after 5-FU treatment, and 162 kDa and 205 kDa on 9 days after 5-FU treatment were increased in 5-FU treated group. These proteins revealed α1- and β1-integrins on integrin Western Blot. In this experiment, it was cosidered that α1-integrins and β1-integrins were the key proteins for proliferation of B cells within the newly formed thymic germinal centers and the massive apoptotic disposal of B-cells from the germinal centers, and the new formation of T cells within the cortex.

카드뮴에 의해 유발된 선천성 기형에 대한 연구

김은주(Eun-Ju Kim),김선(Sun Kim),양은진(Eun-Jin Yang),한승로(Seung-Ro Han),김수일(Soo-Il Kim),김원식(Won-Sik Kim) 대한체질인류학회 2000 해부·생물인류학 (Anat Biol Anthropol) Vol.13 No.2

간추림 카드뮴이 흰쥐 태아에 미치는 기형유발영향을 규명하기 위하여 임신 10.5 일에 카드용 5 mg/kg 롤 단회 복강내 투여하고 임신 17.5 일에 희생시켜 외부가형, 입천창 기형 및 골-연골대조염색을 통한 뼈대기형을 입체 현미경하에서 관찰하고 사지싹을 전기영동한 바 다음과 같은 결과를 얻었다. l 카도뮴을 투여한 문의 태아생존융은 65.7% 로 정상대조군의 94.1% 에 비해 현저히 낮았으며, 평균체중도 589±77.5 mg으로 정상대조군의 756±86.5mg 보다 현저히 적었다. 2 카드뮴을 투여한 군에서는 뇌수종, 출혈성 수포 및 입천장갈림증등의 머리목 기형과 뭇발가락증 및 발가락 부족증의 사지기형이 출현하였다. 3 카드뮴을 투여한 군에서는 성장지연으로 인해 1차골화중심이 모든 뼈대에서 나타나지 않았으며, 척추뼈고 리판 결함, 짧은 꼬리뼈, 갈비뼈 결함, 갈비뼈 분리, 덧갈비뼈, 갈비뼈 결손 등의 뼈대이상이 나타났다. 4 카드뭄을 투여한 군에서 갈비뼈기형을 오른쪽에서 많이 나타났고 사지기형은 왼쪽에서 많이 나다났다. 5 전기영동을 실시한 바 카드용을 투여한 군에서는 입신 12.5 일의 앞다리와 뒷다리에서 14.1kDa 단백질이 사라졌고, 임신 13.5 일의 앞다리에서는 14.1 kDa, 30.2 kD. 크기의 단백질이 감소하였고, 뒷다리에서는 14.1kDa 크기의 단백질이 사라지고 30.2 kDa 크기의 단백질이 감소하였다. 이상의 결과로 볼 때, 카드뮴은 독성 작용을 통해 태아의 자궁내사망을 일으키고, 태아의 성장을 억제 또는 지연시키며 뇌수종이나 출현성 수포형성 및 입천장갈림증등의 선천성 기형은 물론 특히 뼈대계통에 작용하여 척추뼈 , 갈비뼈 , 발말가락뼈 등에 선천선 기행을 일으키는 물질임을 확인하고 본 실험을 통해 그 최기기전의 일부를 알 수 있었으나, 좀 더 상세한 기형의 종류나 기전에 관해서는 이 물질을 투여량과 투여시기를 다양화하고 단백철의 종류흩 밝히는 보다 광범위한 실험을 실시해야 할 것으로 사료된다.

한국인에서 발견된 홀정맥엽

김원식(Won-Sik Kim),김무강(Moo-Kang Kim),김수일(Soo-Il Kim),한승로(Seung-Ro Han),저옥(Ok Jeong) 대한체질인류학회 2001 해부·생물인류학 (Anat Biol Anthropol) Vol.14 No.4

저자 등은 2000년 -2001년에 충남대학교 의과대학에서 해부실습중 발견된 홀정맥엽 3 예를 문헌고찰과 함께 보고한다. 모든 홀정맥엽들이 오른허파 위엽에 위치하였고, 홀정맥틈새는 허파꼭대기 앞-가쪽-뒤쪽으로 위치하였고, 그 깊이는1.2-3.5 cm 이었으며, 벽쪽가슴막과 내장쪽가슴막 모두들 끌고 들어가 홀정맥간막을 형성하고 있었다. 홀정맥은 홀정맥간막 바닥을 따라 홀청맥활을 형성하였고 제 2 갈비뼈 높이에서 위대정액 가쪽면으로 들어가 고 있었다. 홀정맥엽에 분포하는 기판지는 B‘a 와 B’b 였고, 혈관들은 이 기관지분지를 따라 분포하고 있었다. 본 예에서 홀정맥엽 이외에 모든 예에서 한쪽 또는 양쪽 복장근이 발견되 였고 한 예에서는 왼허파에서 빗틈 새가 본래 있어야 할 위치에서 위로 올라가 있고 온래의 빗틈새는 덧름새를 이루어 위엽 아래에 덧엽이 형성 되어 있었다.

5-FU로 백서 가슴샘에서 유도된 세포고사의 Comet Assay에 의한 분석

김수원,한승로,정옥,조근자,김선,김원식 충남대학교 의과대학 지역사회의학연구소 2001 충남의대잡지 Vol.28 No.1

Thymus is a lymphoid organ forming T-cells from hematogenous stem cells. Apoptosis of thymocytes in the cortex of thymus is so rapid that cannot find easily with routine histological techniques. In this experiment, Comet assay and SDS-PAGE were used to detect apoptotic changes and protein changes after 5-fluorouracil(5-FU) treatment in the thymus of the rat. The results were as follows. 1. The number of thymocytes in the cortex was markedly decreased, and many apoptotic cells with various size and shapes were found on DAT 5 in 5-FU treated group. 2. On DAT 5, new nodules with germinal centers began to appear in the peripheral cortex, and in the germinal center, there was many apoptotic bodies of various size and shapes. 3. In SDS-PAGE, a protein with molecular weight of 123kDa was increased on DAT 5 which was considered as integrins subfamily.

카드뮴에 의해 유발된 흰쥐 고환의 미세구조 및 단백질 변화

황일면,한승로,정옥,김수일,이영호,김원식 충남대학교 의과대학 지역사회의학연구소 2000 충남의대잡지 Vol.27 No.2

Although cadmium is a well known heavy metal which attacks testis and results male infertility, the mechanism of action in the testis is'nt still fully known. In the previous experiment, authors observed morphological changes in the testis, and found cadmium-induced death of all the spermatogenic cells and hemorrhagic necrosis within the seminiferous tubules, and apoptosis and death of interstitial cells and fibroblasts in the interstitial tissue of the testis. In this experiment, cadmium chloride (4 mg/kg of body weight) administered to the adult male rats(Sprague-Dawlcy) intraperitoneally and sacrificed 1 week after treatment. And electrophoresis, immunoprecipitation and Western blotting, and N-terminal analysis were performed to find the proteins changed after cadmium treatment in the testis. And the results were as follows; 1. Two proteins of molecular weight 42kDa and 21kDa disappeared after cadmium treatment. 2. The protein of 2lkDa was rat collagen type I alpha 2. According to the above results, it was considered that cadmium degraded the collagen fibers within the wall of small blood vessels in seminiferous tubules and interstitial tissues and disrupted vascular walls, which resulted hemorrhagic necrosis, death of all the spermatogenic cells, and the death of interstitial cells and fibroblastic cells.

위암환자에서 BrdU에 의하여 유도되는 Fragile sites의 발현

윤숙자,한승로,정옥,김수일,박경란,이영호,김원식 충남대학교 의과대학 지역사회의학연구소 2001 충남의대잡지 Vol.28 No.1

The expression frequency of BrdU-induced fragile sites was examined in stomach cancer patients to determine whether this parameter could be used as a marker of genetic susceptibility in at-risk individuals. G banding performed to detect fragile sites. No difference was found in expression frequency between the stomach cancer patients and a group of normal individuals(p=0.7). This indicates that the expression frequency of BrdU-induced fragile sites is not a suitable marker for assessing genetic susceptibility in stomach cancer patient.

방사선 조사에 의한 흰주 난포의 퇴축과 난포세포의 방사선 감수성

김수일,한승로,조근자,허대영,이영호,조문준,김무강,김원식 충남대학교 의과대학 의학연구소 2002 충남의대잡지 Vol.29 No.1

The aim of this study were to investigate radiation-induced atresia and radiation susceptibility in the rat ovary morphologically. Female rats (Sprague Dawley strain) of 4 weeks old were irradiated with dose of 4 Gy and 8 Gy, and sacrificed at hour 6, 12, and 24 after radiation. The H & E stain, the TUNEL method (ApopTag kit) and transmission electron microscopy (TEM) were used. In light microscopic observation, the number of atresia of ovarian follicles were increased significantly at 6h after irradiation (p<0.01). There was no significant difference between 4 Gy and 8 Gy irradiated groups. In TEM observation, granulosa cells in radio-sensitive follicles were characterized by several structural features including condensation of nuclear chromatin granules, nuclear fragmentation and apoptotic body formation. An apoptotic cell is observed to have been phagocytosed by a normal granulosa cell. Granulosa cells in radio-resistant follicles were characterized by several structural features including nuclear indentation, partial condensation of chromatin granules, mitochondrial swelling, dilatation of RER cisterns, accumulation of dense irregular masses, accumulation of lipid droplets, and increased lysosomal bodies. Number of gap junctions between granulosa cells were decreased, and intercellular space were widen than that of control animals. These findings were prominent at 6h after irradiation and were diminished at 12h and 24h after irradiation. With these results, it was concluded that radiation-induced follicular cell apoptosis and ovarian follicular atresia in rat ovary increased considerably at 6h after irradiation. Further studies are needed to reveal the more extensive differences between radiosensitive and radioresistant follicular granulosa cells.