alpha 1,3-galactosyltransferase 기능 제거 및 MCP 발현 형질전환 돼지의 대동맥 혈관내피세포에 CD37/CD73 발현 세포주 개발

노진구,변승준,양현,옥선아,우제석,이휘철,황인설,김지윤,박상현,이주영,오건봉,No, Jin-Gu,Byun, Sung-June,Yang, Hyeon,Ock, Sun A,Woo, Jae-Seok,Lee, Hwi-Cheul,Hwang, In-sul,Kim, Ji-Youn,Park, Sang Hyoun,Lee, Joo Young,Oh, Keon Bong 한국수정란이식학회 2018 한국동물생명공학회지 Vol.33 No.3

Acute vascular rejection has been known as a main barrier occurring in a xenograted tissue of alpha 1,3-galactosyltransferase knock-out (GalT KO) pig into a non-human primate (NHP). Adenosine which is a final metabolite following sequential hydrolysis of nucleotide by ecto-nucleotidases such as CD39 and CD73, act as a regulator of coagulation, and inflammation. Thus xenotransplantation of CD39 and CD73 expressing pig under the GalT KO background could lead to enhanced survival of recipient NHP. We constructed a human CD39 and CD73 expression cassette designed for endothelial cell-specific expression using porcine Icam2 promoter (pIcam2-hCD39/hCD73). We performed isolation of endothelial cells (pAEC) from aorta of 4 week-old GalT KO and membrane cofactor protein expressing pig ($GalT^{-MCP/-MCP}$). We were able to verify that isolated cells were endothelial-like cells using immunofluorescence staining analysis with von Willebrand factor antibody, which is well known as an endothelial maker, and tubal formation assay. To find optimal condition for efficient transfection into pAEC, we performed transfection with GFP expression vector using four programs of nucleofection, M-003, U-023, W-023 and Y-022. We were able find that the program W-023 was optimal for pAEC with regard to viability and transfection efficiency by flow cytometry and fluorescent microscopy analyses. Finally, we were able to obtain $GalT^{-MCP/-MCP}/CD39/CD73$ pAEC expressing CD39 and CD73 at levels of 33.3% and 26.8%, respectively. We suggested that pACE isolated from $GalT^{-MCP/-MCP}$ pig might be provided as a basic resource to understand biochemical and molecular mechanisms of the rejections and as an alternative donor cells to generate $GalT^{-MCP/-MCP}/CD39/CD73$ pig expressing CD39 and CD73 at endothelial cells.

배양세포에서 Semi-quantitative RT-PCR에 의한 조류인플루엔자 H9N2의 전사활성 분석 최적 시기 결정 및 전사체 분석

나기윤,이영민,변승준,전익수,박종현,조인수,주이석,이윤정,권준헌,구용범,Na, Gi-Youn,Lee, Young-Min,Byun, Sung-June,Jeon, Ik-Soo,Park, Jong-Hyeon,Cho, In-Soo,Joo, Yi-Seok,Lee, Yun-Jung,Kwon, Jun-Hun,Koo, Yong-Bum 한국미생물학회 2009 미생물학회지 Vol.45 No.3

The transcription of mRNA of avian influenza virus is regulated temporally during infection. Therefore, the measurement of transcript level in host cells should be performed before viral release from host cells because errors can occur in the analysis of the transcript levels if the viruses released from the infected cells re-infect cells. In this study, the timing of viral release was determined by measuring the level of viral RNA from viruses released from H9N2-infected chicken fibroblast cell line UMNSAH/DF-1 by semi-quantitative RT-PCR. The viral genomic RNA was isolated together with mouse total RNA which was added to the collected medium as carrier to monitor the viral RNA recovery and to use its GAPDH as an internal control for normalizing reverse transcription reaction as well as PCR reaction. It was found that viral release of H9N2 in the chicken fibroblast cell line UMNSAH/DF-1 took between 16 and 20 h after infection. We measured all 8 viral mRNA levels. Of the 8 transcripts, 7 species of viral mRNAs (each encoding HA, NA, PB1, PB2, NP, M, NS, respectively) except PA mRNA showed robust amplification, indicating these mRNA can be used as targets for amplification to measure transcript levels. These results altogether suggest that the method in this study can be used for screening antiviral materials against viral RNA polymerase as a therapeutic target. 조류인플루엔자 바이러스 mRNA의 전사는 감염 동안에 시간적으로 조절되어진다. 감염 후 세포 내에서 증식된 바이러스가 방출되어 세포를 다시 감염하게 되면 전사 수준 분석에 오차가 발생할 수 있으므로 바이러스가 방출 되기 이전에 전사 수준의 측정이 이루어져야 한다. 본 연구에서는 조류인플루엔자 H9N2를 감염시킨 닭의 섬유아세포주 UMNSAH/DF-1에서 바이러스 감염 후 증식된 바이러스의 방출까지의 시간을 측정하기 위하여 배양액 중에 방출되는 바이러스 RNA 게놈 수준을 semi-quantitative RT-PCR에 의해 측정하였다. 배양액 중의 바이러스 RNA 게놈의 분리 과정에서 발생할 수 있는 RNA 회수율의 오차를 보정하기 위해 mouse의 전체 RNA를 배양액 시료에 넣어서 바이러스 RNA 분리에 carrier로 사용하고 그 속에 포함된 mouse의 GAPDH를 RNA를 역전사 반응 및 PCR의 내부 대조 RNA로 사용하였다. 그 결과 감염 후 방출까지 16~20시간이 소요됨을 알 수 있었다. 따라서 감염 후 12시간 후에 세포 내에서 합성된 8종의 전사체의 수준을 측정하였다. 8종의 mRNA 중 PA를 제외한 7종의 mRNA (HA, NA, PB1, PB2, NP, M, NS를 암호화하는 mRNA)는 뚜렷한 증폭 band를 보였으며, 이것은 이들이 전사활성 측정에 사용될 수 있는 것으로 나타났다. 이상과 같은 전사수준의 측정 방법은 조류인플루엔자 바이러스의 RNA polymerase를 표적으로 한 항바이러스제의 검색에 사용할 수 있을 것으로 보인다.

돼지 $\beta$-Casein 유전자의 3' 말단 부위의 cis-Acting Element가 유선 상피 세포내의 발현에 미치는 영향

이휘철,김병주,변승준,이승훈,김민지,정희경,이현기,조수진,장원경,박진기,이풍연,Lee, Hwi-Cheul,Kim, Byoung-Ju,Byun, Sung-June,Lee, Seung-Hoon,Kim, Min-Ji,Chung, Hee Kyoung,Lee, Hyun-Gi,Jo, Su-Jin,Chang, Won-Kyong,Park, Jin-Ki,Lee, Poong 한국동물번식학회 2008 Reproductive & developmental biology Vol.32 No.3

Tissue-specific and temporal regulation of milk protein gene expression is advantageous when creating transgenic animal that produces foreign protein into milk. Gene expression, i.e. protein production, is regulated not only by promoter strength but also mRNA stability. Especially, poly A tail length by polyadenylation affects in vivo and in vitro mRNA stability and translation efficiency of the target gene. In the present study, nucleotide sequence of 3'-UTR was analyzed to evaluate the effects of mRNA stability on the target gene expression. Based on the poly A signal of 3' -untranslated region (UTR), nucleotide sequences of putative cytoplasmic polyadenylation elements (CPEs) and downstream elements (DSEs: U-rich, G-rich, GU-rich) were analyzed and used to construct 15 luciferase reporter vectors. Each vector was transfected to HC11 and porcine mammary gland cell (PMGC) and measured for dual luciferase expression levels after 48 hours of incubation. Luciferase expression was significantly higher in construct #6 (with CPE 2, 3 and DSE 1 of exon 9) and #11 (with CPE 2, 3 and DSE 1, 2 and 3 of exon 9) than construct #1 in the PMGC. These results suggest that expression of target genes in PMGC may be effectively expressed by using the construct #6 and #11 on production of transgenic pig. 형질 전환 동물 생산에는 조직 및 시기 특이적 발현 조절이 가능하다는 장점 때문에 유즙 내로 외부 유전자를 발현시키는 시스템이 널리 이용되고 있다. 유전자 발현 즉, 단백질 생산은 프로모터의 강도뿐만 아니라 mRNA의 안정성에 의해서도 조절된다. 특히, polyadenylation에 의한 poly A의 길이는 in vivo와 올 in vitro에서 mRNA 안정성 및 목적 유전자의 번역효율에 영향을 준다. 본 연구에서는 이러한 mRNA 안정성이 목적 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 3'-UTR 염기 서열을 분석하였다. 이 3'-untranslated region(UTR) 내의 poly A signal을 기준으로 putative cytoplasmic polyadenylation element(CPE) 부위와 downstream elements(DSE: U-rich, G-rich, GU-rich)의 염기 서열을 분석하고, 각각의 element를 기준으로 15 종의 luciferase reporter vector를 제작하여, 생쥐 유선 세포주(HC11)와 돼지 유선 세포주(PMGC)에 각각 transfection시킨 후 48시간 동안 배양하고 luciferase 발현량을 분석하였다. PMGC의 경우, luciferase의 발현은 exon 9의 CPE 2,3 및 DSE 1을 포함한 #6 construct에서 유의적으로 높은 발현량을 보였으며, exon 9의 CPE 2, 3과 DSE를 모두 포함하고 있는 #11 construct에서도 유의적으로 높은 발현량을 보였다. 이러한 결과는 형질 전환 돼지 생산에 있어 #6 및 11 construct의 사용은 목적의 유전자를 효과적으로 발현시키는데 기여할 것으로 사료된다.

이종이식에 활용할 α1,3-galactosyltransferase 비활성화 및 Membrane Cofactor Protein 발현 동형접합 형질전환 돼지 개발

이건섭,박상현,이해선,지수정,이주영,변승준,황성수,김경운,옥선아,오건봉,Lee, Gunsup,Park, Sang Hyoun,Lee, Haesun,Ji, Soo-Jeong,Lee, Joo Yung,Byun, Sung-June,Hwang, Seongsoo,Kim, Kyung Woon,Ock, Sun A,Oh, Keon Bong 한국수정란이식학회 2017 한국동물생명공학회지 Vol.32 No.3

Transplantation is considered to be a very useful approach to improve human welfare and to prolong life-span. Heterologous organ transplantation using pig organs which are similar to human beings and easy to make mass-production has known as one of the alternatives. To ensure potential usage of the pig organ for transplantation application, it is essentially required to generate transgenic pig modifying immuno-related genes. Previously, we reported production of heterozygous ${\alpha}1,3$-galactosyltransferase (GalT) knock-out and human membrane cofactor protein (MCP) expressing pig ($GalT^{-MCP/+}$), which is enforced for suppression of hyperacute and acute immunological rejection. In this study, we reported generation of homozygous pig ($GalT^{-MCP/-MCP}$) by crossbreeding $GalT^{-MCP/+}$ pigs. Two female founders gave birth to six of $GalT^{-MCP/-MCP}$, and seven $GalT^{-MCP/+}$ pigs. We performed quantitative real-time PCR, western blot, and flow cytometry analyses to confirm GalT and MCP expression. We showed that fibroblasts of the $GalT^{-MCP/-MCP}$ pig do not express GalT and its product Gal antigen, while efficiently express MCP. We also showed no expression of GalT, otherwise expression of MCP at heart, kidney, liver and pancreas of transgenic pig. Taken together, we suggest that the $GalT^{-MCP/-MCP}$ pig is a useful candidate to apply xenotransplantation study.

Avian Influenza H9N2 Virus의 HA와 NA 단백질 발현, 정제 및 항혈청 생산

이현지,송병학,김정민,윤상임,김진경,강영식,구용범,전익수,변승준,이윤정,권준헌,박종현,주이석,이영민,Lee, Hyun-Ji,Song, Byung-Hak,Kim, Jeong-Min,Yun, Sang-Im,Kim, Jin-Kyoung,Kang, Young-Sik,Koo, Yong-Bum,Jeon, Ik-Soo,Byun, Sung-June,Lee, Youn-Je 한국미생물학회 2008 미생물학회지 Vol.44 No.3

조류 독감바이러스(avian influenza virus, AIV)는 사람에게서 발생하는 인플루엔자 대유행에 중요한 역할을 한다. 특히 최근 AIV H9N2형에 의한 가금류 감염이 빈번히 나타나고 있어 인체 감염이 상당히 우려되는 실정이다. 본 연구에서는 최종적으로 AIV의 HA와 NA 단백질에 특이적으로 반응하는 항혈청을 생산하고자 하였다. 먼저 감염된 닭에서 분리된 AIV H9N2 한국분리주 A/Ck/Kr/MS96/96의 게놈RNA로부터 RT-PCR 방법으로 HA와 NA 단백질 N-말단부위에 해당하는 염기서열을 증폭하였다. 이렇게 증폭된 DNA단편은 E. coli 발현벡터 pGEX4T-1에 삽입한 후, BL21 세포에서 각각의 GST fusion protein (GST-HAln와 GST-NAn) 형태로 발현하였다. GST-HAln와 GST-NAn은 모두 glutathione sepharose column을 사용하여 분리 및 정제하였으며, 정제된 단배질을 항원으로 사용하여 토끼 항혈청을 생산하였다. 생산된 항혈청의 항원특이성은 AIV H9N2 한국분리주 A/Ck/Kr/MS96/96로 감염된 MDCK 세포의 cell extract를 사용하여 immunoblotting을 수행함으로써 확인하였다. 본 실험결과AIV H9N2의 HA와 NA단백질 N-말단부위에 해당하는 재조합GST fusion protein과, 이들 각각의 단백질에 특이적으로 반응하는 항혈청은 앞으로AIV 감염의 진단 뿐만 아니라, AIV에 대한 기초연구에 중요한 재료로 사용될 것으로 기대한다. Avian influenza virus (AIV) is recognized as key to the emergence of pandemic influenza for humans; there are growing concerns that AIV H9N2 may become more efficient to transmit to humans in the near future, since the infection of poultry with AIV H9N2 has been common in recent years. In this study, we aimed to produce antisera recognizing the HA and NA proteins of AIV H9N2. Initially, coding sequences corresponding to the N-terminal regions of the HA and NA proteins of the Korean AIV H9N2 (A/Ck/Kr/MS96/96) isolated from a domestic chicken were amplified from the genomic RNA. Following cloning of the amplified cDNA fragments into pGEX4T-1 vector, two GST-fusion proteins (GST-HAln and GST-NAn) were expressed in E. coli BL21 and purified with glutathione sepharose columns; the recombinant GST-HAln and GST-NAn proteins were both used as immunogens in rabbits. The antigenicity of the rabbit antisera was analyzed by immunoblotting of the cell lysates prepared from AIV H9N2-infected MDCK cells. Overall, the recombinant HAln and NAn proteins fused to the C-terminus of GST and the rabbit antisera raised against the corresponding recombinant proteins would provide a valuable reagent for AIV diagnosis and basic research.

CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 돼지 수정란에서의 cd163 발현 효율 분석

박미령(Mi-Ryung Park),이민국(Min Gook Lee),이보람(Bo Ram Lee),옥선아(Sun A Ock),변승준(Sung June Byun) 한국산학기술학회 2023 한국산학기술학회논문지 Vol.24 No.4

유전자 편집 돼지는 농업과 의료 분야에서 제공될 수 있어 폭넓게 각광 받고 있다. 최근 CRISPR/Cas9 시스템이 적용됨에 따라 genome editing이 효율적으로 향상되었다. 돼지 수정란 내 CRISPR/Cas9을 세포질내 미세주입으로 site specific mutations을 가능할 수 있게 하였다. 본 연구에서는 돼지 수정란 내 cd163 gRNA와 CRISPR/Cas9 components를 이용하여 도입한 후 그 효율성을 비교 분석하였다. CRISPR/Cas9 protein과 cd163 gRNA를 수정란 내 주입하여 발달율을 비교 분석한 결과 대조구 (90.6%)와 미세주입 그룹 (78.9% and 85.2%)에서 유의적 차이는 인정되지 않았다. 또한, 배반포 발달율을 비교 분석 한 결과 CRISPR/Cas9 protein과 cd163 gRNA 주입 그룹 (19.9% and 19.6%)로 대조구와 (21.5%) 유사하게 나타났다. 각각의 배반포를 이용하여 cd163 유전자의 targeted modification을 분석하였다. 그 결과 cd163(10+134) gRNA를 주입한 그룹의 경우(22.7%) cd163(10) 주입한 그룹보다(12.9%) 유의적으로 높은 효율을 나타내었다. 유전자 변형은 4bp deletion 일어난 것부터 72bp insertions 패턴까지 다양한 패턴으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 CRISPR/Cas9 system을 돼지 수정란 내 미세주입 함으로써 유전자 편집 돼지 생산에 응용할 수 있을 것으로 사료된다. Gene editing (GE) in pig production can have a wide impact by increasing the availability of gene-edited pigs for agriculture and biomedicine. Recent applications of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system hold promise for improving the efficacy of gene editing. The cytoplasmic microinjection of the CRISPR/Cas9 system enables the induction of site-specific mutations in porcine zygotes. In this study, we examined the efficiency of the CRISPR/Cas9 protein and cluster of differentiation 163 (cd163) guide RNA (gRNA) components for introduction into zygotes by cytoplasmic microinjection. The cleavage rates of the CRISPR/Cas9 protein and cd163 gRNA injected groups (78.9% and 85.2%) were statistically similar to that of the control group (90.6%). Moreover, the blastocyst formation rates of the CRISPR/Cas9 protein and cd163 gRNA injected groups (19.9% and 19.6%) were also statistically similar to that of the control group (21.5%). When individual blastocysts were genotyped, we observed targeted modification of the genes in the subsequent blastocysts. In the samples of 10 ng/ul, each of the CRISPR/Cas9 protein and the cd163 (10+134) gRNA injected group (22.7%) was significantly higher (p<0.05) than that in the 10 ng/ul samples each of CRISPR/Cas9 protein and cd163(10) gRNA injected group (12.9%). Various types of indel mutations, including 4 bp deletion to 72 bp insertions, were detected in the mutant blastocysts. These results suggest that the CRISPR/Cas9 technology can be applied to produce gene-edited pigs by direct zygote injection.

Identification of the Pig β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 1 (pB3GNT1) that is Involved in Poly-N-acetyllactosamine (poly-LacNAc) Synthesis

Ji-Youn Kim(김지윤),Hwan-Jin Hwang(황환진),Hak-Jae Chung(정학재),Shinichi Hochi(신이치호치),Mi-Ryung Park(박미령),Sung June Byun(변승준),Keon Bong Oh(오건봉),Hyeon-Yang(양 현),Kyung-Woon Kim(김경운) 한국생명과학회 2018 생명과학회지 Vol.28 No.4

당 단백질에 붙어 있는 당사슬 구조는 형질전환 돼지 유즙으로 분비되는 의약용 단백질의 생물학적 활성, 안정성 그리고 안전성에 영향을 줄 수 있다. 형질전환 동물을 이용한 치료용 당 단백질 생산은 유선 세포에서 이루어지는 당사슬 부가능력에 의해 제한되며, 균일한 당사슬 형태를 가지는 당 단백질 생산은 도전 과제로 남아있다. β-1,3-N-acetylglucosaminylatransferase1 (B3GNT1) 유전자는 N-아세틸글루코사민에 갈락토오스 잔기를 부착시키는 단백질 당화기작에 중요한 효소이지만, 돼지 당 전이효소에 대한 정보는 매우 제한적이다. 따라서, 돼지 B3GNT1 (pB3GNT1) 유전자를 클로닝하고 N-아세틸글루코사민에 갈락토오스 잔기를 부착시키는 기능적 특성을 조사하였다. 몇가지 다른 프라이머를 사용하여 전체 전사영역(ORF)을 함유하는 부분적인 pB3GNT1 mRNA 염기서열을 간 조직으로부터 분리하였다. 클로닝 된 pB3GNT1의 ORF는 1,248개의 뉴클레오티드를 가지며, 415개 아미노산 잔기로 구성되어 있었다. pB3GNT1 유전자의 장기별 발현특성은 성돈 및 자돈의 여러 기관에서 분석하였다. pB3GNT1 mRNA 발현 수준은 심장, 소장 보다는 근육에서 높았지만 폐에서는 낮았다. pB3GNT1의 기능적 특성 분석을 위해 돼지 신장 세포주(PK-15)에서 pB3GNT1 유전자의 안정적인 발현을 확립하였다. 그 결과, PK-15 세포에서 pB3GNT1 발현에 의한 당화 패턴은 총 시알산 증가에는 영향을 미치지 않지만, poly-N-아세틸글루코사민은 증가하는 것으로 나타났다. 본 연구는 생물반응기로 형질전환 돼지를 이용할 때 희망하는 당사슬을 부가하여 치료 가능성을 높이며 개선된 활성을 나타내는 당단백질 생산에 도움이 될 것이다. The structure of glycan residues attached to glycoproteins can influence the biological activity, stability, and safety of pharmaceutical proteins delivered from transgenic pig milk. The production of therapeutic glycoprotein in transgenic livestock animals is limited, as the glycosylation of mammary gland cells and the production of glycoproteins with the desired homogeneous glycoform remain a challenge. The β-1,3-N-acetylglucosaminylatransferase1 (B3GNT1) gene is an important enzyme that attaches N-acetylglucosamine (GlcNAc) to galactose (Gal) residues for protein glycosylation; however, there is limited information about pig glycosyltransferases. Therefore, we cloned the pig B3GNT1 (pB3GNT1) and investigated its functional properties that could attach N-acetylglucosamine to galactose residue. Using several different primers, a partial pB3GNT1 mRNA sequence containing the full open reading frame (ORF) was isolated from liver tissue. The ORF of pB3GNT1 contained 1,248 nucleotides and encoded 415 amino acid residues. Organ-dependent expression of the pB3GNT1 gene was confirmed in various organs from adult and juvenile pigs. The pB3GNT1 mRNA expression level was high in the muscles of the heart and small intestine but was lower in the lungs. For functional characterization of pB3GNT1, we established a stable expression of the pB3GNT1 gene in the porcine kidney cell line (PK-15). As a result, it was suggested that the glycosylation pattern of pB3GNT1 expression in PK-15 cells did not affect the total sialic acid level but increased the poly N-acetyllactosamine level. The results of this study can be used to produce glycoproteins with improved properties and therapeutic potential for the generation of desired glycosylation using transgenic pigs as bioreactors.

피부이식동물 생산을 위한 인체 cytokine발현이 면역체계에 미치는 영향성에 관한 연구

김명옥(Myoung-Ok Kim),이정웅(Jeong-Woong Lee),이은주(Eun-Jun Lee),황하영(Ha-Young Hwang),변승준(Sung-June Byun),김경은(Kyung-Eun Kim),박영일(Young-Yil Bahk),김태윤(Tae-Yoon Kim),류재웅(Zae-Young Ryoo) 한국실험동물학회 2000 Laboratory Animal Research Vol.16 No.2

HPV-18 URR E6/E7 유전자를 발현하는 형질전환생쥐의 생산

김명옥(Myoung-Ok Kim),이정웅(Jeong-Woong Lee),이은주(Eun-Ju Lee),황하영(Ha-Young Hwang),변승준(Sung-June Byun),박영일(Young-Yil Bhak),김경은(Kyung-Eun Kim),김태윤(Tae-Yoon Kim),류재웅(Zae-Young Ryoo) 한국실험동물학회 2000 Laboratory Animal Research Vol.16 No.2

돼지 유래의 β-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase A (MGAT4A) 유전자의 동정 및 기능 분석

김지윤(Ji-Youn Kim),황환진(Hwan-Jin Hwang),정학재(Hak-Jae Chung),박미령(Mi-Ryung Park),변승준(Sung June Byun),김경운(Kyung-Woon Kim) 한국생명과학회 2016 생명과학회지 Vol.26 No.3

인체치료용 당단백질은 바이오의약품에 있어서 중요한 요소이며 특히, 단백질 말단에 결합되어있는 시알산은 의약품의 체내 활성이나 안정성에 큰 영향을 미친다. 최근 돼지유즙은 바이오의약품을 생산하기 위한 생체반응기로써 주목받고 있다. β-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase A (MGAT4A)는 재조합단백질이 가지는 시알산 함량을 늘리기 위한 필수 효소 중 하나이다. 그러나 돼지 MGAT4A는 아직도 그 서열이나 기능이 불분명하다. 따라서 이번 연구에서는 돼지 MGAT4A의 서열 동정 및 기능분석을 하였다. 돼지 MGAT4A는 535개의 아미노산을 코딩하는 1,638개의 염기서열로 이루어져 있으며, 일반적인 당전이효소들의 특징인 type II membrane topology의 특성을 가지고 있다. Real-time PCR분석법을 통하여, 지금까지 알려진 것과는 조금 다르게 MGAT4A 유전자가 간이나 유선에서 많은 발현을 보였으나 소장이나 위, 방광에서는 그 발현량이 적다는 것도 확인하였다. 또한, 효소의 기능 분석을 위하여 PK-15 세포주에서 MGAT4A효소의 과발현을 유도하였다. 과발현이 확인된 세포주로 렉틴을 이용한 면역형광염색법과 ELISA방법으로 MGAT4A효소의 과발현이 β-1,4-N-acetylglucosamine의 함량을 증가시켰음을 확인하였다. 또한 기질반응을 통해 bi-antennary structure에 대한 반응성도 확인하였으며, MGAT4A의 과발현이 유도된 세포에서 약 3배 이상의 높은 기질 반응성을 보였다. 이러한 연구는 생체반응기로써 돼지를 이용하는데 있어서 중요한 기반이 될 것이라고 생각한다. Glycan modification is important in pharmaceutical industry. Especially, sialic acid affects the bioactivity and stability of medicine. Milk of pig has been used as bioreactor to produce various pharmaceutical proteins. Therefore, it is necessary to modify the glycan chain in pig mammary grand. β-1,4-N-Acetylglucosaminyltransferase A (pMGAT4A) is one of the essential enzymes for increase of sialic acid content, but pig MGAT4A is unclear. In this study, the pMGAT4A was identified and characterized. The pMGAT4A has 1638 nucleotides encoding 535 amino acids and type II membrane topology, which is one of the common features in many glycosyltransferases. The gene was strongly expressed in liver and mammary gland, whereas was weakly expressed in small intestine, stomach and bladder. For functional test, HA-tagged MGAT4A was over-expressed in porcine kidney (PK-15) cell line. Forced expression of pMGAT4A gene was identified by qPCR, and we identified that pMGAT4A is located in Golgi complex by co- staining with HA antibody and BODIPY TR ceramide. In addition, we identified the increase of mannose-β-1,4-N-acetylglucosamine structure by ELISA and immunofluorescence using Datura stramonium agglutinin (DSA), which recognizes mannose-β-1,4-Nacetylglucosamine. Through the specific activity analysis, we showed that pMGAT4A modified bi-antennary to tri-antennary. This event affects sialic acid content. Therefore, we thought that over-expression of pMGAT4A will be necessary in pig mammary grand for improved medicine.