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Serratia marcescens에서 cAMP receptor protein(CRP) 유전자의 클로닝 해석
유주순,김혜선,문종환,정수열,최용락,Yoo, Ju-soon,Kim, Hae-Sun,Moon, Jong-Hwan,Chung, Soo-Yeol,Choi, Yong-Lark 한국생명과학회 1998 생명과학회지 Vol.8 No.3
전사조절인자로서 잘 알려져 있는 cAMP receptor protein(CRP)은 cAMP와 DNA에 결합하는 특별한 활성을 가지고 있으며, cAMP-CRP complex를 형성하여 수많은 유전자의 발현조절에 관여한다. 이러한 측면에서 cAMP-CRP의 조절은 어떤 면에서 총체적 조절체계라고까지 한다.본 연구는 Serratia 균주에서 crp 유전자의 분자적 특성 및 cAMP에 의한 발현조절을 받는 분자기구를 해석하고자 유전자를 클로닝하고 발현을 확인하였다. MacConkey 배지에서 maltose를 탄소원으로 충분히 이용하지 못하는 대장균 TP2139(${\Delta}crp$,${\Delta}lac$를 숙주로 이용하고, 염색체 DNA를 library로 작성하여 얻은 형질전환체 약 일만개의 콜로니에서 red colony를 나타내는 5종류의 양성 클론을 얻었다. 이들 클론을 Southern 방법으로 확인한 결과 3kh의 단편을 가진 pCKB12클론이 crp유전자를 coding하고 있음을 확인하였다. glpD-lacZ 융합 plasmid인 pLDC6의 BamHI부위에 pCKB12의 3kb 단편을 삽입시킨 재조합 plasmid pLDC6-Scrp를 작성하여, 클로닝된 Serratia의 crp유전자가 대장균에서 유전자 전사조절에 미치는 영향을 확인한 결과 cAMP-CRP 복합체 형성에 의한 전사조절 기능이 확인되어졌다. One of the better-characterized transcription factor of E. coli is the cAMP receptor protein(CRP) and the CRP binds cAMP and DNA. The cAMP-CRP complex is involved in regulation of many genes at bacteria. The cAMP-CRP regulatory element represents, in some respects, a global regulatory network. The aim of this work was to study the structure and the mechanisms controlling the expression of CRP in Serratia marcescens. We have been get 5 different clones from Serratia which stimulated the cells to use maltose as a sole carbon source in E. coli TP2139. The crp gene clone, pCKB12, was confirmed by Southern hybridization with E. coli crp gene. The location of the crp gene was determined by construction subclones carrying various portions of pCKB12. To investigate the potential role of CRP in E. coli, lacZ fused plasmids were constructed and investigated the ${\beta}$-galactosidase activity of the fused plasmid. The Serratiamarcescens cAMP receptor protein can substitute the E. coli CRP in transcriptional activation at the lacZ gene. These results suggest that Serratia marcescens cAMP receptor protein complex functions to regulate several promoters in E. coli.
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Serratia marcescens에서 cAMP receptor protein(CRP)유전자의 클로닝 및 해석
유주순,문종환,정수열,김혜선,최용락 東亞大學校附設遺傳工學硏究所 1999 遺傳工學硏究 Vol.- No.6
전사조절인자로서 잘 알려져 있는 cAMP receptor protein(CRP)은 cAMP와 DNA에 결합하는 특별한 활성을 가지고 있으며, cAMP-CRP complex를 형성하여 수많은 유전자의 발현조절에 관여한다. 이러한 측면에서 cAMP-CRP의 조절은 어떤 면에서 총체적 조절체계라고까지 한다. 본 연구는 Serratia 균주에서 crp유전자의 분자적 특성 및 cAMP에 의한 발현조절을 받는 분자기구를 해석하고자 유전자를 클로닝하고 발현을 확인하였다. MacConkey배지에서 maltose를 탄소원으로 충분히 이용하지 못하는 대장균 TP2139(△crp,△lac)를 숙주로 이용하고, 염색체DNA를 library로 작성하여 얻은 형질전환체 약 일만개의 콜로니에서 red colony를 나타내는 5종류 의 양성 클론을 얻었다. 이들 클론을 Southern방법으로 확인한 결과 3kb의 단편을 가진 pCKB12클론이 crp유전자를 coding하고 있음을 확인하였다. glpD-lacZ 융합 plasmid인 pLDC6 의 BamHI부위에 pCKB12의 3kb 단편을 삽입시킨 재조합 plasmid pLDC 6-Scrp를 작성하여, 클로닝된 Serratia 의 crp 유전자가 대장균에서 유전자 전사조절에 미치는 영향을 확인한 결과 cAMP-CRP 복합체 형성에 의한 전사조절 기능이 확인되어졌다. One of the better-characterized transcription factor of E. coli is the cAMP receptor protein(CRP) and the CRP binds cAMP and DNA. The cAMP-CRP complex is involved in regulation of many genes at bacteria. The cAMP-CRP regulatory element represents, in some respects, a global regulatory network. The aim of this work was to study the structure and the mechanisms controlling the expression of CRP in Serratia marcescens. We have been get 5 different clones from Serratia which stimulated the cells to use maltose as a sole carbon source in E. coli TP2139. The crp gene clone, pCKB12, was confirmed by Southern hybridization with E. coli crp gene. The location of the crp gene was determined by constructing subclones carrying various portions of pCKB12. To investigate the potential role of CRP in E. cloi, lacZ fused plasmids were constructed and investigated the β-galactosidase activity of the fused plasmid. The Serratia marcescens cAMP receptor protein can substitute the E. coli CRP in transcriptional activation at the lacZ gene. These results suggest that Serratia marcescens cAMP receptor protein complex functions to regulate several promoters in E. coli.
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유주순,김혜선,문종환,정수열,최용락 한국생명과학회 1998 한국생명과학회 학술발표회 Vol.20 No.-
We have get several clones from Serratia which stimulate the cells to use maltose as a carbon source in E. coli TP2139(Δ lac, Δcrp). One of the cloned genes, pCKB17, was further analyzed. In order to find whether the increased expression of the gene under the direction of maltose metabolism, we constructed several subclones. The nucleotide sequence of the 2.9 kb BamHI fragment was determined. Sequence analysis revealed the presence of two open reading frames, one is truncated ORF and the other was identified as the kdgK gene. The deduced KdgK amino acid sequence corresponds to a protein of 308 amino acid with a molecular mass of 34,000 Da. The deduced amino acid sequence of Serratia kdgK gene is highly homologous to the KDG kinase gene of Erwinia chrysanthemi, fructokinase gene of Klebsiella pneumoniae, dmpI gene of Pseudomonas putida. At the 3´end of the kdgK gene and surrounding the kdgK translational stop, there is a GC-rich inverted repeat sequence, a putative transcription terminator site. In the 5´-untranslated end of kdgK, we found a sequence showing good homology with the consensus established for the KdgR-binding site.
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