Enhancing the Enzymatic Activity of the Multifunctional β-Glycosyl Hydrolase (Cel44C-Man26A_P558) from Paenibacillus polymyxa GS01 Using DNA Shuffling

강영민,강태호,윤한대,조계만,Kang, Young-Min,Kang, Tae-Ho,Yun, Han-Dae,Cho, Kye-Man The Microbiological Society of Korea 2012 미생물학회지 Vol.48 No.2

본 연구자들은 이전에 cellulase, xyalnase 및 lichenase의 다기능 효소활성을 지니는 절단된 Cel44C-$Man26A_{P558}$의 ${\beta}$-glycosyl hydrolase를 보고하였다. 본 연구에서는 절단된 Cel44C-$Man26A_{P558}$ 효소의 다기능성 ${\beta}$-glycosyl hydrolase 활성을 증가시키기 위해 DNA shuffling을 시도하였다. DNA shuffling에 의해 단일변이(P438A)를 가진 M2Cel44C-$Man26A_{P558}$와 이중변이(A273T 및 P438A)를 가진 M21Cel44C-$Man26A_{P558}$를 얻었다. 이중변이를 가진 M21Cel44C-$Man26A_{P558}$은 단일변이를 가진 M2Cel44C-$Man26A_{P558}$ 보다 효소활성이 낮게 나타났으나, M2Cel44C-$Man26A_{P558}$와 M21Cel44C-$Man26A_{P558}$은 대조구인 Cel44C-$Man26A_{P558}$ 보다 약 1.3에서 2.2배 정도 높은 효소활성을 나타내었다. 특히, 단일변이를 가진 M2Cel44C-$Man26A_{P558}$는 대조구인 Cel44C-$Man26A_{P558}$보다 cellulase, xylanase 및 lichenase 효소활성이 약 1.5에서 2.2배 정도 높게 나타났다. ${\beta}$-Glycosyl hydrolase의 cellulase, linchenase 및 xylanase 최적 효소활성은 각각 pH 7.0, 7.0 및 6.0에서 이었다. 이러한 결과는, 아미노산 잔기인 Ala438이 다기능성 ${\beta}$-glycosyl hydrolase 활성을 증가시키는 중요한 역할을 한다고 추정할 수 있다. We previously reported that the truncated Cel44C-$Man26A_{P558}$ ${\beta}$-glycosyl hydrolase protein exhibits multifunctional activities, including cellulase, xylanase, and lichenase. DNA shuffling of the truncated Cel44C-$Man26A_{P558}$ enzyme was performed to enhance the enzymatic activity of the multifunctional ${\beta}$-glycosyl hydrolase. Two mutant enzymes, M2Cel44C-$Man26A_{P558}$ that carries one mutation (P438A) and M21Cel44C-$Man26A_{P558}$ that carries two mutations (A273T and P438A) were obtained. The enzymatic activity of the M21Cel44C-$Man26A_{P558}$ double mutant was lower than enzymatic activity of the single mutant (M2Cel44C-$Man26A_{P558}$). However, both mutants displayed the enhancements in their enzyme activities that were ${\approx}1.3$- to 2.2-fold higher than the original enzymatic activity in Cel44C-$Man26A_{P558}$. In particular, the mutant M2Cel44C-$Man26A_{P558}$ exhibited an approximate 1.5- to 2.2-fold increase in the cellulase, xylanase, and lichenase activities in comparison with the control (Cel44C-$Man26A_{P558}$). The optimum cellulase, linchenase, and xylanase activities of ${\beta}$-glycosyl hydrolase were observed at pH 7.0, pH 7.0 and pH 6.0, respectively. These results, therefore, suggest that the amino acid residue Ala438 plays important roles in the enhancement of the activity of multifunctional ${\beta}$-glycosyl hydrolase.

약초 추출액을 사용하여 제조한 감주의 젖산발효

조계만(Kye Man Cho),안병용(Byung Yong Ahn),서원택(Weon Taek Seo) 한국식품과학회 2008 한국식품과학회지 Vol.40 No.6

한방발효음료를 제조하기 위하여 한방감주의 젖산발효를 유도하였다. 이를 위해 각종 시료로부터 다양한 젖산균을 순수 분리하여 발효적성을 검토한 결과 최적균주로서 LAB19 균주를 선별하였다. LAB19 균주는 곶감으로부터 분리하였으며 생리 화학적 특성 및 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 Leuconostoc mesenteroides로 동정되었다. 한방감주에 종배양한 LAB19 균주를 2.5%(v/v) 접종하고 25oC에서 60시간 발효시켰을 때, 한방감주는 141.3 g/L의 환원당과 5.33 g/L의 유기산, 그리고 1.19 g/L의 가용성 페놀을 함유하고 있었다. 당과 유기산 구성을 살펴보면 당의 약 90%는 맥아당이었으며, 유기산의 58%는 젖산이었다. 수용성 phenolics 성분 등에 기인하는 라디칼 소거 활성은 L-ascorbic acid의 92.4% 보다 낮은 76.6-75.7% 범위를 유지하고 있었다. In this study, the characteristics of the lactic fermentation of gamju manufactured using a medicinal herb decoction were assessed. A bacterial strain, LAB19, which is used for the induction of lactic fermentation into gamju, was isolated from dried persimmon and identified as Leuconostoc mesenteroides on the basis of morphological, physiological, and chemotaxonomical features, and 16S rRNA sequencing analysis. After 60 hours of lactic fermentation with Leuconostoc mesenteroides LAB19 at 25℃, the gamju was determined to contain 141.3 g/L of reducing sugar, 5.33 g/L of acids, and 1.19 g/L of soluble phenolics. Approximately 90% of reducing sugar and 58% of acids were maltose and lactic acid, respectively. Free radical scavenging activities were retained at levels between 76.6 to 75.7% during the lactic fermentation of gamju.

볶음처리에 의한 자색고구마의 항산화 증진 효과

조계만 ( Kye Man Cho ),주옥수 ( Ok Soo Joo ) 한국식품저장유통학회(구 한국농산물저장유통학회) 2012 한국식품저장유통학회지 Vol.19 No.5

Purple sweet potato (PSP, Ipomoea batatas) has various biological effects including antidiabetic, anti-inflammatory, and antioxidant activities. In this study, the antioxidant activity of PSP after roasting were compared using DPPH, ABTS, and FRAP assays. In addition, the total phenolics and flavonoid contents, Maillard reaction products, and phenolic acid contents were measured to identify the factors that changed PSP,s antioxidant activity due to roasting. The roasted PSP exhibited significantly higher antioxidant activity than unroasted PSP. In particular, the PSP roasted at 200℃ for 10 min showed the highest antioxidant activity among all the PSPs that were roasted under different conditions. The total phenolic and flavonoid contents, Maillard reaction products and phenolic acid contents markedly increased, corresponding to the general increase in antioxidant activities after roasting. These results suggest that roasted PSP extracts are potential source of natural antioxidants that may be used in certain food applications.

옥수수 수염 추출액을 이용한 식혜 제조

조계만 ( Kye Man Cho ),주옥수 ( Ok Soo Joo ) 한국식품저장유통학회 ( 구 한국농산물저장유통학회 ) 2010 한국식품저장유통학회지 Vol.17 No.5

단감(Diospyros kaki, T) 와인 제조에 관한 연구

조계만(Kye Man Cho),이정복(Jung Bock Lee),강군중(Goon Gjung Kahng),서원택(Weon Taek Seo) 한국식품과학회 2006 한국식품과학회지 Vol.38 No.6

Acetobacter pasteurianus A8를 이용한 우리밀(금강밀) 식초 제조

조계만(Kye Man Cho),신지현(Ji Hyeon Shin),서원택(Weon Taek Seo) 한국식품과학회 2013 한국식품과학회지 Vol.45 No.2

우리밀(금강밀)을 기질로 사용한 식초 생산을 위하여 초산 생성능이 우수한 초산균을 재래 식초로부터 분리하여 A. pasteurianus A8으로 동정하였다. 우리밀 엿기름의 제조를 위해 발아 조건을 살펴본 결과, 15℃에서 6일간 발아 시킨 밀의 amylase 활성이 608.4 unit으로 가장 높았다. A. pasteurianus A8 균주를 종균으로 사용하여 우리밀 알코올 발효액의 초산 발효 조건을 살펴본 결과, 발효온도 30℃, 초기 알코올 농도 5.0%, 및 종균 접종량 5.0%에서 24일간 정치 발효하여 5.8%의 초산을 생산할 수 있었다. We tested the possibility of utilizing Korea domestic wheat (winter wheat variety “keumkangmil”) as a source of vinegar production. After saccharification of the whole-wheat flour with wheat malt, the saccharized liquid undergoes alcoholic fermentation, followed by acetic fermentation. Acetic acid bacterium A8, which showed the highest acetic acid production (4.56%) with domestic wheat as substrate, was selected from conventional vinegars. The strain A8 was identified as Acetobacter pasteurianus A8 through phylogenetic study using 16S rDNA sequencing analysis. The optimal condition for the malt enzyme was found to be 15℃ for germination periods of 6 days; its amylase activity was 608.4 U. Acetic acid production from domestic wheat substrate supplemented with 5% ethyl alcohol reached 5.8% after 24 days of static fermentation at 30℃ with a seeding rate of 5%.

Rhizopus oryzaeCCS01로 제조된 쌀누룩을 이용한 곡류 막걸리의 품질 특성

조현국(Hyeon Kook Cho),서원택(Weon Taek Seo),이주영(Ju Young Lee),조계만(Kye Man Cho) 한국식품영양과학회 2012 한국식품영양과학회지 Vol.41 No.7

본 연구에서는 시판누룩에서 분리한 Rhizopus oryzae CCS01로 쌀누룩을 제조하고 이를 이용하여 곡류 막걸리 제조하였다. R. oryzaeCCS01로 제조한 쌀누룩은 시판누룩보다 탄수화물 함량은 높았으나, 수분 및 회분, 조단백질, 조지방 함량은 낮았고 당화력은 약 2.2배 정도 높게 나타났다. R. oryzaeCCS01로 제조된 쌀누룩으로 제조한 막걸리는 pH와 알코올 함량은 시판누룩보다 높게 나타났으나, 당도 및 산도, 젖산균수, 효모균수, 갈변도는 낮게 나타났다. 특히 쌀 누룩으로 제조한 찹쌀(GUR) 막걸리의 경우 다른 막걸리들 보다 알코올 함량이 가장 높았다. 이 결과로 R. oryzae CCS01로 제조된 쌀누룩을 이용하여 새로운 곡류 막걸리 제조가 가능할 수 있을 것으로 판단되었다. For the production of Korea traditional cereal wine makgeolli, a rice fermentation starter nurukwas Rhizopus oryazeCCS01 commercial nuruk. The carbohydrate content of rice nurukwas higher, the levels of moisture, ash, crude protein, and crude fat were lower. In particular, the saccharifying activity of rice nurukwas 2.2 times higher than commercial nuruk. pH, alcohol, and viable yeast cells of makgeollimade rice nurukwere higher than those of makegollimade commercial nuruk. In contrast, the levels of acidity, oBrix, viable lactic acid bacteria (LAB) cells, and browning of makgeollimade rice nurukwere lower than those of makgeollimade commercial nuruk, the alcohol content of glutinous rice (GUR) makgeollimade rice nurukhigher other samples. These results suggest that rice nuruk R. oryzae CCS01 make new type cereal makgeolli.

Cloning of Isoamylase Gene of Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum LY34 and Identification of Essential Residues of Enzyme

조계만,김은주,레누카라디아마스,샤모허마드아스라풀,홍선주,김종옥,신기재,이영한,김훈,윤한대,Cho, Kye-Man,Kim, Eun-Ju,Math, Renukaradhya K.,Asraful Islam, Shah Md.,Hong, Sun-Joo,Kim, Jong-Ok,Shin, Ki-Jae,Lee, Young-Han,Kim, Hoon,Yun, Han-Dae Korean Society of Life Science 2007 생명과학회지 Vol.17 No.9

연부균인 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum LY34로부터 이소아밀라제 유전자 (glgX)를 클로닝한 후 대장균 숙주에서 발현시켰다. 이 효소는 ${\alpha}-1$,6-글루코시드 결합을 가수분해하였으나 ${\alpha}-1$,4-글루코시드 결합은 가수분해 하지 못하였다. 유전자는 658개의 아미노산을 암호화하는 1,977개의 DNA 염기서열로 이루어져 있었고 이 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 다른 아밀라제 효소들과 비교한 결과 이소아밀라제 유전자와 유사하였으며 4개의 보존 지역을 확인하였다. SDS-PAGE에 의해 확인된 단백질의 크기는 약 74 kDa 이었다. 효소 활성은 pH 7.0, $40^{\circ}C$에서 가장 높은 활성을 나타났으며 $Ca^{2+}$ 첨가로 활성이 증가되었다. 이 효소의 보존되어 있는 아미노산 중에 글루탐산 370번, 아스파르트산 335번 및 442번 잔기를 알라닌으로 치환시킨 결과 활성이 약해졌다. 이 결과로부터 이들 잔기들이 효소활성에 중요한 역할을 하는 것으로 추정된다. The gene encoding for isoamylase of the Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc) LY34 was cloned and expressed into Escherichia coli $DH5{\alpha}$. Isoamylase catalyzes the hydrolysis of ${\alpha}-1,6-glycosidic$ linkages specifically in amylopectin, glycogen, and derived oligosaccharides, while the enzyme did not hydrolyze ${\alpha}-1,4-glycosidic$ linkages of amylose. The isoamylase gene (glgX) had an open reading frame of 1,977 bp encoding 658 amino acid residues with a calculated molecular weight of 74,188 Da. The molecular weight of the enzyme was also estimated to be 74 kDa by activity staining of a SDS-PA gel. The mature GlgX had a calculated pI of 4.91. Isoamylase from Pcc LY34 had 70% amino acid identity with isoamylase from Pectobacterium chrysanthemi and contained the four regions conserved among all amylolytic enzymes. The isoamylase was optimally active at pH 7.0 and $40^{\circ}C$. GlgX was $Ca^{2+}-dependent$. The changes of Asp-335, Glu-370, and Asp-442 into Ala, respectively, using site-directed mutagenesis techniques showed that three residues are essential to isolamyalse (GlgX) activity. The sequences around those residues were highly conserved in isoamylase of different origins and GlgX of the glg operon in glycongen biosynthesis.

반응표면분석을 이용한 청국장 제조시 마늘의 첨가조건 최적화

황초롱 ( Cho Rong Hwang ),심혜진 ( Hye Jin Sim ),김경민 ( Gyeong Min Kim ),조계만 ( Kye Man Cho ),김정환 ( Jeong Hwan Kim ),신정혜 ( Jung Hye Shin ) 한국식품조리과학회(구 한국조리과학회) 2013 한국식품조리과학회지 Vol.29 No.6

마늘을 이용한 청국장의 제조조건을 최적화 하고자 중심합성계획에 따라 마늘의 첨가량(X1), 마늘 열처리시간(X2) 및 청국장 발효시간(X3)을 독립변수로 하고, 점질물 생성량(Y1), 산도(Y2), 아미노태 질소량(Y3), γ-GTP(Y4) 및 ABTS 라디칼 소거능(Y5)을 종속변수로 하여 반응표면분석을 실시하였다. 점질물 생성량의 정상점은 최대점으로 실제변수인 마늘의 첨가량이 6.53%, 열처리 시간 6.81분, 청국장 발효시간 55.18시간에서 13.02%의 최적 값을 보였다. 산도는 청국장의 발효시간이 길어질수록 증가하였으며, 최소값인 0.50%를 나타내는 마늘 첨가량의 실제변수는 7.75%, 열처리 시간은 3.42분, 청국장 발효는 58.60시간이었다. 아미노태 질소 함량은 80.58∼158.82 mg% 범위였는데 정상점은 안장점으로 능선분석을 통해 얻어진 아미노태 질소의 최고값은 156.97 mg%였다. 이 때 마늘 첨가량 및 열처리 시간은 각각 6.21% 및 14.85분, 청국장 발효시간은 58.04시간이었다. γ-GTP 활성은 353.66mU/mL의 최대값을 가질 때, 마늘 첨가량, 마늘 열처리 시간 및 청국장 발효시간이 각각 5.73%, 6.99분, 57.96시간 이었다. ABTS 라디칼 소거능은 마늘 첨가량과 청국장 발효시간을 낮추고 마늘의 열처리 시간을 높이는 경우 76.43%의 최고값 얻을 수 있었는데, 이에 따른 실제변수의 마늘의 첨가량과 열처리시간은 각각 3.78% 및 14.28분과 청국장 발효시간은 57.99시간이었다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 마늘이 첨가된 청국장 제조를 위해 마늘은 불린 콩 무게 대비 3.78~7.75%로 첨가하되 3.42~14.85분의 범위에서 스팀가열한 후 사용하며, 55~59시간 정도 발효시키는 것이 적합하였다. This study was performed to determine the optimal composition of Cheonggukjang added with garlic. The experiment utilized a central composite design (CCD). The evaluation was carried out by means of response surface methodology (RSM), which included 18 experimental points with three independent variables : the content of the garlic (1.3∼9.7%, X1), the steaming time of garlic (0∼15.1 min, X2), and the fermentation time of Cheonggukjang (48.2∼71.8 h, X3). The viscous substance (Y1), acidity (Y2), amino-type nitrogen (Y3), γ-GTP activity (Y4) and ABTS radical scavenging activity (Y5). were assessed in four replicates with five dependent variables. The maximum content of the viscous substance was 13.02% at 6.53% (X1), 6.81 min (X2) and 55.18 h (X3). The acidity was increased when the fermentation time was longer, and the minimum acidity point was 0.50% at 7.75% (X1), 3.42 min (X2) and 58.60 h (X3), respectively. The content of the amino-type nitrogen at the experimental range studied was was 80.58∼158.82 mg%, and the stationary point was at saddle point. Using ridge analysis, the maximum point was 156.97 mg% at 6.21% (X1), 14.85 min (X2) and 58.04 h(X3). The optimum conditions of γ-GTP activity was 5.73% (X1), 6.99 min (X2) and 57.96 h(X3), respectively, at the maximum point was 353.66 mU/mL. The maximum point of ABTS radical scavenging activity was 76.43% at 3.78% (X1), 14.28 min (X2) and 57.99 h(X3) at the saddle point, when the garlic steaming time was longer.

Cloning and Identification of Essential Residues for Thermostable β-glucosidase (BgIB) from Thermotoga maritima

홍수영,조계만,김용희,홍선주,조수정,조용운,김훈,윤한대,Hong, Su-Young,Cho, Kye-Man,Kim, Yong-Hee,Hong, Sun-Joo,Cho, Soo-Jeong,Cho, Yong-Un,Kim, Hoon,Yun, Han-Dae Korean Society of Life Science 2006 생명과학회지 Vol.16 No.7

A hyperthermophilic bacterium Thernotoga maritima produced thermostable ${\beta}-glucosidase$. The gene encoding ${\beta}-glucosidase$ from T. maritima MSB8 was cloned and expressed in Escherichia coli. The en-zyme (BgIB) hydrolyzed ${\beta}-glucosidase$ linkages between glucose and alkyl, aryl of saccharide groups such as salicin, arbutin, and $_pNPG$. The insert DNA contained ORF with 2,166 bp encodes a 721 amino acids (calculated molecular mass of 80,964 and pl of 4.93). The amino a.id sequence of BglB showed the similarity to family 3 glycosyl hydrolases. The molecular weight of the enzyme was estimated to be approximately 81kDa by MUG-nondenaturing PAGE (4-methylumbelliferyl 13-D-glucoside-nondenaturing polyacrylamide gel electophoresis) and SDS-PACE. The ${\beta}-glucosidase$ exhibited maximal activity at pH 7.0 and $80^{\circ}C$. By exchanging two possible residues (Glu-232 and Asp-242) to Ala by site-directed mutagenesis method, it was found that these were essential for enzymatic activity. 초고온성 세균인 Thermotoga maritima로부터 ${\beta}-glucosidase$ 유전자를 클로닝한 후 대장균 숙주에서 발현시켰다. 이 효소는 salicin, arbutin, $_pNPG$과 같은 탄소원의 ${\beta}$-글루코시드 결합을 가수분해하였다. 721개의 아미노산을 암호화하는 2,166 bp의 DNA 염기서열로된 유전자이였다. 다른 ${\beta}-glucosidase$ 효소들과 단백질 유사성을 비교한 결과 glycosyl hydrolase family 3에 속하였으며 MUG-nondenaturing PAGE와 SDS-PAGE에 의해 확인된 단백질의 크기는 약 81 kDa이었다. 효소활성은 pH 7.0, $80^{\circ}C$에서 가장 높은 활성을 나타냈으며 이 효소의 아미노산 서열에 있는 두 개의 아미노산 잔기 (232번 글루탐산과 242번 아스파르트산 잔기)를 알라닌으로 치환시켜 활성이 없어지는 것으로 보아 이 두 잔기가 효소활성에 중요한 역할을 하는 것으로 추정된다.