N4SSB 단백질의 C-말단기의 7개의 아미노산이 N4SSB 단백질의 in vivo 활성에 미치는 영향

최미영,Choi, Mieyoung 한국미생물학회 1998 미생물학회지 Vol.34 No.4

Bacteriophage N4, a lytic phage specific for Esherichia coli K12 strain encodes single-stranded DNA-binding protein, N4SSB (bacteriophage N4-coded single-stranded DNA-binding protein). N4SSB protein is originally identified as a protein required for N4 DNA replication. N4SSB protein is also required for N4 late transcription, which is catalyzed by E. coli ${\sigma}^{70}$ RNA polymerase. N4 late transcription does not occur until N4SSB protein is synthesized. Recently it is reported that N4SSB protein is essential for N4 DNA recombination. Therefore N 4SSB protein is a multifunctional protein required for N4 DNA replication, late transcription, and N4 DNA recombination. In this study, a variety of mutant N4SSB proteins containing internal deletions or substitutions were constructed to define and characterize domains important for N4 DNA replication, late transcription, and N4 DNA recombination. Test for the ill vivo activity of these mutant N4SSBs for N4 DNA replication, late transcription, and N4 DNA recombination was examined. The results suggest that C-terminal 7 amino acid residues are important for the activity of N4SSB. Three lysine residues, which are contained in this region play important roles on N4SSB activity. Esherichia coli(E. coli) K12 균주를 숙주세포로 삼는 박테리오파아지인 N4는 single-stranded DNA에 결합하는 단백질인 N4SSB(bacteriophage N4-coded single-stranded DNA-binding protein) 단백질을 만든다. N4SSB 단백질은 N4 DNA replication 뿐만 아니라 late transcription과 N4 DNA recombination에도 필요한 여러 가지 기능을 가진 단백질이다. N4 late transcription은 숙주세포인 E. coli의 $E{\sigma}^{70}$ RNA polymerase에 의해서 수행이 되나 N4SSB 단백질을 반드시 필요로 하기 때문에 N4SSB 단백질이 생성될 때까지는 N4 late promoter로부터 RNA 합성이 일어나지 않는다. 본 연구에서는 N4SSB의 N4 DNA replication과 late transcription, 그리고 N4 DNA recombination에 필요한 영역(domain)을 알아내기 위해서 여러 가지 돌연변이형 N4SSB 단백질을 만들어 N4 DNA replication과 late transcription, 그리고 N4 DNA recombination의 3가지 작용에 대한 in vivo 활성을 조사 분석하였다. 그 결과 N4SSB 단백질의 C-말단기에 있는 7개의 아미노산이 N4SSB 단백질의 활성에 중요하다는 것을 알 수 있었다. 특히 C-말단기의 7개의 아미노산에는 세 개의 lysine이 포함되어 있는데 이 lysine이 N4SSB 단백질의 활성에 중요한 역할을 한다는 것이 제시되었다.

Identification of the Interaction between Insulin-like Growth Factor Binding Protein-4 (IGFBP-4) and Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein L (hnRNP L)

Mieyoung Choi(최미영) 한국생명과학회 2013 생명과학회지 Vol.23 No.11

hnRNP L은 pre-mRNA에 결합하는 단백질들 중에서 핵심이 되는 단백질이다. hnRNP L은 양이 아주 많은 핵 단백질로서 핵과 세포질을 왕복하는 특성을 지니고 있다. 이 단백질은 염색질 변형(chromatin modification), pre-mRNA 스플라이싱, 인트론이 없는 유전자들에서 유래한 mRNA들의 세포질로의 반출(export), IRES-매개성 번역, mRNA의 안정성 조절, 정자형성과정 등, 세포 내의 여러 가지 과정에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 이 논문에서는 hnRNP L과 결합하는 세포 내 단백질을 찾아내기 위하여 사람의 간세포 cDNA library를 사용하여 이스트 two-hybrid 탐색 실험을 수행하였다. 그 결과 사람의 간세포에서 IGFBP-4가 hnRNP L과 상호결합하는 새로운 파트너라는 것을 발견하였다. 본 연구를 통하여 hnRNP L이 이스트 two-hybrid 시스템에서 IGFBP-4와 특이적으로 상호 결합한다는 것을 처음으로 발견하였다. 본 연구에서는 또한 이스트 two-hybrid 시스템에서 hnRNP L이 IGFBP-4와 상호결합한다는 점을 in vitro pull-down 실험을 통하여 재확인하였다. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L (hnRNP L) is a major pre-mRNA binding protein and it is an abundant nuclear protein that shuttles between the nucleus and the cytoplasm. hnRNP L is known to be related to many cellular processes, including chromatin modification, pre-mRNA splicing, mRNA export of intronless genes, internal ribosomal entry site (IRES)-mediated translation, mRNA stability, and spermatogenesis. In order to identify the cellular proteins interacting with hnRNP L, this study performed a yeast two-hybrid screening, using a human liver cDNA library. The study identified insulin-like growth factor binding protein-4 (IGFBP-4) as a novel interaction partner of hnRNP L in the human liver. It then discovered, for the first time, that hnRNP L interacts specifically with IGFBP-4 in a yeast two-hybrid system. The authenticity of this two-hybrid interaction of hnRNP L and IGFBP-4 was confirmed by an in vitro pull-down assay.

인간 hnRNP A1 단백질에 포함된 RGG 상자의 기능 분석

최미영(Mieyoung Choi) 한국산학기술학회 2017 한국산학기술학회논문지 Vol.18 No.12

본 연구는 hnRNP A1 단백질에 포함되어 있는 RGG 상자가 이 단백질의 세포내 위치에 미치는 영향 및 이 단백질의 안정화에 미치는 영향을 분석하는 것을 목적으로 하며 2014년 10월부터 약 3년 동안 수행되었다. 이를 위해 먼저, RGG상자 내의 6개의 아르기닌을 라이신으로 돌연변이를 만든 다음 pcDNA1-HA-hnRNP A1(6R/K)를 재조합하였다. 다음, 이 플라스미드 DNA를 HeLa 세포에 형질주입하여 HA-hnRNP A1(6R/K) 단백질의 세포내 위치에 미치는 영향을 면역형광현미경법으로 분석하였다. 그 결과 hnRNP A1(6R/K) 단백질은 (wt 단백질처럼 핵에 위치하지 못하고) 핵과 세포질 모두에 퍼져 있는 것을 확인하였다. hnRNP A1(6R/K)의 안정성을 조사하기 위해서는 pcDNA1-HA-hnRNP A1(6R/K)를 HeLa 세포에 형질주입시킨 다음 발현된 단백질을 웨스턴 블랏 실험으로 분석하였는데, 그 결과 HA-hnRNP A1(6R/K)는 (잘려서) 크기가 작아 진 것을 확인할 수 있었다. 이 결과들로부터 HA-hnRNP A1(6R/K)가 핵과 세포질 모두에 퍼져 있는 것은 6R/K 돌연변이가 hnRNP A1의 핵 위치 능력에 영향을 미쳤기 때문이 아니라 6R/K 돌연변이가 일어난 부위 또는 그 부근이 절단되어 hnRNP A1의 핵 위치 신호(nuclear localization singal)인 M9 도메인이 들어있는 C-말단 부위를 잃었기 때문이라는 점을 확인 할 수 있었다. 본 연구의 결과들은 hnRNP A1에 있는 RGG 상자의 아르기닌이 hnRNP A1의 안정성에 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다. 세균에서 발현시켜서 정제된 hnRNP A1(6R/K)의 RNA-결합 능력에 대한 영향 분석은 추후 과제로 남겨둔다. This study analyzed the effects of RGG box of hnRNP A1 on its subcellular localization and stabilization of hnRNP A1 over a three year period from October 2014. First, a 6R/K mutation in RGG box was generated, and pcDNA1-HA-hnRNP A1(6R/K) was constructed. The subcellular localization of hnRNP A1(6R/K) from the HeLa cells transfected with this plasmid DNA was analyzed by immunofluorescence microscopy. HA-hnRNP A1(6R/K) was found to exhibit nuclear and cytoplasmic fluorescence. The stability of hnRNP A1(6R/K) was checked by Western blot analysis using the expressed protein from the HeLa cells transfected with the pcDNA1 HA-hnRNP A1(6R/K). The results show that HA-hnRNP A1(6R/K) has a smaller size. These confirm that HA-hnRNP A1(6R/K) is localized both in the nuclear and cytoplasm, not because 6R/K mutation affects the nuclear localization of hnRNP A1, but because 6R/K mutation causes hnRNP A1(6R/K) to cleave at the mutation or near the mutation site. The cleaved protein fragment, which lacks the M9 domain (i.e. nuclear localization signal of hnRNP A1), did not exhibit nuclear fluorescence. This suggests that the arginines of RGG box in hnRNP A1 play an important role in stabilizing hnRNP A1. An analysis of the RNA-binding ability of hnRNP A1(6R/K) expressed and purified from bacteria will be a subsequent research project.

보툴리눔 신경독소 A를 중화하는 재조합 항체의 제조와 특성 분석

박홍규(Hong-Gyu Park),최미영(Mieyoung Choi) 한국산학기술학회 2017 한국산학기술학회논문지 Vol.18 No.1

보툴리눔 신경독소는 콜린성 신경말단(부)을 선택적으로 공격하여 신경마비를 일으키는 신경독소로서, 그람양성을 띠고 내성포자를 형성하는 절대혐기성 세균인 보툴리눔 균(Clostridium botulinum)이 만들어낸다. 이 중 보툴리눔 A형 독소(BoNT/A)는 음식물과 물을 오염시킬 수 있으며 생물 무기나 생물 협박물질로 사용될 수도 있다. 이 때문에 독성을 탐지할 수 있는 예민한 분석방법과 중독을 치료할 수 있는 효능 있는 항독소를 개발해낼 필요성이 제기되어 왔다. 본 연구에서는 BoNT/A를 중화할 수 있는 단일클론 항체(mAb)를 생산하기 위하여 BoNT/A로 면역된 토끼의 항혈청에서 유래한 scFv 라이브러리를 인간 IgG와 융합시켰다. 그렇게 재조합된 scFvIgG 항체 단백질을 안정된 세포주에서 발현시켰고 항체 친화 크로마토그래피를 사용하여 scFvIgG mAb 단백질을 정제하였다. ELISA로 정제된 scFvIgG mAb 단백질의 효율성을 확인하였고, in vivo 실험으로 BoNT/A에 대한 중화능을 시험하였다. 독성 중화능 실험은 마우스를 사용하여 수행하였는데, 그 결과 scFvIgG 항체(10 ug)는 BoNT/A(100,000 LD50)의 독성이 주입된 마우스를 완전히 방어하지는 못하지만 마우스의 생존 기간을 현격하게 연장시키는 것이 확인되었다. 이러한 결과들은 이 scFvIgG mAb가 BoNT/A를 중화하는 효능을 가지고 있다는 점을 제시한다. Botulinum neurotoxin (BoNT/A) is a neurotoxin that selectively attacks the peripheral cholinergic nerve endings. It is produced by Gram -positive, endospore-forming strict anaerobic bacteria, Clostridium botulinum. Since BoNT/A could be a biothreat agent, as well as a contaminator of food and water supplies, the development of sensitive assays for toxin detection and potent antitoxin for the treatment of intoxication is necessary. In this study, for the purpose of producing monoclonal antibodies (mAbs) that are capable of neutralizing Botulinum neurotoxin type A (BoNT/A), scFv (single-chain variable domain fragment) libraries from the rabbit antisera against BoNT/A was fused to a human IgG. The resulting recombinant scFvIgG antibody protein was expressed in stable cell lines and was purified using a protein A affinity chromatography. The efficacy of scFvIgG mAb was confirmed by ELISA and was evaluated for the neutralization of BoNT/A in vivo. Such an in vivo toxin neutralization assay was performed using mice. Although scFvIgG antibody proteins (10 ug) failed to fully protect the mice challenged with BoNT/A (100,000 LD50), it significantly prolonged the survival time. These results suggest that scFvIgG mAb may be capable of neutralizing BoNT/A single-chain variable domain fragment.

RNA에 결합하는 능력을 상실한 mutant hnRNP K단백질이 핵과 세포질을 왕복하는 활성에 미치는 영향

최미영 선문대학교 자연과학대학 2001 자연과학논총 Vol.4 No.-

Rotating flow of a stratified fluid contained in a circular cylinder with unstable temperature gradient imposed on the side wall of it has been numerically studied. The temperatures at the endwall disks are constant. The top disk of the container is colder than that of the bottom disk, as much as the temperature difference nΔT, (0≤n≤3). Flows in the vessel are driven by an impulsive rotation of the hot bottom disk with respect to the central axis of the cylinder. Flow details have been acquired. For this flow, the principal balance in the interior core is characterized by a relationship between the radial temperature gradient and the vertical shear in the azimuthal velocity. As the buoyancy effect becomes appreciable, larger portions of the meridional fluid transport are longcircuit from the bottom disk to the interior region via the side wall.

축산분뇨에서 분리한 세균의 동정 및 효소학적 특성

김진선,정소선,이준석,최미영,서승염,이현환 공주대학교 자원재활용 신소재 연구센터 2002 센터사업 성과집 Vol.- No.1

축산 분뇨의 퇴비화에 관련되는 세균들을 분리하고 이들이 생산하는 효소들 중 퇴비화에 관련되는 것으로 사료되는 amylase, cellulase, protease 및 lipase의 특성을 연구하였다. 발효 중에 있는 축산 분뇨로부터 24주의 균주를 분리하여 이중 protease, cellulase, amylase, 그리고 lipase의 활성을 모두 가진 6개의 균주들을 선별하였다. 분리한 6개의 균주들을 동정해본 결과 Corynebacterium varibilis, Bacillus spp., Pseudomonas spinosa, Acetobacter calcoaceticus 및 Athrobacter cumminsii 등으로 밝혀졌다. 이들이 분비하는 효소들의 특징은 중성에서 알칼리성에 이르는 광범위한 pH에서 효소들이 높은 활성을 보였으며, cellulase를 제외한 대부분의 효소들의 최대 활성 온도가 60℃ 정도였으나 cellulase의 경우 37℃가 최적 활성 온도였다. 이는 발효가 진행되어 축산 분뇨에 고온의 열이 발생할 때, 이 환경 하에서 유기물을 분해함으로써 발효과정을 원활히 진행시키는 것으로 생각된다. 다만 cellulase 생산 세균의 경우 축산 분뇨의 초기 발효시에 관여하여 균주의 성장 및 유기물의 분해에 관여하는 것으로 사료된다. 이와같은 결과는 축산분뇨 발효 초기와 발효후기의 온도가 상승된 환경에서 작용하는 세균의 균총이 다름을 암시하고 있다. To develop the effective composting system, we isolated bacteria that have the abilities to degrade organic matters such as cellulose, carbohydrate, protein and lipid during the compositing of livestock manure. Among 24 strains, 6 bacteria have all the enzymatic activities of protease, amylase, cellulase and lipase. These microorganisms were identified as Corynebacterium varibilis, Bacillus spp., Pseudomonas spinosa, Acetobacter calcoaceticus and Athrobacter cumminsii. All the enzymes produced by the bacteria showed activities at the broad pH range and the maximal activities were obtained at 60℃. It seemed that after the increase of temperature caused by fermentation of livestock manure, the enzymes started to degrade the raw materials, which are added for the control of humidity. However cellulase activity was maximum at 37℃, suggesting that the cellulase-producing bacteria work at an early stage of livestock manure fermentation to provide the organic material for the growth of other bacteria. The production of the enzymes were growth-associated and maximal activities appeared at the early stationary phase of growth.