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육각강에서 보고된 미토콘드리아 COI 염기서열과 이들을 이용한 분자 연구 논문 분석, 파트 I: 2000년~2009년
이원훈,박종선,김소라,김양수,이예림,김광호,이시혁,이용환,이승환,Lee, Wonhoon,Park, Jongsun,Akimoto, Shin-Ichi,Kim, Sora,Kim, Yang-Su,Lee, Yerim,Kim, Kwang-Ho,Lee, Si Hyeock,Lee, Yong-Hwan,Lee, Seunghwan Korean Society of Applied Entomology 2013 한국응용곤충학회지 Vol.52 No.4
Since 2000, a large number of molecular studies have been conducted in Hexapoda with generating large amount of mitochondrial sequences. In this study, to review mitochondrial COI sequences and their molecular studies reported in Hexapoda from 2000 to 2009, 488 molecular studies conducted based on 58,323 COI sequences were categorized according to 26 orders and the positions of COI sequences (5', 3', and entire regions). The numbers of molecular studies in which the three regions utilized varied largely among the 26 orders; however, seven orders showed preferred positions of COI sequences in the researches: Diptera and Orthoptera revealed the largest number of studies in the 5' region; while, Coleoptera, Phthiraptera, Odonata, Phasmatodea, and Psocoptera, showed the largest number of studies in the 3' region. From comparing 84 molecular studies published before 2000, we observed the possibilities that molecular studies in Coleoptera, Diptera, Phthiraptera, and Phasmatodea from 2000 to 2009 had been followed classical studies using the positions of COI sequences well-known until 1999. This study provides useful information to understand the overall trends in COI sequence usages as well as molecular studies conducted from 2000 to 2009 in Hexapoda. 2000년도 이후로 많은 분자 연구 논문들이 육각강에서 진행되었으며, 그 결과 방대한 양의 미토콘드리아 유전자 염기서열이 생산되었다. 본 연구에서는 2000년도부터 2009년까지 육각강에 보고된 COI 염기서열과 이들을 활용한 분자 연구 논문들을 분석하기 위하여, 58,323개의 COI 염기서열들을 바탕으로 보고된 488개의 분자 연구 논문들을 26개 목들과 사용된 COI 염기서열들의 5', 3', 중간 위치에 따라 재분류하였다. 세 지역의 COI 염기서열을 이용한 연구 논문의 수는 26개 목들에 따라 매우 다양하였다. 하지만, 7개 목들은 특정 지역의 COI 염기서열들이 선호되었음을 나타내었다. 예를 들어, 파리목과 메뚜기목에서는 5' 지역의 COI 염기서열을 사용하는 논문의 수가 가장 높았으며, 이에 반해 딱정벌레, 이목, 잠자리목, 더듬이벌레목, 대벌레목에서는 3' 지역의 COI 염기서열을 사용하는 논문의 수가 가장 높았다. 2000년 이전에 보고된 84개의 분자 연구 논문들과의 비교를 통해, 2000년부터 2009년까지 딱정벌레목, 파리목, 이목, 대벌레목에서는 1999년 이전에 각 목들에서 주로 사용되었던 COI 염기서열의 특정 지역과 같은 지역을 사용하는 경향성을 보여주었다. 본 연구는 육각강에서 2000년에서 2009년까지 보고되었던 분자 연구 논문 뿐만 아니라 이들 논문에서 사용된 COI 염기서열에 대한 전체적인 경향을 이해하는데 유용한 정보를 제공한다.
Chlorantraniliprole 저항성 초파리 계통 확립과 저항성 특성 구명
김아영,권덕호,정인홍,특안판,트란비느안,이시혁,고영호,Kim, A-Young,Kwon, Deok Ho,Jeong, In Hong,Thuc, Ahn Phan,Tran, Vi Ngan,Lee, Si Hyeock,Koh, Young Ho 한국응용곤충학회 2016 한국응용곤충학회지 Vol.55 No.4
Chlorantraniliprole은 곤충 근육의 $Ca^{2+}$ 농도를 조절하는 Ryanodine 수용기(RyR)에 작용 하는 diamide계통의 작물보호제이다. 최근에 보고된 chlorantraniliprole 저항성 배추좀나방 계통은 RyR에 돌연변이를 가지고 있다. 본 연구에서는 초파리를 모델 곤충으로 저농도와 고농도의 chlorantraniliprole로 도태된 두 종류의 저항성 계통을 확보하였다. 두 종류의 저항성 계통은 접촉독성과 섭식독성 평가법을 활용하여 저항성 지수를 산출하였다. 접촉 독성 평가에서 두 종류의 저항성 계통은 대조군과 비교하여 95% 신뢰구간에서 저항성 발달에 차이가 없었지만, 섭식 독성 평가의 경우에서는 고농도 저항성 계통과 저농도 저항성 계통에서 대조군 대비 각각 2.1배와 8.1배의 통계적으로 유의한 저항성 증가가 나타났다. 작용점 유전자인 RyR 발현량 비교 결과, 두 종류의 저항성 계통에서 RyR의 발현량이 유의하게 감소하였고, 주요 약제 관련 효소인 Acetylcholinesterase와 Glutathione-S-transferase 활성은 조직 특이적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 초파리에서 chlorantraniliprole에 대한 섭식독성 저항성의 발달에는 주요 해독 관련 효소의 과활성도 관여할 것 임을 보여주고 있다. Ryanodine receptors (RyRs) regulate the contractions of insect muscles by altering intracellular $Ca^{2+}$ concentration and are the targets of chlorantraniliprole. Recently, a chlorantraniliprole-resistant strain was reported in the diamondback moth Plutella xylostella by obtaining point mutations on the RyRs. In the present study, we established two resistant strains from Drosophila melanogaster, which were treated with low or high concentrations of chlorantraniliprole, and their resistance levels were determined on the basis of contact and ingestion toxicities. Compared with the control strain, the two resistant strains did not show any significant differences in contact toxicity. However, they showed significantly increased resistance ratios in ingestion toxicity than that by the control strain. The low and high concentration resistant strains exhibited 2.1- and 8.1-fold increased resistance ratios, respectively, compared with that by the control strain. Moreover, we found that the resistant strains had altered expression levels of RyRs and more enhanced Acetylcholinesterase and Glutathione-S-transferase activities than that by the non-selected strain. These results suggested that the resistance development of chlorantraniliprole in the two strains might be mediated by the activation of detoxification pathways in D. melanogaster.
소나무재선충[Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle]의 GaLectin에 대한 특이적인 단클론 항체 제작과 진단에의 활용
김아영,김영하,최보혜,트랑뉴겐,윤경재,이시혁,한혜림,고영호,Kim, A-Young,Kim, Young Ha,Choi, Bo-Hye,Nguyen, Trang,Yoon, Kyungjae Andrew,Lee, Si Hyeock,Han, Hye-Rim,Koh, Young Ho 한국응용곤충학회 2018 한국응용곤충학회지 Vol.57 No.1
소나무재선충(pine wood nematode, PWN) 감염 소나무를 현장에서 신속하게 진단을 할 수 있는 방법은 현재 없다. 본 연구에서는 PWN특이적인 항원으로 알려진 PWN-GaLectin을 baculovirus발현체계로 발현시켜서 총 1,464개의 fusion hybridoma 세포 주 라이브러리를 제작 하는 항원으로 이용하였다. 총 1,464개의 fusion hybridoma 세포 주 중, PWN-GaLectin에 대한 높은 반응을 보이는 62개의 fusion hybridoma 세포 주를 선별했다. 이들 중, 표준 PWN 감염소나무 PBS추출물과 PWN 단백질 추출물에 강한 반응을 보이는 세포 주 12개를 선별하여 단클론 항체(monoclonal antibody, Mab) 분비세포 주 확립을 위한 limited dilution을 실시하였다. Mab분비세포 주 확립을 위해서 표준 PWN 감염소나무 추출물에 대한 반응이 표준 정상 소나무 추출물 보다 높은 세포 주들을 선별했다. 그리고 추가로 PWN 단백질 추출물에 대해서 3종의 비 병원성 선충 단백질 추출물 보다 높은 반응을 보이는 세포 주들도 선별, 확립했다. 본 연구에서 확립된 Mab들을 우리는 현장과 실험실에서 사용할 수 있는 신속진단키트의 개발에 이용할 수 있을 것이다. Currently, there is no available tool that rapidly diagnoses pine wood nematode (PWN)-infected pine trees in the field. In this study, we synthesized and purified PWN Galectin, which might be an antigen specific to PWN, using the Baculovirus expression system. We used PWN Galectin as an antigen for generating 1,464 fusion hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies (Mabs). Among them, we selected 62 fusion hybridoma cell lines showing high reactivity to PWN Galectin. We further selected 12 fusion hybridoma cell lines showing high reactivity to the standard PWN-infected pine tree phosphate buffered saline (PBS) extract. Additionally, two fusion hybridoma cell lines showing no or extremely low reactivity were used as controls. The selected fusion hybridoma cell lines were subjected to limiting dilutions for selecting and establishing Mab-secreting cell lines showing higher reactivity to the standard PWN-infected pine tree extract than to the standard normal pine tree PBS extract. Moreover, the selected fusion hybridoma cell lines were further selected based on their higher reactivity to PWN protein extracts than to three non-pathogenic nematode protein extracts. The Mab-secreting cell lines established in this study could be used to develop rapid diagnostic tools that can be used in the field or in laboratories for detecting PWN-infected pine trees or PWN.
콜로라도감자벌레의 살충제저항성 돌연변이의 진단을 위한 유전형 분석기법
이시혁 서울대학교 농업개발연구소 2000 농업생명과학연구 Vol.4 No.-
Three DNA-based genotyping techniques, bi-directional PCR amplification of specific allele (bi-PASA), single stranded conformational polymorphism (SSCP) and minisequencing, have been developed and compared for the detection of the S291G (insensitive acetylcholinesterase) and L1014F (insensitive sodium channel) mutations associated with azinphosmethyl and permethrin resistance, respectively, in the Colorado potato beetle (CPB). Extraction of genomic DNA from individual neonates that were hatched from the previously collected egg masses was determined to be the most efficient and reliable means to obtain suitable templates in terms of convenience, economy, speed, and DNA quality. bi-PASA, employing two allele-specific primers, was determined to be the most efficient and rapid genotyping method for the simultaneous detection of both resistant/susceptible homozygous (SS, RR) and heterozygous (RS) allele. Its resolution, however, was strongly dependent on the quality of template genomic DNA. SSCP also allowed clear genotyping, including the detection of heterozygous alleles and was less dependent on template DNA quality but required a longer processing time. Minisequencing was amenable to a 96-well microtiter plate format for the processing of a large number of samples and allowed direct detection of resistant/susceptible homozygous alleles but was not as efficient as the PASA and SSCP in detecting heterozygous alleles. In considering the advantages and disadvantages of each technique, DNA-based genotyping is best employed in combinations, with the bi-PASA as the primary method and the SSCP and minisequencing as the secondary validating methods. The availability of such DNA-based genotyping techniques, using neonate genomic DNA as templates, will allow the precise monitoring of the resistant and susceptible allele frequencies, including those of heterozygote individuals, in field populations of CPB. These methods are rugged, rapid, cost-effective and capable of resolving SS, RR and RS individual.