Isolation and Characterization of Pyrimidine Auxotrophs from the Hyperthermophilic Archaeon Sulfolobus acidocaldarius DSM 639

최경화(Kyoung-Hwa Choi),차재호(Jaeho Cha) 한국생명과학회 2011 생명과학회지 Vol.21 No.10

고세균 Sulfolobus acidocaldarius의 기능유전체학 연구를 위하여 피리미딘 생합성 유전자군의 pyrEF 유전자에 근거한 피리미딘 영양요구주를 구축하였다. 원균주는 정상적인 pyrEF 존재하에서 5-fluoroorotic acid를 첨가하면 성장이 불가능하나 피리미딘 영양요구주는 성장이 가능한 원리를 활용하였다. 자외선을 이용하여 얻어진 5-FOA 첨가에 저항성을 갖는 돌연변이주를 얻었으며, 두 돌연변이주 KH1U와 KH2U는 각각 pyrE 유전자 부분의 점돌연변이와 삽입돌연변이를 갖는 돌연변이주임을 알 수 있었다. 이 두 돌연변이 균주는 5-FOA의 첨가에 의하여 이 세포를 사멸시킬 수 있는 능력이 사라짐을 확인하였다. 정상적인 pyrEF 유전자를 갖는 Sulfolobus-E. coli 플라스미드를 이용하여 보완실험을 수행한 결과 KH2U 돌연변이주는 다시 5-FOA에 대한 저항성을 잃어버렸으며, 배지 내에 피리미딘의 첨가가 없어도 생존할 수 있는 능력을 보여주는 원균주와 같은 표현형으로 회귀함을 확인하였다. 이 연구는 차후 고세균 Sulfolobus acidocaldarius의 유전자 불활성화를 통한 유전학연구에 효율적인 도구로 사용되기에 유용한 연구로 생각된다. To study the functional genomic analysis of a crenachaeon Sulfolobus acidocaldarius, we have constructed an auxotrophic mutant based on pyrEF, which encodes the pyrimidine biosynthetic enzymes orotate phosphoribosyltransferase and orotidine-5’-monophosphate decarboxylase. S. acidocaldarius was shown to be sensitive to 5-fluoroorotic acid (5-FOA), which can be selected for mutations in pyrEF genes within a pyrimidine biosynthesis cluster. Spontaneous 5-FOA-resistant mutants by ultraviolet, KH1U and KH2U, were found to contain two point mutations and a frame shift mutation in pyrE, respectively. Mutations at these sites from KH1U and KH2U decreased the activity of orotate phosphoribosyl-transferase encoded by the pyrE gene and blocked the degradation of 5-FOA into toxic 5-FOMP and 5-FUMP that kill the cells. Therefore, KH1U and KH2U were uracil auxotrophs. Transformation of Sulfolobus-Escherichia coli shuttle vector pC bearing pyrEF genes from S. solfataricus P2 into S. acid-ocaldarius mutant KH2U restored 5-FOA sensitivity and overcame the uracil auxotrophy. This study establishes an efficient genetic strategy towards the systematic knockout of genes in S. acidocaldarius.

MWCNT 보강된 에폭시 수지의 장기성능 예측

최순호(Sunho Choi),차재호(Jaeho Cha),윤성호(Sungho Yoon) 한국추진공학회 2018 한국추진공학회 학술대회논문집 Vol.2018 No.12

C 언어 협동학습을 위한 시스템 구현

한새론(SaeRon Hann),차재호(Jaeho Cha),김영지(Youngji Kim),최관순(KwanSun Choi),임종식(Jongsik Im),김동식(Dongsik Kim),이순흠(SunHeum Lee),전흥구(Heunggu Jeon) 한국정보기술학회 2011 Proceedings of KIIT Conference Vol.2011 No.5

웹을 기반으로 하는 협동학습은 시.공간을 초월하여 대화와 토론활동을 통한 학습이 가능하고, 학습자들은 협동학습에 균등하게 참여할 수 있는 기회를 보장한다. 본 연구에서 제안한 웹기반 협동학습시스템은 채팅창을 통해 학습자들 간의 토론활동을 통해 문제해결방법을 터득하고 이를 C언어로 코드화하여 실행결과를 얻게되는 시스템으로 채팅창과 코드창을 공유한 협동학습시스템이다. A web-based collaborative learning helps learner learn problem solving under the conversation and debate at any time, any where. It supports opportunity which learner can join in learning equally. In the paper we proposed a web-based collaborative learning system with chatting window. Thus learner can learn c programming language with others and they can confirm the execution result of their program. in the system. The proposed system makes a feature of sharing with chatting and code window.

LabVIEW을 이용한 가변저항의 원격제어 구현

이성용(SeongYong Lee),차재호(JaeHo Cha),한새론(SaeRon Han),최관순(KwanSun Choi),임종식(JongSik Lim),전흥구(HeungGu Jeon) 한국정보기술학회 2012 Proceedings of KIIT Conference Vol.2012 No.5

본 연구에서는 원격으로 저항값을 제어하는 가변저항모듈을 설계하고 이를 이용한 LabVIEW 기반의 원격 실험실을 개발하였다. 제안한 가변저항 모듈은 저항모듈(STM600R)과 스테핑모터와 결합된 장치로서 이 장치에서 나오는 저항값을 DAQ로 측정한 후, 다시 그 데이터를 DAQ에서 입력받아 프로그램에 출력하는 방식으로 원격으로 저항값을 제어할 수 있게 설계되었다. 따라서 이 장치는 언제 어디서든 저항값을 제어할 수 있는 원격실험에 사용할 수 있다. In this study, we implement a remote laboratory for circuit theory using LabVIEW. The variable resister module is developed and used in the remote laboratory. The proposed module is device which is combined with resister module(STM600R) and stepping motor. The output of the device is measured using by DAQ. The DAQ gets the value and then it is displayed in the program. Therefore we can control resister value remotely. The implemented device will be used in the laboratory which students can perform an experiment at anytime and anywhere.

Optimization of Glycosyl Aesculin Synthesis by Thermotoga neapolitana β-Glucosidase Using Response-surface Methodology

Hyunsu Park(박현수),Young-Don Park(박영돈),Jaeho Cha(차재호) 한국생명과학회 2017 생명과학회지 Vol.27 No.1

강한 항 염증 활성을 갖는 glycosyl aesculin이 Thermotoga neapolitana β-glucosidase의 당전이 활성을 통하여 aesculin을 수용체로 이용하여 합성되었다. 약 2 μg의 효소를 이용하여 반응표면분석법을 통한 주요 반응 매개변수들의 최적화가 시도되었다. 각 반응 변수들의 통계분석 결과 2차 다항식모델이 적용된 유의값(p<0.05)에 잘 맞았다. Aesculin과 다른 매개변수사이의 상호관계를 의미하는 반응표면곡선 그래프는 glycosyl aesculin의 수율이 주로 aesculin의 농도와 반응시간에 영향을 받음을 나타내었다. Glycosyl aesculin의 생산을 위한 반응최적조건은 aesculin의 농도 9.5 g/l, 온도 84℃, 반응시간 81분, 그리고 pH 8.2로 나타났으며, 이러한 조건하에서 효소반응시 61.7%의 전환율로 5.86 g/l 의 수율이 예상되었다. 실험을 통한 실질적인 수율은 6.02 g/l으로 나타났다. 실질적인 수율과 가까운 값을 예측 가능하다는 것을 통하여 반응표면분석법이 효소반응의 전환율을 최적화하는데 타당하다는 것이 입증되었다. 본 연구에서는 반응표면분석법을 활용하여 최적화 이전에 비하여 약 1.6배의 glycosyl aesculin을 얻을 수 있었다. 이러한 결과들은 반응표면분석법이 미생물유래 당화효소를 이용한 생물학적 활성을 갖는 배당체 합성의 생산 최적화에 효과적으로 활용할 수 있다는 것을 보여준다. Glycosyl aesculin, a potent anti-inflammatory agent, was synthesized by transglycosylation reaction, catalyzed by Thermotoga neapolitana β-glucosidase, with aesculin as an acceptor. The key reaction parameters were optimized using response-surface methodology (RSM) and 2 μg of the enzyme. As shown by a statistical analysis, a second-order polynomial model fitted well to the data (p<0.05). The response surface curve for the interaction between aesculin and other parameters revealed that the aesculin concentration and reaction time were the primary factors that affected the yield of glycosyl aesculin. Among the tested factors, the optimum values for glycosyl aesculin production were as follows: aesculin concentration of 9.5 g/l, temperature of 84℃, reaction time of 81 min, and pH of 8.2. Under these conditions, 61.7% of glycosyl aesculin was obtained, with a predicted yield of 5.86 g/l. The maximum amount of glycosyl aesculin was 6.02 g/l. Good agreement between the predicted and experimental results confirmed the validity of the RSM. The optimization of reaction conditions by RSM resulted in a 1.6-fold increase in the production of glycosyl aesculin as compared to the yield before optimization. These results indicate that RSM can be effectively used for process optimization in the synthesis of a variety of biologically active glycosides using bacterial glycosidases.

Enzymatic Characterization of a Thermostable 4-α-Glucanotransferase from Thermotoga neapolitana

Kyoung-Hwa Choi(최경화),Ja Yeong Seo(서자영),Jieun Kim(김지은),Jaeho Cha(차재호) 한국생명과학회 2011 생명과학회지 Vol.21 No.2

Thermotoga neapolitana 유래 내열성 4-알파-글루칸전이효소(MgtA)가 산업적 응용성을 지닌 싸이클로아밀로스를 생산할 수 있는지를 검사하기 위하여 그 유전자를 클로닝하고 대장균에서 발현시켰다. MgtA는 HiTrap Q와 Sephacryl S-200 분배 크로마토그래피를 이용하여 순수한 형태로 정제되었으며, SDS-PAGE를 통하여 분자량이 약 52 kDa으로 아미노산서열로부터 계산된 분자량과 일치하였다. 효소활성의 최적 pH와 온도는 6.5와 85℃였으며 알파1,4결합을 갖는 글루칸의 1,4결합을 효율적으로 가수분해함과 동시에 작은 크기의 올리고당을 말토덱스트린에 전이하는 전이활성을 가지고 있었다. 그러나 플루란, 글리코겐 및 1,4결합 이외의 다른 알파결합을 갖는 글루칸에는 활성을 나타내지 않았다. MgtA는 말토트리오스를 말토올리고당으로 전환할 수 있는 능력에서 그렇지 못한 Thermotoga maritima 의 효소와 구별할 수 있었으며, 반응 후 glucoamylase의 처리결과로부터 그 전이산물이 싸이클로아밀로스 대신에 긴 연쇄상의 말토올리고당을 생산하는 효소로 확인할 수 있었다. The gene encoding 4-α-glucanotransferase (mgtA) from Thermotoga neapolitana was cloned and expressed in Escherichia coli in order to investigate whether this enzyme was capable of producing cycloamylose for industrial applications. MgtA was purified to homogeneity by HiTrap Q HP and Sephacryl S-200 HR column chromatographies. The size of the enzyme as determined by SDS-PAGE was about 52 kDa, which was in good agreement with its deduced molecular mass of 51.9 kDa. The optimal temperature and pH for the activity of the 4-α-glucanotransferase was found to be 85oC and 6.5, respectively. The enzyme hydrolyzed the 1,4-α-glucosidic bonds in oligomeric 1,4-α-glucans and transferred oligosaccharides (maltotriose being the shortest one) to acceptor maltodextrins. However, the enzymes had no activity against pullulan, glycogen, and other di- or trioligosaccharides with rare types of α-bond. MgtA is distinguished from 4-α-glucanotransferase from Thermotoga maritima in that it can convert maltotriose into maltooligosaccharides. The treatment of glucoamylase after the reaction of MgtA with maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, or maltohexaose as sole substrate revealed that MgtA yielded linear maltooligosaccharides instead of cycloamylose.

Purification and Biological Characterization of Wild-type and Mutants of a Levan Fructotransferase from Microbacterium sp. AL-210

Eun Young Hwang(황은영),Mi Suk Jeong(정미숙),Jaeho Cha(차재호),Se Bok Jang(장세복) 한국생명과학회 2009 생명과학회지 Vol.19 No.9

DFA (Difructose anhydride)는 특유의 구조적인 안정성 때문에 당뇨병 환자를 위한 당원으로써 적합하다는 연구가 보고 되어 있다. DFA에는 4가지 type이 있는데 inulin에 의한 DFA Ⅰ DFA Ⅲ DFAⅤ가 있고 levan에 의한 DFA Ⅳ 가 있는 것으로 알려져 있다. 특히 DFA Ⅳ는 당뇨병 환자를 위한 당원 뿐 만 아니라 rat을 이용한 연구에서 칼슘의 흡수를 도와 준다는 보고가 있었다. 이러한 DFAⅣ를 생성하는 데 쓰이는 Microbacterium sp. AL-210에서 유래한 LFTase (Levan fructotransferase)의 wild-type과 mutants (D63A, D195N, N85S)의 구조적 특성을 밝히기 위해 정제하였다. LFTase의 wild-type과 mutants들을 대량 발현시킨 후 흡착 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 그리고 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 고순도로 분리 정제하였으며 이를 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다. 분리 정제된 단백질을 JNET 이차 구조 예측 프로그램, solubility 측정, CD (원 편광 이색성 분광편광계), fluorescence spectroscopy (형광분석법), DSC (시차주사열량계)를 이용하여 분석하였다. 또한 다중 정렬과 2차 구조 예측 프로그램을 이용하여 wild-type의 2차 구조를 분석하였다. Solubility 측정에서 가장 적합한 온도는 55℃, 최상의 pH는 7.5로 나타났다. CD 분석에서 wild-type과 비교한 결과 다른 mutant에 비해 N85S의 α-helix가 많이 감소한 것과 β strand와 random coil이 증가한 것을 확인하였다. 또한 DSC 분석을 통해 wild-type이 다른 mutants에 비해 안정적인 구조를 지닌 것을 확인하였다. 형광분석에서 N85S가 wild-type과 가장 유사하게 나타났으며 D63A와 D195N은 wild-type에 비해 높은 강도를 나타내었다. 또한 wild-type의 sequecnce를 Exo-inulinase from Aspergillus awamori, a plant fructan 1-exohydrolase from Cichorium intybus 그리고 invertase from Thermotogo maritime (Tm)의 sequecnce 와 다중 정렬한 결과 Exo-inulinase와 높은 identity를 보였다. Difractose anhydrides (DFAs) is studied as a sweetener for diabetics because of its structural property. DFAs have four types: DFAⅠ, Ⅲ, Ⅳ (degradation of levan) and V (degradation of inulin). Especially, DFA Ⅳ has been shown to enhance the absorption of calcium in experiments using rats. Levan fructotransferase is an enzyme for producing di-d-fructose-2,6’:6,2’-dianhydride (DFA Ⅳ). To identify structural characterization, we purified wild-type and mutants (D63A, D195N and N85S) of levan fructotransferase (LFTase) from Microbacterium sp. AL-210. These proteins were purified to apparent homogeneity by Ni-NTA affinity column, Q-sepharose ion exchange and gel filtration chromatography and detected by SDS-PAGE. They were also analyzed by circular dichroism (CD) measurements, JNET secondary structure prediction, activity measurements at various temperatures, and pH analysis. The optimum pH for the enzyme-catalyzed reaction was pH 7.5 and optimum temperature was observed at 55oC. Along with wild-type LFTase, mutants were analyzed by CD measurement, fluorescence analysis and differential scanning calorimetry (DSC). N85S showed less α-helix and more β strand than others. Also, N85S showed almost the same curve as wild-type in their steady-state fluorescence spectra, whereas mutant D63A and D195N showed higher intensity than wild-type. The amino acid sequence of wild-type LFTase was compared to the sequences of exo-inulinase from Aspergillus awamori, a plant fructan 1-exohydrolase from Cichorium intybus, and Thermotogo maritime (Tm) invertase and showed a high identity with Exo-inulinase from Aspergillus awamori.

Xenon flashlamp와 광촉매를 이용한 타원형 반응기의 살균 특성에 관한 연구

이동길(Dong-Gil Lee),홍지태(Ji-Tae Hong),최경화(Kyoung-Hwa Choi),차재호(Jaeho Cha),김홍주(Hong-Ju Kim),김희제(Hee-Je Kim) 대한전기학회 2009 전기학회논문지 Vol.58 No.3

In this paper, we invented a new and unique technique for the sterilization of Escherichia coli(E. coli) in polluted water. We applied a rich ultra-violet(UV) light from pulsed xenon flashlamp and photocatalyst(TiO₂) to sterilize E. coli in polluted water. This method based on the use of UV light and photocatalyst is eco-friendly and does not cause secondary pollution. The proposed elliptical reactor is able to concentrate on quartz sleeve coated TiO₂ or general quartz sleeve. The primary objective of our research was to determine the important parameters such as pulse repetition rate and input voltage and to know on the sterilizing efficiency of quartz sleeve coated TiO₂ and general quartz sleeve. We obtained to achieve 99.999% sterilization in as little as 6 pulses at 800 V in case of quartz sleeve coated TiO₂, and 10 pulses at 800 V in case of general quartz sleeve for 5 minutes. Although transmitted light of quartz sleeve coated TiO₂ is deceased, the sterilizing efficiency is increased by 40% than general quartz sleeve. The reason of high sterilizing efficiency is that generated hydroxyl radical(OH) by photocatalyst and is able to concentrate light at a focus by using elliptical reactor.

비브리오속 균주들에서의 세포외 효소의 분포

김윤희(Yoon Hee Kim),정초록(Cho Rok Jung),김수광(Soo Kwang Kim),양지영(Ji-Young Yang),차재호(Jaeho Cha) 한국식품영양과학회 2001 한국식품영양과학회지 Vol.30 No.2

병원성 비브리오와 비병원성 비브리오 사이의 세포외 효소 활성 차이점을 비교하기 위하여 마우스를 이용하였다. 각 균주들을 마우스에 약 10^8 CFU로 복강 주사한 다음 다시 분리하여 세포외 효소 활성을 비교 검토하였다. 병원성 비브리오의 세포외 효소 탐색은 protease(BSA, casein, skim milk, gelatin), mucinase, hemolysin, hyaluronidase 및 chondroitin sulfatase 활성을 측정하여 수행하였다. 그리고 elastase 활성, fibrinolysis 활성을 측정하는 방법을 본 연구에 맞게 확립하였다. 치사율이 높게 나타나는 균주에서는 시험 대상의 세포외 효소의 활성이 모두 높게 나타났으며, 치사율이 낮아질수록 세포외 효소의 활성은 낮게 나타났다. 치사율에 비례하여 활성을 높게 보이는 효소는 대부분의 proteases, hemolysin이 뚜렷하였으며, 그 외의 대부분의 세포외 효소들도 병원성 균주에서 높은 활성을 보였다. Hemolysis의 경우는 치사율이 높은 V. vulnificus, V. parahemolyticus 등의 균주에서는 β 완전 용혈소의 분비가 뚜렷하게 관찰되는 반면, 치사율이 낮은 균주에서는 α 불완전 용혈소의 분비를 관찰할 수 있었다. V. harveyi는 비병원성 균으로 알려졌음에도 불구하고 병원성 균에서 분비하는 세포외 효소들을 대부분 분비하고 치사율도 매우 높음을 보여주었다. 결론적으로 병원성 비브리오균주의 높은 세포외 효소의 활성은 이 효소의 생산이 비브리오균들의 pathogenicity에 깊은 연관성이 있음을 시사한다고 볼 수 있다. The members of the genus Vibrio include harmless aquatic strains as well as strains capable of causing infections in human and fish. Pathogenic mechanisms are only understood for Vibrio cholerae O1 and O139 and not for the majority of Vibrio species. Twelve clinical and nonclinical strains were examined by in vitro and in vivo experiments for the importance of extracellular enzymes as a virulence determinant of Vibrio species. In vivo cytotoxicity assay was performed by injecting approximately 10^8 cells/mL into mice (BALB/c). V. harveyi and V. vulnificus showed 100% lethality within 3 hr after bacterial injection. V. fluvialis and four strains of V. parahaemolyticus showed 50% lethality within 4 hr. V. mimicus, V. alginolyticus and V. furnissii revealed 30% lethality within 9 hr. Nonclinical strains, V. campbellii and V. ordalii, did not show any lethality. In vitro protease and hemolytic activities were also good indicators for clinical and nonclinical strains of Vibrio species. The clinical strains showed much higher activities than nonclinical strains. The activity of some clinical strains of re-isolates was evidently increased. Most clinical strains had β hemolytic activity. The results demonstrate that the prevalent distribution of extracellular proteases in pathogenic Vibrio sp. implies their importance as a virulence determinant.

Enzymatic Synthesis of Polyphenol Glycosides by Amylosucrase

박현수(Hyunsu Park),최경화(Kyoung-Hwa Choi),박영돈(Young Don Park),박천석(Cheon-Seok Park),차재호(Jaeho Cha) 한국생명과학회 2011 생명과학회지 Vol.21 No.11

재조합 아밀로수크라아제의 폴리페놀 배당체를 합성하는 능력을 검사하였다. 이 효소의 효소작용 특성에 근거하여 설탕을 기질로 사용하였으며 21 종류의 각기 다른 폴리페놀 화합물들이 수용체로 사용되었다. 당 전이 반응은 사용한 폴리페놀에 따라 하나 또는 두 개의 주요 폴리페놀 배당체를 합성하였다. 합성된 폴리페놀 배당체들은 박막 크로마토그래피법을 이용하여 확인되었고, 새로이 합성된 배당체의 구조는 당 전이 작용 특성에 근거하여 예측되었다. 수용체로 가능한 폴리페놀의 구조적 특징들이 평가되었으며, 이러한 결과는 Deinococcus geothermalis 유래 아밀로수크라아제가 식품, 화장품, 및 제약산업에서 높은 잠재성을 갖는 폴리페놀 배당체의 효소적 합성에 매우 효율적인 촉매로 활용될 수 있다는 것을 보여준다. The capability of synthesizing polyphenol glycosides was examined using recombinant amylosucrase from the hyperthermophilic bacterium Deinococcus geothermalis. Based on the action mode of amylosucrase, sucrose and twenty-one polyphenols were used as a donor and acceptors respectively. The transglycosylation reaction by amylosucrase produced one or two major polyphenol glycosides depending on the type of polyphenols used. The synthesized polyphenol glycosides were detected by thin-layer chromatography. The structures of the newly synthesized polyphenol glycosides were predicted based on the transglycosylation mechanism of the enzyme. According to the acceptability of the polyphenols, the structural characteristics of polyphenol as an efficient acceptor were evaluated. The results indicate that amylosucrase is an efficient catalyst for the enzymatic synthesis of polyphenol glycosides, which have high potentials in food, cosmetics, and pharmaceutical industries.