한국인과 몽골인에서 나타나는 사립체 DNA의 다형성

김근철(Keun-Cheol Kim),김애진(Ae-Jin Kim),김기정(Ki-Jeong Kim),이광호(Kwang-Ho Lee),박애자(Ae Ja Park),김재현(Jae-Hyun Kim),다스제벡투멩(Dashtseveg Tumen),노맹석(Maengseok Noh),김경용(Kyung-Yong Kim) 대한체질인류학회 2009 해부·생물인류학 (Anat Biol Anthropol) Vol.22 No.1

사립체 DNA는 모계 유전을 하고 세포 내에 존재하는 DNA의 수가 많기 때문에, 집단인류학, 범죄학에서 유용하게 사용되고 있다. 그러나 사립체 DNA 내의 다양한 염기서열 부위에서 다형성(heteroplasmy)이 보고됨에 따라 유전 양상을 이해하는 데 어려움을 겪고 있다. 본 연구에서는 약 200여 시료의 한국인과 몽골인을 대상으로 사립체 DNA에서 다형성을 조사하였다. 연구방법으로 한국인과 몽골인 혈액을 채취하여 사립체 DNA의 coding region과 control region에 대한 PCR증폭을 통한 염기서열분석을 수행하였다. 그 결과, coding region과 control region에서 각각 5염기부위, 총 10염기부위에서 다형성이 확인되었고, 염기서열의 한 부위 이상에서 다형성이 관찰된 시료는 한국인 6시료와 몽골인 17시료였다. 특히 한국과 몽골을 포함한 동아시아지역에 특이적으로 높게 나타나는 haplogroup D를 결정할 때 중요하게 분석되는 5178염기위치의 경우 총 23시료 중 6시료에서 비교적 많은 다형성이 관찰되었다. 따라서, haplogroup D를 결정할 때 또 다른 염기부위인 4883염기위치를 추가적으로 분석해야 한다고 생각된다. 또한, 다른 haplogroup과 subhaplogroup을 결정하는 염기위치인 204, 4853, 16249 등에서도 다형성이 발견되었다. 따라서, 집단유전학 등의 분야에서 한국인 등의 동아시아인을 대상으로 사립체 haplogroup을 결정할 때 민족 특이적인 여러 SNP염기부위들을 조사함으로써 더 정확한 결과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다. As characterization of mitochondrial DNA (mtDNA) shows maternal inheritance and exists as more than thousands copies per cell, it is widely used for population genetics and forensic scientific field. However, mitochondrial DNA study has difficulties because heteroplasmy of mtDNA is being reported from coding and control region. In this study, we have analyzed 200 samples to examine heteroplasmy in mitochondrial DNA of Korean and Mongolian. The control region and coding region in mtDNA of blood from Koreans and Mongolians were analyzed with PCR amplication and sequencing. As a result, several heteroplasmy was observed from total 10 positions including 5 positions in coding region and 5 positions in control region, respectively. Moreover, it showed more than one heteroplasmy in coding region from 6 samples in Korean and 17 samples in Mongolian. Interestingly, heteroplasmy at 5178 position was shown in 6 samples among 23 samples. Considering that the position is important for deciding haplogroup D, we suggest that additional analysis on 4883 position needs for correct haplogrouping. Beside, we also found heteroplasmy in the other positions of 204, 4853, or 16249. Therefore, we suggest that it is required of combinatory analysis on several key nucleotide positions to obtain good results when determining mitochondrial haplogroups.

사립체 DNA의 coding region에서 나타나는 한국인과 몽골인의 호발하는 염기서열변이 비교

김근철(Keun-Cheol Kim),김애진(Ae-Jin Kim),김기정(Ki-Jeong Kim),김재현(Jae-Hyun Kim),노맹석(Maengseok Noh),박애자(Ae Ja Park),다스제벡투멩(Dashtseveg Tumen),이광호(Kwang-Ho Lee),김경용(Kyung-Yong Kim) 대한체질인류학회 2009 해부·생물인류학 (Anat Biol Anthropol) Vol.22 No.1

사립체 DNA 분석을 이용한 분자유전학적 연구가 활발히 진행되고 있지만, DNA 염기서열 중 어떤 염기 위치를 분석하느냐에 따라 분석 결과의 차이가 존재한다. 본 연구는 control region에 비해 비교적 염기서열변이가 적은 coding region을 중점적으로 분석하는 전략을 사용하여 한국인과 몽골인에서 호발하는 염기서열변이를 비교 분석하였다. 재료는 한국인 112명과 몽골인 92명의 혈액시료에서 추출한 사립체 DNA를 이용하였으며, PCR 증폭 후 염기서열을 분석하였다. 그 결과 한국인과 몽골인에서 공통적으로 나타난 염기서열변이는 총 17부위였으며, 한국인에서만 나타난 변이는 13부위, 몽골인에서만 보이는 변이는 26부위였다. 한국인과 몽골인에서 호발하는 변이 중 대부분은 한, 두 시료에서 나타났기 때문에 개체간 변이일 것으로 생각된다. 반면, 한국인에서만 나타나는 변이 중 10397염기위치나 4850염기위치는 9% 정도의 변이율을 보였으며, 몽골인에서만 보여지는 변이 중 5108, 9950염기위치는 12.3%와 15%로 나타났고, 3546, 3553염기위치에서는 높은 비율로 다형성이 나타났다. 따라서 더 많은 시료들을 대상으로 추가적인 연구들이 이루어진다면, 이러한 염기위치들이 한국인과 몽골인 간의 유전적인 유연관계를 세분화할 때 유용한 마커로 이용될 수 있을 것으로 사료된다. Even though mitochondrial DNA analysis is performed in the field of molecular genetics, differences of the results exist regarding which nucleotide positions are analyzed. In this study, we strategically analyzed to find ethnic specific SNP of coding regions of mitochondrial DNA of Korean and Mongolian. Mitochondrial DNA was analyzed with PCR amplification and sequencing with 112 blood samples of Korean and 92 blood samples of Mongolian. As a result, the mutation which commonly appears both in Korean and Mongolian population is 17 nucleotide positions, and the one that shown in the only Korean is 13 nucleotide positions, the one that shown in the only Mongolian 26 nucleotide positions. However, it was thought as individual variation as most mutations are shown in a sample. Among them, it appears as 9% substitution rate in 10397, 4850 nucleotide position of Korean, whereas 12.3% or 15% substitution rate in 5108, 9950 nucleotide positions of Mongolian, respectively. Beside, we observed high level of heteroplasmy in 3546, 3553 nucleotide positions. Therefore, we suggest that these regions might be novel genetic markers for dividing mitochondrial haplogroup of Korean and Mongolian population, but additional analysis needs on several nucleotide positions in huge samples as analyzing on restricted nucleotide positions using restricted DNA samples.

개선된 아밀로제닌 PCR을 이용한 우즈베키스탄 출토 고인골의 형태학적 성별과 유전자형 성별의 비교

김기정(Kijeong Kim),아리오나 턱럼(Ariunaa Togloom),전은희(Eunhee Jeon),이민수(Min-Soo Lee),조연옥(Youn-Ock Cho),가와치멛 르학와수렝(Gavaachimed Lkhagvasuren),민나영(Na-Yung Min),최지혜(Jee-Hye Choi),김종대(Jong-Dae Kim),김근철(Keun-Cheol K 대한체질인류학회 2007 해부·생물인류학 (Anat Biol Anthropol) Vol.20 No.4

체질인류학, 고고학, 법의학 등의 분야에서 사람의 뼈에서 남성과 여성을 구별하는 것은 매우 중요하다. 본 연구에서는 고인골 머리뼈에서 계측하는 방법에 근거를 둔 형태학적 성별의 판단법과 기존의 amelogenin PCR 증폭방법을 더욱 개량한 유전학적 성별 결정법을 비교하고자 하였다. 재료는 우즈베키스탄에서 출토된 청동기시대부터 20세기 이전에 이르는 고인골 중 머리뼈가 보존된 60예를 대상으로 하였다. 형태학적 성별구분은 우즈베키스탄 학자의 결정을 따랐고, 유전학적 성별결정은 본 연구에서 개선한 amelogenin PCR 증폭방법을 사용하였다. 본 연구에서 형태학적 남자에서 유전학적으로 남자로 판명된 경우는 20예 중 13예였다. 형태학적 여자에서 유전학적으로 여자로 판명된 경우는 40예 중 20예였다. 결론적으로 개선된 아밀로제닌 PCR 증폭방법을 이용한 고인골 남녀 성별 판별법은 매우 유용할 것으로 생각된다. Determination of male and female is important in anthropology, archeology and forensic science. This study was designed to compare genotype sex of improved amelogenin PCR amplication method with morphological sex of ancient human bones. Sixty human skulls which lived from the Bronze Age to twenties centuries and excavated in Uzbekistan were used in this study. Morphological sex was determined by Uzbekistan scientist, and genotype sex was determined by improved amelogenin PCR amplication developed in this study. Among 20 morphological males, 13 samples (65%) were genotypical male. Among 40 morphological females, 20 samples (50%) were genotypical male. In conclusion, morphological method might be inadequate for sex determination of ancient bones. The improved amelogenin PCR method will be useful in sex determination of ancient bones.

Pectinase 처리 전후의 현미의 물리적 변화 분석

피경태(Kyung-Tae Pih),김근철(Keun-Cheol Kim) 한국생명과학회 2013 생명과학회지 Vol.23 No.4

현미에는 탄수화물 뿐 아니라 비타민, 미네랄 등과 같은 영양성분이 함유되어 있다. 현미는 당뇨 등과 같은 질환관리에 매우 유용하지만, 취반 등의 어려움 등으로 대중적인 소비가 어려운 실정이다. 본 연구에서는 현미표면에 풍부한 섬유소를 제거하기 위해 분해 효소를 이용하는 가공 방법의 가능성을 수행하였다. 일정시간 물에 담근 후 현미의 무게 변화를 측정하였을 때, 대조군 또는 collagenase 가공한 현미에 비해 pectinase 가공한 현미의 무게가 심하게 증가하는 것을 알 수 있었다. 수용액에서 현미를 침지한 후 pectinase를 처리하면 현미의 미강 부분이 거칠어지고, 미세한 구멍이 형성되는 것을 전자현미경 관찰을 통하여 확인하였다. 또한 이러한 pectinase를 이용한 현미 가공에도 불구하고 현미고유의 영양성분은 거의 완벽하게 보존되고 있음을 알 수 있었다. 한편, pectinase 가공 전후의 현미를 대상으로 수분 흡수력, 녹말 반응도의 차이를 조사하였을 때, pectinase처리 현미에서 높은 수분흡수력, 녹말 반응도가 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 기존의 현미 도정 방법에 비해 pectinase 처리에 의해 현미 가공방법은 영양성분이 보존될 뿐 아니라 식감, 미감 등에서 우수한 가공방법임을 제시할 수 있다. Brown rice (Oryza sativa) is rich in nutrients, including dietary fiber, vitamins, minerals, and other unmeasured constituents, as well as carbohydrates. Brown rice is an applicable staple for chronic diseases, such as diabetes and hyperlipidemia, but it is not commonly used in dietary management due to several reasons. In this study, we investigated the possibility of using digestive enzymes to process brown rice. When the weight of the brown rice was measured after packing in the same volume of water, it was increased in pectinase-treated brown rice compared to control or collagenase-treated brown rice. Using SEM analysis, we observed huge scratches and nanopores on the surface of the brown rice after the pectinase treatment, but the nutritional components were preserved. We also analyzed the water adsorption rate and performed a starch reaction assay to examine the physical changes after the pectinase treatment. The pectinase-treated brown rice showed a higher water adsorption rate and a faster starch reaction than the nontreated brown rice. These results suggest that digestive enzymes like pectinase can aid the nutritional preservation of brown rice and improve its taste.

고인골 유전자 증폭 효율이 높은 핵산 분리 방법

김기정(Ki-Jeong Kim),아리오나 턱럼(Ariunaa Togloom),전은희(Eun-Hee Jeon),이민수(Min-Soo Lee),조연옥(Youn-Ock Cho),가와치멛 르학와수렝(Gavaachimed Lkhagvasuren),최지혜(Jee-Hye Choi),다스제벡 투멩(Dashtseveg Tumen),김근철(Keun-Cheol Kim),김재현 대한체질인류학회 2007 해부·생물인류학 (Anat Biol Anthropol) Vol.20 No.4

고인골 핵산(DNA)분석은 인류학 및 고고학에서 인류의 진화 및 계통발생학적 연구에 널리 이용되고 있다. 그러나 이러한 분석을 위한 고인골 핵산 추출은 보존이 잘 안된 고인골 시료에서 성공적이지 못한 경우가 흔하다. 이 연구에서는 이러한 고인골로부터 핵산 분석의 성공율을 높이기 위하여 이온교환수지를 이용한 고순도 핵산추출법을 시도하였다. 이 방법과 기존에 고인골 핵산 추출법으로 쓰여온 GENECLEAN<SUP>®</SUP> 키트 (Qbiogene)와 Qiaquick<SUP>®</SUP> 컬럼(Qiagen)방법을 이용하여 한국과 몽골의 약 500년에서 5000년 된 12개 고인골 검체들로부터 핵산분석의 성공율을 비교하였다. 핵산 분석 방법으로서 사립체 핵산, 남성 결정 표지 핵산 및 한국인에서 흔한 Y 염색체 일배체그룹 O 표지(M175) 핵산 증폭 방법을 이용하였다. 이 연구에서 개발된 방법은 기존 방법들에 비하여 핵산분석의 성공율을 현저히 증가시켰다. GENECLEAN<SUP>®</SUP> 키트 이용 방법으로 사립체 핵산 증폭은 두 시료에서만 가능하였고, 남성 결정 표지 핵산과 M175 표지 핵산의 증폭은 모든 검체에서 없었다. Qiaquick<SUP>®</SUP> 컬럼 방법은 9개 시료에서 사립체 핵산 증폭, 9개 시료에서 남성 결정 표지핵산 증폭, 6개 시료에서 M175 표지 핵산 증폭이 가능하였다. 이 연구에서 개발된 방법은 모든 시료에서 사립체핵산 증폭, 10개 시료에서 남성 결정 표지 핵산 증폭, 8개 시료에서 M175 표지 핵산 증폭이 가능하였다. 이 결과는 이온교환수지를 이용한 핵산 추출법이 고인골 핵산분석을 위해 향상된 핵산 분리법으로서 인류학 연구에서 유용하게 쓰일 수 있음을 시사한다. Ancient DNA analyses are widely used for evolutionary and phylogenetic study of mankind in anthropology and archeology. However, the DNA extraction from particularly poorly preserved ancient human samples is often unsuccessful in these analyses. In the present study, to improve the success rate of ancient DNA analysis, we introduced a high grade ancient DNA purification method using ion-exchange columns. We compared the success rate of ancient DNA analysis of this new method with that of the two methods that have been used for ancient DNA extraction, GENECLEAN<SUP>®</SUP> kit (Qbiogene) and Qiaquick column (Qiagen). Twelve ancient bone samples from Korea and Mongolia that are about 500 to 5,000 years old by an archeological estimation were used. As the DNA analysis methods, polymerase chain reaction (PCR) methods for the amplification of a mitochondrial DNA HV1 segment, a male sex determination marker DNA and M175 marker DNA that is used for the determination of O haplogroup of Y chromosome that is reportedly a common one in modern Korean people. The method developed in this study remarkably increased the success rate of DNA analysis compared with the other two methods. Using the GENECLEAN<SUP>®</SUP> kit, only two samples were amplifiable for the mitochondrial DNA, no sam- ples for the male sex determination marker and M175 marker DNAs. Using the Qiaquick columns, nine samples were amplifiable for mitochondirial DNA, nine samples for male sex determination marker and six samples for M175 marker. The developed method allowed for the amplification of mitochondrial DNA from all samples, male sex determination marker from eight samples and M175 marker from eight samples. The results demonstrate that ion-exchange columns can be useful for the improved ancient DNA extraction in anthropology and archeology.

생물정보 프로그램을 활용한 SETDB1 유전자 프로모터 클로닝

노희정(Hee-Jung Noh),김근철(Keun-Cheol Kim) 한국생명과학회 2014 생명과학회지 Vol.24 No.1

진핵세포의 유전자 발현은 genomic DNA 부위의 프로모터라고 불리우는 지역에 전사인자와 RNA 중합효소가 자리하면서 시작되는 기작이다. 유전자 내의 프로모터를 동정하는 여러종류의 실험 방법들이 있지만, 많은 시간과 노동력이 요구되어진다. 본 연구에서는 Ensembl, NCBI, CpG plot 등과 같은 생물정보학 관련 프로그램들을 활용하여 SETDB1 유전자의 프로모터를 동정하여 클로닝하고자 하였다. PCR 증폭을 수행한 후 얻은 약 2 kb DNA 조각을 SETDB1-P1이라 명명하였으며, PCR 산물은 TA 벡터로 클로닝 후 확인하였으며, 이를 다시 제한 효소 절단을 통하여 pGL3-luc 벡터로 클로닝하였다. 클로닝된 pGL3-SETDB1-P1-luc 플라스미드를 H1299 폐암세포주에 transfection 시킨 후 여러 가지 항암제를 처리하였을 때, taxol, 5-FU, doxorubicin 처리군에서 SETDB1 프로모터 활성이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 웨스턴 블롯 및 RT-PCR 실험을 통해 항암제 처리 후 SETDB1 유전자 발현이 조절됨을 확인하였다. 그러므로 bioinformatics 프로그램을 통한 프로모터 동정 및 클로닝 방법을 다른 유전자들에도 적용시킨다면, 유전자 발현 연구에 매우 유용할 것으로 사료된다. Eukaryotic gene expression is an important process, which is initiated by several transcription factors and RNA polymerases that occupy the promoter region of genomic DNA. Although there are many experiments to identify the promoter region in a gene, it is time and labor consuming to finalize it. In this study, we utilized bioinformatic programs, including Ensembl, NCBI, and CpG plots, to identify the cloning promoter region in SETDB1 genomic DNA. We performed PCR amplification to obtain the SETDB1 promoter on an approximately 2 kb region upstream from the TSS named SETDB1-P1. The PCR product was ligated with TA cloning vectors, and we confirmed the insert size using restriction enzyme digestion. Sequentially, the insert was subcloned into a pGL3-luc vector to produce pGL3-SETDB1- P1-luc and then confirmed by DNA sequencing. We also obtained a fragmented PCR product called P2 and P3 and performed a luciferase assay using pGL3-SETDB1-P1-luc transfection. We found that several anticancer drugs, including taxol, 4-FU, and doxorubicin, decreased the promoter activity of SETDB1. We obtained consistent data on the regulation of SETDB1 gene expression after anticancer drug treatment using Western blot analysis and RT-PCR. Our results suggest that promoter cloning of the human SETDB1 gene utilizing bioinformatics is a very useful and timesaving approach to study gene expression.

부저병 원인균 Paenibacillus larvae 특이 유전자 분석을 통한 진단마커 발굴

나한흠(Han-Heom Na),김근철(Keun-Cheol Kim) 한국생명과학회 2017 생명과학회지 Vol.27 No.1

부저병이란 Paenibacillus larvae감염에 의하여 꿀벌 유충의 괴사를 유도하는 질병이다. 우리나라에서는 2008년 봄, 국내에 처음으로 대량 발병 사례가 보고되었으며, 지속적인 2차 피해로 큰 후유증을 앓고 있다. 본 연구에서는 부저병을 효율적으로 관리할수 있는 진단방법을 조사하고자 하였다. 따라서 부저병의 원인균인 P. larvae에서 특이적으로 발현되고 있는 유전자들을 동정하고자 하였으며, 이 유전자들은 주로 부저병균의 독성을 유발하는 것으로 알려진 Toxin1, Toxin2A & 2B, SplA, CBP49, SevA&SevB 들이다. 이들은 1차 PCR 에서는 검출하기 어려웠지만, 2차 nested PCR방법을 이용하여 검출이 용이함을 알 수 있었다. 한편 여러가지 식물 추출물을 혼합한 배지에서 부저병균을 배양하였을 때, 부저병균의 성장저해와 일치하게 우리가 검증한 유전자들의 발현이 감소하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 부저병 원인균의 특이 유전자들은 향후 PCR진단마커로서 활용 가능성이 있을 것으로 사료된다. Foulbrood disease is infected by Paenibacillus larvae on larval stage of honeybee, and is lethal disease to result in population death. This disease was manifested in 2008 in Korea, is still suffered by the secondary damages. In this study, we are to examine diagnostic PCR approaches to manage the Foulbrood disease. PCR amplification of 16S rRNA is generally using for microbial infection, but the specificity is little poor for the correct diagnosis. Therefore, we are to identify specific genes expressed in Paenibacillus larvae, and perform PCR analysis. We selected five distinct genes from literature references. Those genes are commonly known as toxic genes for host infection, and include Toxin1, Toxin2A & 2B, SplA, CBP49, and SevA&SevB. PCR amplification for these genes is difficult to detect at the first time. So, we performed the second PCR using the first PCR product as a template. This approach using the nested PCR was very useful for detecting large marker genes. When Paenibacillus larvae was cultured in the medium containing plant extracts, PCR amplification of the identified genes is correlated with the microbial growth inhibition. Therefore, these results suggest that the identified genes might be useful to study diagnostic PCR markers for honeybee Foulbrood disease.

Quantitative Analyses of Cells using Photoshop after the H&E Staining of the Synovia of Osteoarthritis and Rheumatoid Arthritis Patients

Jin-Ah Park(박진아),Keun-Cheol Kim(김근철) 한국생명과학회 2012 생명과학회지 Vol.22 No.8

활막조직은 관절부위에 존재하는 비연골성의 얇은 세포층으로 구성되어 있으며, 류마티스 관절염 등에서 활성화 되어진다. 우리는 골관절염(n=8)과 류마티스 관절염(n=5)에서 유래한 활막조직을 대상으로 활막조직내의 세포를 정량화하고 세포성분들을 비교 분석하고자 하였다. 활막조직을 H&E 염색한 후 광학현미경으로 관찰하였을때 류마티스 관절염의 활막조직은 골관절염에 비해 형태적으로 두터워졌으며 비후된 양상이었다. 또한 CD68, CD90, PGP9.5 등과 마커들을 이용하여 IHC 분석을 수행한 결과 활막조직의 내막층과 내막하층에 존재하는 세포들을 특성을 분한 결과 내막층에는 대식세포가 집중적으로 분포하며, 내막하층에는 대식세포와 섬유아세포 유사활막세포(FLS)가 존재한다는 사실을 알 수 있었다. H&E 이미지를 포토샵 프로그램을 이용하여 반전시켜 내막층과 내막하층 부위별로 세포계수 및 세포층계수를 수행하였다. 내막층 분석 결과 류마티스 관절염의 활막조직의 골괄절염보다 대식세포의 수와 층이 현저하게 증가된 것을 확인할수 있었다. 또한 류마티스 관절염의 활막조직의 내막하층분석결과 섬유아세포 유사 활막세포의 수적인 증가를 계수 할수 있었다. 또한 류마티스 관절염의 경우 활막의 비후가 심하기 때문에 혈관의 위치가 내막층으로부터 상대적으로 멀리 위치하고 있음을 알 수 있었다. 그러므로 H&E 염색 이미지의 포토샵 분석을 이용한 골관절염과 류마티스 관절염 활막조직에 대한 정량 분석방법은 류마티스 관절염의 발병과정에서 세포들이 활성화된다는 사실을 증명하는데 유용할 것으로 사료된다. Synovium is the soft tissue that lines the non-cartilaginous surfaces within joints. It has been reported that synovial cells are activated during the pathogenesis of rheumatoid arthritis. In this study, we quantitate and compare the cellular composition of synovia derived from individuals with non-inflammatory osteoarthritis (OA) and those with inflammatory rheumatoid arthritis (RA). Synovia from OA (n=8) and RA (n=5) patients were used for hematoxylin and eosin (H&E) staining. A light microscopic examination has shown that RA synovia were morphologically thickened and hypertrophied as compared to OA synovia. We also performed an immunohistochemistry (IHC) analysis to classify cell types in the synovia using CD68, CD90, or PGP9.5 markers. As a result, we obtained quantitative data regarding the cell populations, which are macrophages in the lining layer and FLSs in the subintimal layer of the synovium. Further Photoshop analyses of the H&E images could allow the counting of the number and layer of the cells in the synovium. The number and layers of the macrophage cells were increased in the lining layer of the RA synovia as compared to the OA synovia. FLS cells also were increased in the subintimal layer of RA synovia. Therefore, quantification of the H&E stained images via Photoshop is a possible analysis protocol for synovium study. This quantitation also supports the idea that the increases in cell number and cell activation are important processes for RA pathogenesis.

강화플라스틱선의 협동화 생산시스템 운용을 위한 표준화 연구

나승수(Seung-Soo Na),김영훈(Young-Hun Kim),김근철(Keun-Cheol Kim) 대한조선학회 2005 大韓造船學會 論文集 Vol.42 No.3

사람 핵DNA로부터 FosB 유전자 프로모터 클로닝 및 활성도 분석

나한흠(Han-Heom Na),강윤성(Yoonsung Kang),김근철(Keun-Cheol Kim) 한국생명과학회 2017 생명과학회지 Vol.27 No.8

FosB (FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog B) 유전자는 사람의 19번 염색체에 위치하고 있으며 약 43 KD의 단백질을 코딩하며, 발생 및 분화과정, 개체 유지, 발병 진행 등을 조절한다고 알려져 왔다. 본 연구에서는 바이오 마커 등의 가능성이 있다고 보고된 FosB 유전자의 프로모터를 클로닝하여 활성도를 분석하고자 하였다. FosB genomic DNA 서열을 확인한 결과, TSS upstream 방향의 약 1 Kb 안쪽 부위에 FosB 유전자 발현을 위한 중요한 요소들이 있을 것으로 추정하였고, 따라서 FosB genomic DNA의 upstream -1,555 부위부터 exon 1의 +73까지 부위에 대한 PCR 증폭을 수행하였다. 또한 클로닝 성공을 높이기 위하여 일차로 TA-1<SUP>st</SUP>FosBp plasmid를 얻은 후, 다시 TA-1stFosBp plasmid를 template로 Kpn1과 Nhe1 제한 효소 절단부위를 프라이머에 삽입한 후 제작하여 2차 PCR을 수행하였으며, TA-2<SUP>nd</SUP>FosBp 플라스미드를 제작한 후 제한 효소로 절단하여 pGL3-luc vector로 subcloning하였다. 제작된 pGL3-FosBp-luc를 이용하여 항암제에 대한 활성도를 분석하고자 A549 사람 폐암세포주에 pGL3-FosBp-luc 플라스미드를 transfection 한 후 luciferase 활성도 분석을 수행하였다. Luciferase 활성도 증가는 doxorubicin, taxol 등을 처리한 후 단백질 발현 양상과 비교 하였을 때도 일치되는 결과를 얻을 수 있었다. 그러므로 FosB프로모터 클로닝은 향후 유전자 발현 연구, 마커분석 등에 유용할 것으로 사료된다. The FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog B (FosB) gene is located at chromosome 19, and encodes 43 Kda protein. Functionally, the FosB gene is important for differentiation, development, and pathogenesis. Furthermore, the FosB gene is suggested as possible biomarker for tracing disease prognosis. In this study, we constructed plasmid containing a FosB promoter region and evaluate its promoter activity. We analyzed the putative promoter region in FosB genomic DNA using bioinformatics program, and we found important regulatory elements in 1 Kb upstream from transcription start site (TSS). Therefore, we performed polymerase chain reaction (PCR) amplification on region from-1,555 upstream to +73 of the FosB genomic DNA, and PCR product was inserted into TA vector to create the TA-1stFosBp plasmid. We then prepared the primer sets, which contain a restriction enzyme site for Kpn1 and Nhe1, in order to reinsert into the TA vector to prepare TA-2<SUP>nd</SUP> FosBp plasmid. It was finally subcloned into pGL3-luc vector after enzyme cutting. To evaluate whether the cloned plasmid is useful in cell based experiment, we performed luciferase assay with pGL3-FosBp-luctransfection. FosB promoter activity was increased compared to empty vector, and this activity was significantly increased by treatment of doxorubicin and taxol. We obtained consistent data on regulation of FosB gene expression after anticancer drug treatment using Western blot analysis. The results suggest that promoter cloning of the human FosB gene is very useful for studying gene expression and analyzing biomarkers.