벼 HMG-CoA 환원효소의 특성연구

하선화,김제현,백융기,김종범,김종국,황영수 ( Sun Hwa Ha,Jai Hyun Kim,Young Ki Paik,Jong Bum Kim,Jong Guk Kim,Young Soo Hwang ) 한국응용생명화학회 1998 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.41 No.1

3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGR) catalyzes the conversion of HMG-CoA to mevalonic acid, the first intermediate of isoprenoid biosynthetic pathway in plants. The enzyme was solubilized with 0.4% Brij (polyoxyethylene ether) W-1 from a microsomal fraction of etiolated rice seedlings (Oryza sativa L.) in which its maximal activity was observed on the fourth day after germination. HMGR was purified to near homogeneity by employing (NH₄)₂SO₄ fractionation plus chromatographic procedures including DEAE-Sephadex A-50 and HMG-CoA-hexane-agarose affinity column. The size of the purified enzyme was estimated to be 55 kDa when judged by SDS-PAGE analysis with silver staining method. The apparent K_m and V_(max) values for HMG-CoA were determined to be 180 μM and 107 pmol/min/㎎, and those for NADPH were 810 μM and 32.1 pmol/min/㎎, respectively.

화색 변경을 위한 카로티노이드 대사공학

하선화(Sun-Hwa Ha),정예솔(Ye Sol Jeong),임선형(Sun-Hyung Lim),김재광(Jae Kwang Kim),이동호(Dongho Lee),이종렬(Jong-Yeol Lee),김영미(Young-Mi Kim) 한국원예학회 2012 원예과학기술지 Vol.30 No.2

식물에서 화색은 종자를 퍼트리기 위해 꽃가루 매개충과 초식동물을 유인하는데 매우 중요한 도구이다. 사람에게 화색은 다채로운 시각적 다양성으로 큰 심미적 가치를 지님으로써 화훼산업의 발전은 새롭고 다양한 매력을 지닌 화색을 생산하는 방향으로 꾸준히 발전되어 왔다. 카로티노이드 성분은 화색 중에서 적색, 홍색, 황색을 나타내는 천연색소로서 이러한 카로티노이드 생합성 경로는 생명공학 기술을 이용하여 화색을 변화시키려는 대사공학의 주된 대상으로 여겨져 왔다. 본 총설에서는 카로티노이드 생합성 대사관련 유전자 발현 조절에 의한 색소 표현형의 변화를 소개하고자 하며, 최근 카로티노이드의 생합성을 넘어 절단과 축적 조절이 화색 변경을 위한 대표적인 기작으로 보고됨에 따라 다양한 화색만큼이나 다양한 조절 기작에 대한 현재까지의 지식을 총 동원하여 원하는 화색을 지닌 인공적인 꽃(engineered flower)을 생산하기 위한 전략을 종합해서 제시하고자 하였다. In plants, color is a powerful tool to attract insects and herbivores which act as pollinators and vehicles of seed dispersion. In particular, flower color has held key post for human with aesthetic value. Horticultural industry has developed methods to produce new and attractive color varieties in flowering plants. Carotenoids are one of the main pigments being responsible for red, orange, and yellow colors. Their biosynthetic pathway has been considered as a major target of metabolic engineering for color modification of flowers and fruits. Here, we review the diverse efforts to modify pigment phenotype by the control of carotenogenic gene expression and enzyme levels. Recent reports about regulating degradation and storage of carotenoids will be also summarized to help the creation of engineered flower with novel color phenotype which is not existed in nature.

플라보노이드 대사 조절을 통한 화색 변경

임선형(Sun-Hyung Lim),김재광(Jae Kwang Kim),김동헌(Dong Hern Kim),손성한(Seong-Han Sohn),이종렬(Jong-Yeol Lee),김영미(Young-Mi Kim),하선화(Sun-Hwa Ha) 한국원예학회 2011 원예과학기술지 Vol.29 No.6

화색은 화훼 육종의 주요한 목표형질이다. 최근 유전공학 기술의 발달로 기존의 전통육종에서는 볼 수 없었던 파란장미와 파란카네이션과 같은 새로운 화색 개발이 성공적으로 보고되었다. 플라보노이드 생합성에 관해 축적된 지식기반 연구 결과를 바탕으로 새롭고 독특한 형질의 화색을 도입하는 것이 가능하게 된 것이다. 이러한 화색변경은 플라보노이드 대사경로의 조절, 즉 내재유전자의 발현조절 및 새로운 플라보노이드 합성 또는 특정 플라보노이드 합성을 위한 외래유전자의 추가도입과 플라보노이드 대사 전체를 조절하는 전사인자의 도입을 통해서 이루어져 왔다. 그러나 보다 실증적으로 이러한 플라보노이드 대사를 조절하기 위해서는 작물별 내재 플라보노이드의 조절 기작에 대한 이해를 바탕으로 목표로 하는 플라보노이드 합성을 위해 보다 정교한 대사흐름의 조절이 요구된다. 본 총설에서는 화훼작물의 화색변경 성공 예들을 자세히 소개하고 그 요인 분석을 통해 향후 더 성공적인 화색변경의 전략을 수립하는데 도움이 되고자 한다. Flower color is one of the main target traits in the flower breeding. Recently, technological advances in genetic engineering have been successfully reported the flower colors, such as blue roses and blue carnations that are impossible to develop by traditional breeding. Accumulated knowledge-based approaches for flavonoid biosynthesis enabled to introduce novel and unique colors into flowers. These flower color modifications have been made through the regulation of flavonoid metabolic pathway - control of endogenous gene expression and introduction of foreign genes to produce novel and specific flavonoids - and the introduction of transcription factors that are known to regulate sets of genes being involving in the flavonoid biosynthetic pathway. More empirical regulation of the flavonoids metabolism requires the understanding for regulatory mechanism of intrinsic flavonoids depending on the flower crops and the very sophisticated control of flavonoid metabolic flow. In this review, we summarized successf ul examples of flower color modification. It might be useful to deduce the strategy for the creation of exquisite colors in flower plants.

고추에서 분리한 Cinnamate 4-Hydroxylase 유전자의 분자생물학적 특성

김계원,하선화,조강진,김은주,이민경,유재주,김종국,이신우,Kim Kye-Won,Ha Sun-Hwa,Cho Kang-Jin,Kim Eun-Ju,Lee Min-Kyung,Yu Jae-Ju,Kim Jong-Guk,Lee Shin-Woo 한국식물생명공학회 2005 식물생명공학회지 Vol.32 No.3

본 연구는 고추열매의 capsaicinoid 생합성 조절 기작을 연구하고자 general phenylpropanoid pathway의 2번째 단계에 작용하는 것으로 알려진 3종류의 c4h cDNA clone을 확보하여 염기서열을 분석한 결과, pc4h1와 pc4h2의 크기는 각각 1,775 bp와 1,655 bp으로 505개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 암호하는 full length의 ORF를 갖추고 있었으나 pc4h3는 5'-말단의 coding 영역 일부가 소실 되었다. 이들은 공히 모든 cytochrome P450 효소에서 진화학적으로 보존되어 있는 3종류의 conserved region 즉 domain 1(proline-rich region), domain 2 (threonine-containing binding pocket for the oxygen molecule), 그리고domain 3(heme binding region)을 포함하고 있었으며 evolutionary tree분석을 통하여 pc4h1와 pc4h2는 모두 Class I에 속하는 것으로 서로 간에는 95.8%의 유사성을 나타내어 거의 동일한 유전자인 것으로 조사되었다. 특히 Class II로 분류된 Citrus sinensis C4H1과 Phaseolus vulgaris C4H와는 단지 64.9에서 64.5%의 homology를 나타내었다. 또한 pc4h2는 상처를 주지 않은 조직에서는 비교적 적은 양의 mRNA 발현수준을 보였으나 상처를 가한 후 6시간의 열매에서는 400%, 뿌리에서는 200%까지 그 발현 양이 증가하였다. 이와 유사하게 pc4h1의 전사량도 상처에 의하여 유도는 되나 basal level이 pc4h2보다 높아서 발현증가 비율은 그다지 높지 않았다. 반면에 pc4h3 유전자는 상처를 주지 않은 모든 조직에서 거의 발현되지 않았으며 상처에 의하여서도 전혀 반응을 하지 않았다. Three different cDNAS for cinnamate 4-hydroxylase (C4H) which are involved in the second step of the general phenylpropanoid pathway were isolated and designated as pc4h1 (1,755 bp), pc4h2 (1,655 bp), and pc4h3 (1,316 bp), respectively. The nucleotide sequence analysis revealed that both pc4h1 and pc4h2 clones encode polypeptides of 505 amino acids frame but pc4h3 clone was truncated at the 5'-end of coding region. The alignment of the deduced amino acid sequences showed that PC4H1 and PC4H2 are highly homologous (95.8% identical) with each other and contain three conserved domains which are typical in cytochrome P450 monooxygenase: proline-rich region, threonine-containing binding pocket for the oxygen molecule, and heme binding region. In addition, result of the phylogenic tree analysis revealed that both pepper C4Hs belong to Class 1. pc4h2 transcription was strongly induced in wounded fruit (400%) and root (200%) relative to its very low basal level but not in leaf or stem tissue. In case of pc4h1, the basal level of transcription was higher than pc4h2 but induction by wounding was lower in fruit and root while leaf and stem tissues did not respond to wounding. The basal level of pc4h3 transcripts was not, if any, detectable and response to wounding was not observed.

연구 보문 : 옥수수 B-peru 유전자가 도입된 담배 형질전환체의 페닐프로파노이드 생합성 유전자의 발현분석

임선형 ( Sun Hyung Lim ),하선화 ( Sun Hwa Ha ),김재광 ( Jae Kwang Kim ),손성한 ( Seong Han Sohn ),김동헌 ( Dong Hern Kim ),김정선 ( Jung Sun Kim ),김영미 ( Young Mi Kim ),이종열 ( Jong Ryeol Lee ) 한국국제농업개발학회 2010 韓國國際農業開發學會誌 Vol.22 No.1

Flavonoid 생합성:생화학과 대사공학적 응용

박종석,박종범,김경환,하선화,한범수,김용환,Park, Jong-Sug,Kim, Jong-Bum,Kim, Kyung-Hwan,Ha, Sun-Hwa,Han, Bum-Soo,Kim, Yong-Hwan 한국식물생명공학회 2002 식물생명공학회지 Vol.29 No.4

주요 농작물에서 건강-방어용 flavonoids 생성, phytoalexin (isoflavonoid, flavanol, proanthocyanidin)의 생성 및 소절을 통한 식물의 저항력 증대, 색소 (flavonol, anthocyanin)의 합성에 의한 자외선 방어, nod 유전자 inducer (flavones, isoflavones)의 대량 발현에 의한 혹 형성 (nodulation) 효율증대 등은 대사공학 적으로 향상 가능한 부분들이다. 파란 꽃을 개화하는 품종이 카네이션, 국화, 장미 등 중요 장식용 화훼작물들에는 결핍되어 있는데,이는 F3'5'H 유전자가 없어서 파란색 delphinidin 색소를 생산할 수 없기 때문으로 추정된다. 따라서 F3'5'H 유전자를 형질전환 하여 이러한 제한을 극복하고 delphinidin 유도체 생산이 가능하게 되면 파란색 꽃의 생산 가능성을 증대시킬 수 있게 된다. 또한 영양학적인 측면에서 이미 중요한 생리적 기능이 밝혀진 catechin을 비롯한 proanthocyanidin 과 anthocyanin은 의약품 및 식품첨가제 등 다양한 분야에서 크게 시장성을 넓히고 있어 상업적 측면에서 대사공학의 유망한 목표가 되고 있다. 최근의 대사공학 분야에서의 많은 성공에도 불구하고, flavonoid에 대한 고도의 대사공학 조절을 이용하여 원하는 flavonoid 화합물을 생성하거나, 원치 않는 flavonoid 화합물을 억제하도록 하는 데는 여전히 기술적 문제점들이 남아있다. 예를 들면 IFS와 FLS 등의 유전자 분리 그리고 조직 및 시기 특이적인 promoter 개발 등이 동시에 이루어져야 하며, co-pigmentation 및 액포 pH와 관련된 메카니즘에 대한 이해, 화훼작물들의 형질전환 기술 개발 등이 이루어져야 원하는 꽃의 착색 조절이 가능하게 될 것이다. 최근 나팔꽃에서 액포의 $Na^{+}$H$^{+}$ exchanger를 파괴하여 화색을 변경시킨 mutants 연구를 통하여 조만간 액포 pH의 조절을 이용한 식물 대사공학이 가능할 것으로 기대되고 있다 (Yamaguchi et al. 2001). 아직 자연계에서 기본적인 골격의 변경만으로 수천 종류의 flavonoid가 생성 가능한가는 여전히 의문점으로 남아 있으나, 분명한 것은 다양한 식물 체계에서의 노력으로 농업, 원예, 그리고 영양분 증대를 위한 flavonoid 대사를 어떻게 조절할 것인가에 대한 정보를 얻을 수 있고, 또한 flavonoid 생합성 연구로부터 얻어진 정보들을 통하여 세포질 대사와 기본적인 생물학적 현상에 대한 이해를 넓힐 수 있게 될 것이다. Flavonoid biosynthesis is one of the most extensively studied areas in the secondary metabolism. Due to the study of flavonoid metabolism in diverse plant system, the pathways become the best characterized secondary metabolites and can be excellent targets for metabolic engineering. These flavonoid-derived secondary metabolites have been considerably divergent functional roles: floral pigment, anticancer, antiviral, antitoxin, and hepatoprotective. Three species have been significant for elucidating the flavonoid metabolism and isolating the genes controlling the flavonoid genes: maize (Zea mays), snapdragon (Antirrhinum majus) and petunia (Prtunia hybrida). Recently, many genes involved in biosynthesis of flavonoid have been isolated and characterized using mutation and recombinant DNA technologies including transposon tagging and T-DNA tagging which are novel approaches for the discovery of uncharacterized genes. Metabolic engineering of flavonoid biosynthesis was approached by sense or antisense manipulation of the genes related with flavonoid pathway, or by modified expression of regulatory genes. So, the use of a variety of experimental tools and metabolic engineering facilitated the characterization of the flavonoid metabolism. Here we review recent progresses in flavonoid metabolism: confirmation of genes, metabolic engineering, and applications in the industrial use.

바이러스 질병 예방을 위한 식물 경구 백신 연구 동향

한범수,박종석,김형국,하선화,조강진,김용환,김종범,Hahn, Bum-Soo,Park, Jong-Sug,Kim, Hyeong-Kuk,Ha, Sun-Hwa,Cho, Kang-Jin,Kim, Yong-Hwan,Kim, Jong-Bum 한국식물생명공학회 2004 식물생명공학회지 Vol.31 No.2

Transgenic plants have been studied as delivery system for edible vaccine against various diseases. Edible plant vaccines have several potential advantages as follows: an inexpensive source of antigen, easy administration, reduced need for medical personnel, economical to mass produce and easy transport, heat-stable vaccine without refrigerator, generation of systemic and mucosal immunity and safe antigen without fetal animal-virus contaminants. The amount of recombinant antigens in transgenic plants ranged from 0.002 to 0.8% in total soluble protein, depending on promoters for the expression of interested genes and plants to be used for transformation. Throughout the last decade, edible plant vaccine made notable progresses that protect from challenges against virus or bacteria. However edible plant vaccines have still problems that could be solved. First, the strong promoter or inducible promoter or strategy of protein targeting could be solved to improve the low expression of antigens in transgenic plants. Second, the transformation technique of target plant should be developed to be able to eat uncooked. Third, marker-free vector could be constructed to be more safety. In this review we describe advances of edible plant vaccines, focusing on the yields depending on plants/promoters employed and the results of animal/clinical trials, and consider further research for the development of a new plant-derived vaccine.

국내산 당근 품종별 carotenoid 함량 분석

하정림 ( Jeong Lim Ha ),배종섭 ( Jong Sup Bae ),박문기 ( Moon Ki Park ),김용웅 ( Yong Ung Kim ),하선화 ( Sun Hwa Ha ),배정명 ( Jung Myung Bae ),백경환 ( Kyong Whan Back ),이철호 ( Cheol Ho Lee ),이신우 ( Shin Woo Lee ),안미정 ( Mi 한국환경과학회 2009 한국환경과학회지 Vol.18 No.10

Carrots (Daucus carota L.) are consumed as an important dietary source of provitamin A including β-carotene, α-carotene and lutein. An HPLC method was applied to determine the content of the carotenoid composition in carrot cutivars cultivated in Korea. HPLC analyses were carried out with five carrot cultivars (Socheon-5-chon, Hongsim-5-chon, Myeongju-5-chon, Seonhongbom-5-chon and Betarich) sown at April, 2007 and six cultivars (Yeoreum-5-chon, Hanyeoreum-5-chon, Sinheukjeon-5-chon, Bibariheukjeon, Manina and Betarich) sown at August of the same year. In general, the former varieties are not used for the sowing at summer because of their bolting (growth of floral axis). The former and the latter carrots were harvested after 110 and 96 days from seeding, respectively, and the carotenoids were extracted with acetone after freeze-drying. The amount of α-carotene (117.7∼205.3 μg/g·DW) was similar to that of β-carotene (113.1~189.6 μg/g·DW) for the carrot cultivars sown at spring, while the content (46.2~71.1 μg/g·DW) was about a half of β-carotene content (92.5~140.2 μg/g·DW) for the latter cultivars. In addition, the average content of lutein (25.2 μg/g·DW) in the former cultivars was eight times higher than that in the latter cultivars (3.1 μg/g·DW). Among the spring cultivation types, Socheon-5-chon and Myeongju-5-chon showed higher amount of α-carotene and β-carotene, while the higher amount was determined in Yeoreum-5-chon and Sinheukjeon-5-chon among the autumn cultivation types. Validation of the HPLC-DAD method showed good linearity (r2>0.997) of the three compounds analyzed in a wide concentration range (0.025~20 g/ml). The R.S.D. values for intra-day and inter-day precision were less than 19.2% and the mean recovery of each compound was 85.4~104.7%.

유전자변형 베타-카로틴 강화 쌀의 주요 영양성분 분석

이영택(Young-Tack Lee),김재광(Jae-Kwang Kim),하선화(Sun-Hwa Ha),조현석(Hyun-Seok Cho),서석철(Seok-Chul Suh) 한국식품영양과학회 2010 한국식품영양과학회지 Vol.39 No.1

본 연구는 국내에서 개발된 베타-카로틴 강화 유전자변형 벼(GM 벼)와 그 모종 벼인 낙동벼(non-GM 벼)로부터 쌀(현미, 백미)의 일반성분, 베타-카로틴, 지방산, 아미노산, 무기질 함량을 분석하여 유전자변형 쌀에서 주요 영양성분 조성에 차이가 있는지를 비교하기 위해 수행되었다. GM 쌀은 non-GM 모종 쌀과 일반성분 함량이 유사하였고 GM 쌀100 g당 약 0.2 ㎎의 베타-카로틴을 함유하는 것으로 분석되었다. GM 쌀의 지방산 조성은 oleic acid, linoleic acid, palmitic acid가 지방산 전체의 94% 이상으로 거의 대부분을 차지하고 있었으며 non-GM 쌀과 전체적인 지방산 조성이 유사한 것으로 나타났다. GM 쌀의 아미노산은 Asp>Arg>Leu>Ala>Ser>Val 순으로 그 함량이 높았고 무기질 함량은 P>K>Mg>Na>Ca>Zn>Fe의 순이었으며, non-GM 쌀에 비해 대부분의 아미노산과 무기질 함량이 약간 높은 수치로 측정되었지만 유의적인 차이는 없는 것으로 평가되었다. 베타-카로틴 강화 유전자변형 쌀은 의도한 바의 베타-카로틴이 쌀의 종실에 생합성 됨과 함께 쌀의 일반성분, 지방산, 아미노산 및 무기질 함량에는 별 다른 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. This study was conducted to analyze nutrient composition of a genetically modified β-carotene biofortified rice (GM rice), developed by the Rural Development Admistration in Korea. The nutritional constituents of GM rice were compared with those of the parental rice cultivar 'Nakdong' as a non-GM control to access nutritional equivalence. Proximate components (moisture, starch, protein, lipid, and ash) of the GM rice were similar to those of the conventional non-GM rice. β-Carotene contents of GM brown and milled rice were 2.35, 2.03 ㎍/g (d.b.), respectively. There were no significant differences between the GM and non-GM rice with respect to most of their nutrient composition, despite minor differences in most amino acids and minerals. This result demonstrated that the nutritional composition of this GM rice would be equivalent to that of the parental non-GM rice without major changes in its chemical contents.

Analysis of lipophilic and hydrophilic compounds in Lycium chinense fruits

Soo-Yun Park(박수윤),Si Myung Lee(이시명),Hyo Jin Kim(김효진),Sun-Hyung Lim(임선형),Yunsoo Yeo(여윤수),Hyun Suk Cho(조현석),Sun-Hwa Ha(하선화),Sang Un Park(박상언),Jae Kwang Kim(김재광) 한국약용작물학회 2013 한국약용작물학회 학술대회논문집 Vol.2013 No.1