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Bacillus stearothermophilus KY-126가 생산하는 Cyclodextrin glycosyltransferase의 정제 및 특성
강상모,유시형,Kang, Sang-Mo,Yoo, Si-Hyung 한국식품과학회 1994 한국식품과학회지 Vol.26 No.4
토양을 대상으로 하여 CGTase를 생산하는 균주를 분리, 선별하여 Bacillus stearothermophilus KY-126을 얻었다. CGTase의 정제는 ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration의 과정을 통해 분리 정제하여 단일 효소를 얻었으며, 분자량은 약 67,000이었다. 효소 반응의 최적 온도는 $65^{\circ}C$였으며, $55^{\circ}C$에서 30분간 열처리에도 비교적 열에 안정하였다. 최저 활성 pH는 5.5였고 pH5.5에서 10.5까지 비교적 안정하였다. $HgCl_{2}$에 의해 저해를 받았으며, 그 외의 금속 이온에는 저해를 받지 않았다. Soluble starch로부터 CD의 전환율은 43%이었으며, ${\alpha}-:,\;{\beta}-:,\;{\gamma}-$, CD의 생성 비율은 2.9 : 2.1 : 1이었다. A bacterial strain No. KY-126, which produced extracellular cyclodextrin glycosyltransferase(CGTase), was isolated from soil and identified as Bacillus stearothermophilus KY-126. The enzyme was purified by the treatments of ammonium sulfate precipitation, DEAF-Sephadex, Sephadex G-100 column chromatography. The optimal pH and temperature for the enzyme activity were pH 5.5 and $65^{\circ}C$, respectively. And the enzyme was stable at pH values from 6.0 to 11.0 at $55^{\circ}C$ for 30 min and stable up to $60^{\circ}C$ for 30 min.. The enzyme was inhibited by $HgCl_{2}$. The molecular weight of the enzyme was estimated to be 67,000 by using SDS-PAGE. The maximum conversion from starch to cyclodextrin (CD) by CGTase was 43% and obtained at 6 hr reaction and the ratio of ${\alpha}-,\;{\beta}-,\;{\gamma}-$, CD production at this time was 2.9 : 2.1 : 1.0.
혈장분획제제 제조공정에서 크로마토그래피 세척 검증을 위한 모델바이러스로서의 Porcine Parvovirus 정량
길태건,김원중,이동혁,강용,성학모,유시형,박순희,김인섭,Kil Tae Gun,Kim Won Jung,Lee Dong Hyuk,Kang Yong,Sung Hark Mo,Yoo Si Hyung,Park Sue-Nie,Kim In Seop 한국미생물학회 2005 미생물학회지 Vol.41 No.3
혈장분획제제 중 혈액응공인자제제와 일부 면역글로불린제제는 혈장에 존재하는 다양한 단백질로부터 유효한 단백성분만을 선택적으로 분리 정제하기 위해 크로마토그래피 방법을 사용하여 생산된다. 효율적인 세척(cleaning) 공정이 이루어지지 않는다면 크로마토그래피는 다양한 종류의 불순물뿐만 아니라 혈액 중 내재 또는 오염 가능성이 있는 위해인자가 오염될 가능성이 있다. 본 연구에서는 혈장분획제제 제조공정에 사용되는 크로마토그래피의 세척 공정에서 혈장유래 바이러스의 제거 및 불활화 공정의 검토 강화로 혈장분획제제의 안전성을 확보하기 위해 크로마토그래피 세척 검증 시스템을 구축하고자 하였다. 크로마토그래피 세척 공정 중 바이러스 제거 검증을 위해 혈장유래 바이러스 중 물리${\cdot}$화학적 처리에 가장 큰 저항성을 갖는 human parvovirus B19의 모델 바이러스의 porcine parvovirus(PPV)를 대상으로 real-time PCR 정량법을 확립하였다. PPV에 특이적인 primer를 선별하였으며 형광염료 SYBR Green I을 사용하여 PPV DNA를 정량하였다. 세포배양법에 의한 감염 역가와 비교한 결과 PCR 민감도는 1.5 $TCID_{50}/ml$이었다. 확립된 검증법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 실험법의 특이성(specificity), 재현성(reproducibility) 등을 검증하였다. 구축된 검증시스템을 thrombin 분리${\cdot}$정제를 위한 SP-Sepharose 양이온 크로마토그래피 공정과 factor VIII 분리${\cdot}$정제를 위한 Q-Sepharose 음이온 크로마토그래피 공정에 적용하여 크로마토그래피 세척 검증을 실시하고, 세척 검증 시스템의 적합성을 확인하였다. Chromatography has now been used successfully to provide the requisite purity for human plasma-derived biop-harmaceuticals such as coagulation factors and immunoglobulins. Recently, increasing attention has been focused on establishing efficient cleaning procedures to prevent potential contamination by microorganisms as well as carry-over contamination from batch to batch. The purpose of present study was to develop a cleaning validation system for the assurance of virus removal and/or inactivation during chromatography process. In order to establish an assay system for the validation of virus clearance during chromatography cleaning process, a quantitative real-time PCR method for porcine parvovirus(PPV) was developed, since PPV, a model virus for human parvovirus B19, has a high resistance to a range of physico-chemical treatment. Specific primers for amplification of PPV DNA was selected, and PPV DNA was quantified by use of SYBR Green I. The sensitivity of the assay was calculated to be 1.5 $TCID_{50}/ml$. The established real-time PCR assay was successfully applied to the validation of PPV removal and cleaning during SP-Sepharose cation chromatography for thrombin purification and Q-Sepharose anion chromatography for factor VIII purification. The comparative results obtained by real-time PCR assay and infectivity titrations suggested that the real-time PCR assay could be a useful method for chromatography cleaning validation and that it could have an additive effect on the interpretation and evaluation of virus clearance during the virus removal process.
Establishment of the National Standard for Prekallikrein Activator with a Collaborative Study
In Soo Shin(신인수),Jae Yeon Cho(조재연),Soon Nam Kim(김순남),Choong Man Hong(홍충만),Ki Hong Lee(이기홍),Ho Jung Oh(오호정),Si Hyung Yoo(유시형),Jae Hyun Lim(임재현),Seung Eun Choi(최승은),Colin Longstaff,Hong Ki Min(민홍기),Sue 한국생물공학회 2004 한국생물공학회 학술대회 Vol.2004 No.4