생물학전문연구정보센터

이창묵,Lee Chang-Muk 한국공학기술학회 2000 공학교육과 기술 Vol.7 No.1

독도 심해토 메타게놈 유래 신규 내열성 에스테라아제의 생화학적 특성규명

이창묵 ( Chang-muk Lee ),서소현 ( Sohyeon Seo ),김수연 ( Su-yeon Kim ),송재은 ( Jaeeun Song ),심준수 ( Joon-soo Sim ),한범수 ( Bum-soo Hahn ),김동헌 ( Dong-hern Kim ),윤상홍 ( Sang-hong Yoon ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2017 한국미생물·생명공학회지 Vol.45 No.1

독도 해저 2,000 미터 퇴적토를 이용한 메타게놈 유전자은행의 60,672 클론을 기름 성분 tributyrin이 첨가된 배지에서 스크리닝 하였다. 활성을 가진 클론에서 EstES1 유전자를 선발하였다. EstES1은 553개 아미노산으로 구성된 분자량 59.4 kDa 단백질로, 가장 높은 유사성은 Haliangium ochraceum의 carboxylesterase와 44%이었다. EstES1 서열내부에는 carboxylesterase의 전형적인 penta-peptide motif, catalytic triad 및 N-terminal 부위 37개의 leader sequence가 존재했다. 서열기반 계통분석 결과, EstES1은 신규한 esterase임을 보여주었다. EstES1 효소의 leader 서열을 제거한 재조합 수용성 RLES1 효소는 탄소 2-12까지 포함된 long acylethyl ester 기질을 모두 이용할 수 있지만, p-Nitrophenyl butyrate (C4)에 가장 높은 활성과 turn-over 값을 보였다. 최적 활성은 45℃, pH 9.0이다(specific activity 255.4 U/mg). 또한 강알칼리 상태인 pH 10.5까지 80% 이상의 활성이 유지되었다. EstES1의 활성은 60℃에서 내열성을 보여, 1시간 동안 활성을 100% 유지할 수 있다. 효소 활성은 여러 종류의 유기용매 하에서도 안정하게 유지되었다. 따라서, EstES1은 배양이 불가능한 난배양 미생물로부터 유래된 신종 효소 유전자로서, 고온의 지방산 가수분해, 알칼리 상태나 유기용매가 존재하는 여러 공정분야에 활용될 수 있다. A functional screen of 60,672 fosmid metagenomic clones amplified from marine sediment obtained from the Dokdo islets in Korea identified the gene EstES1, whose product, EstES1, displayed lipolytic properties on tributyrin-supplemented media. EstES1 is a 576 amino acid protein with a predicted molecular weight of 59.4 kDa including 37 N-terminal leader amino acids. EstES1 exhibited the highest sequence similarity (44%) to a carboxylesterase found in Haliangium ochraceum DSM14365. Phylogenetic analysis indicated that EstES1 belongs to a currently uncharacterized family of lipases. Within the conserved domain, EstES1 retains the catalytic triad that consists of the consensus penta-peptide motif, GESAG. EstES1 demonstrated a broad substrate specificity toward the long acyl group of ethyl esters (C2-C12), and its optimal activity was recorded toward p-Nitrophenyl butyrate (C4) at pH 9.0 and 40℃ (specific activity of 255.4 U/mg). The enzyme remained stable in the ranges of 60-65℃ and pH 9.0-10.5 and in the presence of methanol, ethanol, isopropanol, and dimethyl sulfoxide. Therefore, EstES1 has potential for use in industrial applications involving high temperature, organic solvents, and/or alkaline conditions.

국내 특수 생태환경의 탈질 저영양 세균의 종 다양성 및 생리적 특성 분석

이창묵 ( Chang Muk Lee ),원항연 ( Hang Yeon Weon ),권순우 ( Soon Wo Kwon ),강한철 ( Han Chul Kang ),구본성 ( Bon Sung Koo ),윤상홍 ( Sang Hong Yoon ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2011 한국미생물·생명공학회지 Vol.39 No.3

국내의 대표적 섬이나 생태환경이 잘 보존된 토양으로부터 저영양세균 3,471주를 분리하였고 이로부터 질소발생 분석법에 따라 탈질균 135주를 최종 선발하였다. 이들 균주의 16S rDNA를 염기서열 분석한 결과 이들의 90% 가량이 Proteobacterium 문에 속하였으며 다른 44속에 대부분 포함되었다. 대표적인 44속에 대해 분자생물학적 동정을 한 후 다양한 외부환경(온도, pH, 염, 무기질소염) 조건에 대한 이들의 생존성 범위를 조사한 결과, 넓은 온도(4℃~42℃)와 pH(4~10)범위에서 자랄 수 있는 탈질균 12 종을 최종 선발하였다. In an effort to isolate novel bacteria for the bioremediation of over-fertilized soils, we identified 135 denitrifying cells out of 3,471 oligotrophic bacteria pools (3.9%) using a denitrification medium supplemented with potassium nitrate as the sole nitrogen source. Soil samples were taken from ecologically wellconserved areas, including a mountain swamp around the demilitarized zone (Yongneup), two ecoparks (Upo and the Mujechi bog), and ten representative islands around the Korean peninsula (Jejudo, Daecheongdo, Socheongdo, Baekryeongdo, Ulrungdo, Dokdo, Geomundo, Hongdo, Huksando and Yeonpyeongdo). All of the 135 bacteria produced nitrogen gas from the denitrification medium, and were proved to be nitrate reductase positive by API-BioLog tests. Phylogenetic analysis using 16S rDNA sequences revealed that the 135 bacteria consisted of 44 different genera. Along with the most prominent, Proteobacteria (87.4%), we identified denitrifying bacteria from Firmicutes (9.4%), Actinobacteria (2.4%), and Bacteroidetes (0.8%). Physiological analyses of the 44 representative denitrifying bacteria, under various pH levels, growth temperatures and salt stresses, revealed 12 favorable denitrifying strains for soil bioremediation.

식물병원균에 대한 Bacillus vallismortis 1A 균주의 항진균 활성

이미혜(Mi-Hye Lee),김수진(Soo-Jin Kim),이창묵(Chang-Muk Lee),장재선(Jae-Seon Jang),장해중(Hai-Joong Chang),박민선(Min-Seon Park),구본성(Bon-Sung Koo),윤상홍(Sang-Hong Yoon),여윤수(Yun-Soo Yeo) 한국토양비료학회 2008 한국토양비료학회지 Vol.41 No.5

항진균성 활성을 가지는 저영양세균을 분리하기 위하여 토양시료는 경북 영양, 충북 제천, 충북 음성, 충북 괴산, 충남 논산 등지의 고추 밭에서 수집하였고 R2A배지를 이용하여 평판희석법으로 9,354여 균주의 저영양세균을 분리하였다. 분리된 저영양세균중 고추 역병에 강한 활성을 가지는 1A 균주를 선발 하였으 며 16S rDNA 와 표준균주(B. vallismortis, B. mojavensis)를 이용한 생리, 생화학적 실험으로 B. vallismortis로 최종동정 되었다. 1A균주는 Rhizpctonia, Magnaporthe 균 을 제 외 하 고 Phytophthora, Collectotrichum, Botrytis, Fusarium 균등에서 폭넓게 강한 활성을 나타내었다. 고추 유묘검정에서 대조구가 89%정도의 발병율을 보인 반면에 1A 처리구에서는 29%의 발병율을 나타내어 고추역병의 길항균으로써의 미생물제제 가능성이 있는 것으로 판단된다. In order to isolate novel oligotrophic bacteria exhibiting antifungal activities, soils were collected from pepper-cultivated fields of Yeongyang, Jecheon, Nonsan, Eumsong and Goesan area in Korea. From soils in pepper cultivated area, a total of 9,354 strains were isolated as oligotrophic bacteria by the R2A dilution method. Among 9,354 oligotrohic bacteria candidates, 1A strain was selected by screening against Phytophthora capsici causing phytophthora blight of hot pepper in the greenhouse and field. The strain was identified as Bacillus vallismortis based on its 16S rDNA sequence and key characteristics as compared with those of authentic cultures of B. vallismortis(KACC 12149) and B. mojavensis(KACC 12096). The strain showed broad spectrum of antibiotic activity in vitro test, as revealed in its strong inhibitory activity to the genera Phytophthora, Collectotrichum, Botrytis and Fusarium, but not to Rhizoctonia and Magnaporthe. In pot experiments, infection rate of hot pepper in the non-treated pots was about 89%, while it was only 29% in the pots treated with 1A strain. The result indicated B. vallismortis 1A is a potential biocontrol agent for phytophthora blight of hot pepper

벤지미다졸계 살균제 베노밀과 카벤다짐을 분해하는 Rhodococcus sp. 균주들의 분리 및 특성 분석

이재철(Jae-Cheol Lee),전유나(Yu-Na Jeon),정명화(Myoung-Hwa Jung),김유진(Yu-Jin Kim),박인철(InCheol Park),유재홍(Jaehong You),이창묵(Chang-Muk Lee),한병학(Byeong-Hak Han),안시현(Si-Hyun An),안재형(Jae-Hyung Ahn) 한국농약과학회 2020 농약과학회지 Vol.24 No.2

말굽버섯 자실체에서 분리한 항보체 활성 다당체의 화학적 분석

박정근 ( Jung Keun Park ),박계원 ( Kwe Won Park ),신광순 ( Kwang Soon Shin ),이창묵 ( Chang Muk Lee ),석순자 ( Soon Ja Seok ),김정봉 ( Jeong Bong Kim ),구본성 ( Bon Sung Koo ),한범수 ( Bum Soo Han ),윤상홍 ( Sang Hong Yoon ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2013 한국미생물·생명공학회지 Vol.41 No.2

말굽버섯의 열수추출물에서 얻은 조다당체인 MFKF-CP를 분리, 정제하기 위하여 DEAE-sepharose FF 및 ConcanavalinAsepharose 4B를 이용한 두 차례의 연속적인 chromatography 를 수행하였다. DEAE-sepharose FF에서는 3종류의 다당체 (MFKF-NP, MFKF-AP1, MFKF-AP2)를 분리하였는데, 그 중에서 MFKF-AP1이 50 μg/ml 농도에서 70% 이상의 높은 항보체 활성을 보였다. 이어서 ConcanavalinA-sepharose 4B 칼럼을 이용해 MFKF-AP1과 MFKF-AP2 다당체로부터 각각 MFKF-AP1α, β와 MFKF-AP2α, β 다당체를 분리하였다. 그 중에서 MFKF-AP1β가 20 μg/ml 농도에서 70% 이상의 가장 우수한 항보체 활성을 나타내었고 그 활성 순서는 MFKF-AP1β > MFKF-AP1α > MFKF-AP2α > MFKFAP2β> MFKF-NP > PKS이었다. 또한, Mg++과 Ca++ 이온이 제거되거나 첨가된 상태에서의 항보체 활성 실험을 통해 말굽버섯의 주 항보체 다당체인 MFKF-AP1β는 고전경로 (classical pathway)와 대체경로(alternative pathway) 모두를 경유하여 활성을 나타내고 있음을 확인하였다. Gas chromatography에 의한 구성당 조성 분석에서는 중성다당체인 MFKF-NP를 제외하고 나머지 4종의 다당체가 xylose를 약 70-99%의 높은 비율로 함유하고 있으며 특히 주요 항보체 다당체인 MFKF-AP1β는 xylose를 99% 함유하고 glucose (0.24%) 및 arabinose (0.66%)를 미량 함유하고 있는 매우 특이한 homoxylan이었다. 또한, MFKF-AP1β의 분자량을 HPLC로 분석한 결과, 약 12,000 정도인 것으로 추정되었다. The five anti-complementary polysaccharides (MFKF-NP, MFKF-AP1α, β, and MFKF-AP2α, β) were separated from hot water extracts of fruiting bodies of Fomes fomentarius by two subsequent column chromatography using DEAE-sepharose FF and Concanavalin A-sepharose 4B. The order of anti-complementary activity was MFKF-AP1β > MFKF-AP1α > MFKF-AP2α > MFKF-AP2β > MFKF-NP > Polysaccharide Krestine (PSK). Especially, MFKF-AP1β among those showed the most excellent anti-complementary activity (70% of ITCH50 value at 20 μg/ml). The monosaccharide composition analysis by gas chromatography indicates that MFKF-AP1α and β are a kind of homoxylan consisted mainly of xylose above 97%. Molecular weight of MFKF-AP1β, major anti-complementary polysaccharide, was estimated to be about 12,000 by high performance liquid chromatography (HPLC). After the incubation of the serum with MFKF-AP1β in the presence or absence of Mg++ and Ca++ ions, its anti-complementary activity was investigated. This result indicated that MFKF-AP1β seems to be activator both on the classical and the alternative pathway of complement activation.

생화학/분자생물학 : Bacillus Licheniformis로 부터 분리된 phospholipase D 유전자의 발현 및 생화학 특성

강한철 ( Han Chul Kang ),윤상홍 ( Sang Hong Yoon ),이창묵 ( Chang Muk Lee ),구본성 ( Bon Sung Koo ) 한국응용생명화학회(구 한국농화학회) 2011 Journal of Applied Biological Chemistry (J. Appl. Vol.54 No.2

Bacillus licheniformis로 부터 phospholipase D (PLD)로 추정되는 유전자를 PCR 기술을 이용하여 분리하여 pGEM-T easy 운반체에 cloning 하였다. 분리된 유전자는 His6가 붙은 pET-21 운반체를 이용하여 E. coli BL21 (DE3)에서 발현시켰다. 재조합된 PLD는 nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) resin을 갖는 column을 이용하여 affinity chromatography로 분리하였다. SDS-PAGE 분석 결과 PLD로 추정되는 단백질은 약 44 kDa의 주요 단일밴드를 나타내었다. 분리된 효소의 최적 활성도는 pH 7.0에서 나타났으며 이 조건에서 또한 효소가 제일 안정되었다. 효소활성에 미치는 최적 온도는 40-45oC의 온도에서 형성되어 비교적 높은 온도를 나타내었으며 비교적 넓은 범위의 온도에서 상당히 높은 효소 활성도를 나타내었다. 여러가지 detergent 중에서 Triton X-100을 0.6 mM까지 첨가할 경우 PLD의 효소활성도는 점진적으로 증가하여 대조구 대비 최대 181%의 효소 활성도를 나타내었다. A gene encoding a putative phospholipase D was isolated from Bacillus licheniformis and cloned into pGEM-T easy vector. The gene was expressed in E. coli BL21 (DE3) using a pET-21(a) vector containing His6 tag. Affinity purification of the recombinant phospholipase D with nickelnitrilotriacetic acid (Ni-NTA) resin resulted major one-band by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis. The purified enzyme showed a molecular weight of 44 kDa. The optimum activity of enzyme was around pH 7.0 and the enzyme was also the most stable around this condition. The optimum temperature was about 40-45oC and the enzyme still showed considerable activities at wide range of temperature. Among various detergents, Triton X-100 significantly increased the enzyme activity, resulting in 181% activity of control at 0.6 mM of the detergent. Calcium ion did not significantly affect the enzyme activity, suggesting that the enzyme might be classified into Ca2+-independent PLD.

Egr-1 유전자의 발현 유도물질을 생산하는 항균성 저 영양 세균의 분리 및 동정

윤상홍 ( Sang Hong Yoon ),김동관 ( Dong Gwan Kim ),이영한 ( Young Han Lee ),신순영 ( Soon Young Shin ),권순우 ( Soon Woo Kwon ),이창묵 ( Chang Muk Lee ),강한철 ( Han Chul Kang ),구본성 ( Bon Sung Koo ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2011 한국미생물·생명공학회지 Vol.39 No.2

전국 경작지 토양에서 분리한 저 영양 세균 3,800주를 대상으로 암 억제유전자의 작동과 관여하는 전사인자인 Egr-1의 promoter 활성화를 유도하는 세 균주(SSG5, SSG6, SSG10)가 Egr-1 reporter assay와 western blotting 분석으로 최종 선발되었다. 이들 선발 균주들은 16S rDNA와 상업용 생화학적 키트(API 20NE, API ZYM, ID 32GN) 분석에 의해 모두 Pseudomonas koreensis인 것으로 최종 동정되었다. 이들 균주들은 Egr-1 발현을 유도하는 물질뿐만 아니라 다양한 세균의(B. subtilis, S. aureus, and L. monocytogenes) 성장을 저해하는 항균물질도 생산하는 것을 확인하였다. The Egr-1 gene is known to be a transcription factor for activating the expression of many tumor-repressing genes. In this study, three strains activating the promoter of the Egr-1 gene were selected, through the use of Egr-1 luciferase reporter assay and western blotting, from amongst approximately 3,800 oligotrophic bacteria isolated from the cultivated soils of various regions within Korea. These strains were identified as Pseudomonas koreensis on the basis of phylogenetic tree analysis of their 16S ribosomal DNA sequences and biochemical characteristics analyses using a variety of commercial kits (API 20NE, ID 32GN, API ZYM kits). In addition, we discovered that these strains produced anti-bacterial activity against Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes.

Violacein을 생산하는 Massilia sp. EP15224 균주

윤상홍 ( Sang Hong Yoon ),백희진 ( Hee Jin Baek ),권순우 ( Soon Wu Kwon ),이창묵 ( Chang Muk Lee ),심준수 ( Joon Soo Sim ),한범수 ( Bum Soo Hahn ),구본성 ( Bon Sung Koo ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2014 한국미생물·생명공학회지 Vol.42 No.4

비올라세인은 항균, 항암, 항산화, 항말라리아, 항설사 활성과 같은 다양한 생리활성을 가지는 보라색소 물질로 알려져 있다. 본 연구에서는 한국의 산림토양에서 분리되었으며 보라색 색소를 생산하는 EP15224 균주를 선발하여 16S rRNA유전자의 염기서열을 분석하였다. 그 결과 Massilia sp. BS-1과 97%의 가장 높은상동성을 보였다. 또한 16S rRNA 유전자에 근거한 계통분류학적 분석에서 EP15224는 기존 보고된 비올라세인 생산 세균들과는 별개로 구분되는 Massilia속의 새로운 종임을 확인하였다. 이 균주가 생산하는 보라색소물질을 분리하여 LC/MS/MS로 분석한 결과, 분자량이 343.34인 비올라세인과 일치하였다. 또한 비올라세인의 생산효율을 높여주는 최적의 배지성분[glucose 2 g/l, (NH4)2SO4 1 g/l, Na2HPO4· 7H2O 2 g/l, KH2PO4 1 g/l, MgSO4· 7H2O0.1 g/l, L-tryptophan 0.24 g/l]과 배양조건[25oC에서 72시간배양, 250 rpm, 10% 접종량]을 조사하였으며 이 조건에서 액체배양 하였을 때 리터 당 280 mg의 비올라세인이 생산되었다. Violacein has received much attention due to its various important biological activities, including broad-spectrum antibacterial and antifungal activity, anti-malarial, anti-tumoral, anti-oxidant, and anti-diarrheal activities. EP15224 strain isolated from forest soils in Korea was found to be a new species belonged to the genus Massilia based on its 16S ribosomal DNA sequences. The 16S ribosomal DNA of strain EP15224 displayed 97% homology with Massilia sp. BS-1, the nearest violacein-producing bacterium. Strain EP15224 produced bluish-purple pigment well in a synthetic MM2 medium containing glucose, (NH4)2SO4, Na2HPO4·7H2O, KH2PO4, MgSO4·7H2O, and 1 mM L-tryptophan. The chemical analysis of the pigment by LC/MS/MS showed that it is violacein with molecular weight of 343.34. This is the second report on the production of violacein by a Massilia species. In this study, the optimal culture conditions for violacein production were established under which 280 mg/l crude violacein was produced : glucose 2 g/l, (NH4)2SO4 1 g/l, Na2HPO4·7H2O 2 g/l, KH2PO4 1 g/l, MgSO4·7H2O 0.1 g/l, L-tryptophan 0.24 g/l, 25 ml medium in a 250 ml flask, with an inoculumn size of 10% (v/v), 72 h of cultivation with 250 rpm at 25oC.

유전공학기술에 의한 해밀토니안 경로 찾기

김성환(Sung Whan Kim),김삼묘(Sam Myo Kim),이창묵(Chang Muk Lee),손우익(Uik Sohn) 한국정보과학회 1998 한국정보과학회 학술발표논문집 Vol.25 No.1A

본 논문은 Leonard Adleman의 Hamiltonian 경로 탐색을 위한 DNA 계산방법이 보다 다양한 문제에 효율적으로 적응할 수 있는 방안을 실험을 통하여 개발하는데 그 목적이 있다. 특히 이 논문은 합성해야 할 DNA 서열의 선택, 그래프의 특성 및 해밀토니안 경로의 다양성에 따라 새로운 실험 프로토콜을 개발하였다. 무작위로 만든 서열에서 선택한 서열을 합성하여 ligate 하고 증폭(PCR)하여 해를 구하는 최적 조건은 Adleman이 보고한 것과는 현저히 다름을 알 수 있었으며, 그래프가 많은 짧은 순환경로는, 우려했던 것과는 달리 실험에 장애가 되지 않았다. Adleman이 제시한 방법은 해밀토니안 경로의 존재 여부 만을 알려준다. 본 논문은 그래프에 경로가 하나 이상 있을 때 그 경로들을 개별적으로 선별해 낼 수 있는 방법을 실험을 통하여 보여준다.