국내 분리 토마토반점위조바이러스의 저항성 판별을 위한 생물검정법 개발

곽해련,최현용,홍수빈,허온숙,변희성,최홍수,김미경,Kwak, Hae-Ryun,Choi, Hyeon-Yong,Hong, Su-Bin,Hur, On-Sook,Byun, Hee-Seong,Choi, Hong-Soo,Kim, Mikyeong 한국환경생물학회 2021 환경생물 : 환경생물학회지 Vol.39 No.3

토마토반점위조바이러스(TSWV)는 고추, 토마토 등 경제적으로 중요한 작물에 심각한 피해를 주는 바이러스들 중 한 종이다. TSWV의 넓은 기주범위, 매개충인 총채벌레 방제의 어려움 및 TSWV의 효과적인 치료제가 없기 때문에, 저항성 품종을 사용하는 것이 TSWV를 예방하는 가장 효과적인 수단이 될 수 있다. 본 연구에서는 토마토에서 분리된 TSWV 분리주(SW-TO2)의 유전학적·생물학적 특성을 구명하고, 최근에 국내에서 분리된 구기자, 머위, 당귀 TSWV 분리주와 비교하였다. 순수분리된 SW-TO2는 28종의 지표식물 중 토마토를 포함한 17종에서 원형반점, 모자이크 증상 등 전신감염 증상을 보였다. SW-TO2의 유전자 계통분석 결과 국내에서 분리된 고추, 구기자 TSWV 분리주와 98~99%의 상동성을 보이며 같은 그룹에 속하였다. TSWV 저항성 평가를 위한 생물검정법을 확립하고, 시판되고 있는 고추와 토마토 품종을 대상으로 4종의 TSWV 분리주에 대한 저항성 평가를 검정하였다. TSWV 저항성 평가는 첫째, 접종엽에 괴사반점 증상이 나타나거나 병징이 없는 경우, 둘째, 상엽에 병징이 없는 경우, 셋째, 상엽을 RT-PCR 진단한 결과 음성이 나왔을 경우 등 3가지 조건이다 충족될 때 저항성으로 평가하였다. Tomato spotted wilt virus (TSWV) is one of the most destructive viruses worldwide, which causes severe damage to economically important crops, such as pepper and tomato. In this study, we examined the molecular and biological characterization of a TSWV isolate (SW-TO2) infecting tomato and compared it to the recently reported isolates from boxthorn, butterbur, and angelica plants. The phylogenetic analysis based on the complete genome sequences confirmed that SW-TO2 was clustered with those of isolates from boxthorn and pepper in Korea with the maximum nucleotide identities ranging from 98% to 99%. We developed the bioassay method for screening TSWV resistance and tested some commercial pepper and tomato cultivars for resistance evaluation of four isolates of TSWV. TSWV resistance was evaluated as TSWV resistance when all the following three conditions were satisfied: first, when symptoms of necrotic spots or no symptoms were present in the inoculated leaves; second, when there were no symptoms in the upper leaves; and third, when the upper leaves were negative as a result of RT-PCR diagnosis.

아욱에서 분리한 Malva Vein Clearing Virus 분리주의 특성

곽해련(Hae-Ryun Kwak),김지광(Ji-Gwang Kim),김정은(Jeong-Eun Kim),최현용(Hyeon-Yong Choi),최홍수(Hong-Soo Choi),김미경(Mikyeong Kim) 한국식물병리학회 2020 식물병연구 Vol.26 No.4

In September 2017, vein clearing and yellowing symptoms resembling those caused by viruses were observed on leaves of Malva verticillata in Chungnam, Korea. Nucleic acids were extracted from leaves of five symptomatic plants and tested by reverse transcription polymerase chain reaction using four virus specific primer pairs including malva vein clearing virus (MVCV). Amplicons of the expected size (600 bp) were obtained from total RNA of all samples using the MVCV-specific primers. To confirm the presence of MVCV in symptomatic plants, the DNA fragments from three samples were purified, and directly sequenced. BLAST analysis revealed that it shared the highest nucleotide identity (99%) with a MVCV isolate from tomato (Mexico). The virus isolates obtained from the third re-inoculated Chenopodium was designated as Cm1–5. Tissue from Cm1, Cm3, and Cm5 isolates was mechanically sap inoculated into 23 indicator plants. Cm3 isolate induced chlorotic local and mosaic symptoms in Althaea rosea. Phylogenetic analysis based on coat protein gene of 19 MVCV isolates from 6 different countries and plant species, did not correlated with either the geographical origin of the isolates, or pathogenicity. To our knowledge, this study first reports the natural occurrence of MVCV on M. verticillata in Korea and characterization of three Korean isolates of MVCV. 2017년 9월 충남 예산지역의 아욱 잎에서 엽맥퇴록 및 황화등 바이러스 증상 관찰되었다. 증상이 있는 아욱 5주에서 핵산을 추출하여 아욱엽맥투명바이러스(Malva vein clearing virus, MVCV)를 포함한 4종 바이러스 특이 프라이머를 이용하여 reverse transcription polymerase chain reaction 수행하였다. MVCV 특이 프라이머로 증폭된 total RNA 5점에서 600 bp 의 분자크기를 갖는 밴드가 확인되었다. MVCV 확인하기 위하여 여기서 얻어진 PCR 산물 3개를 정제 후 direct sequencing 으로 염기서열을 결정하였다. BLAST 검색 결과, 멕시코의 토마토에서 분리된 MVCV 분리주와 99%로 가장 높은 상동성을 보였다. 명아주속 식물을 이용하여 단일국부병반을 3회 분리 후Cm1–5으로 명명하였다. Cm1, Cm3, Cm5 분리주를 23종의 지표식물에 즙액 접종하였다. Cm3 분리주는 접시꽃에 퇴록반점및 모자이크 증상을 나타내었다. 국내 아욱 3 분리주를 포함한6개 다른 국가 및 식물 종에서 분리된 19 MVCV 분리주들에 대한 외피 단백질 유전자의 계통학적 유연관계분석 결과, 지리적 기원 또는 병원성과는 관련되지 않았다. 본 연구는 국내 아욱에서MVCV의 자연 발생 및 3 분리주의 특성에 대한 첫 보고이다.

당귀에서 발생한 토마토반점위조바이러스의 감염 첫 보고

곽해련(Hae-Ryun Kwak),홍수빈(Su-Bin Hong),최현용(Hyeon-Yong Choi),박고수(Gosoo Park),허온숙(On-Sook Hur),변희성(Hee-Seong Byun),최홍수(Hong-Soo Choi),김미경(Mikyeong Kim) 한국식물병리학회 2021 식물병연구 Vol.27 No.2

2019년 6월 충남 논산의 당귀 재배 농가에서 원형반점, 괴사 반점, 황화, 모자이크 등의 증상을 보이는 당귀잎을 채집하였 고, 이들 시료에 대한 바이러스 감염 여부를 확인하기 위하여 전자현미경 검경과 감염우려가 있는 바이러스 3종(cucumber mosaic virus, broad bean wilt virus 2, tomato spotted wilt virus [TSWV])에 대해 reverse transcription polymerase chain reaction 진단을 수행한 결과 TSWV에 대해 양성반응을 보였다. 당귀 TSWV의 생물학적 특성을 구명하기 위해 순수분리하여 5 과 28종의 지표식물과 일당귀에 즙액접종하여 기주범위와 병 원성을 확인하였다. TSWV의 3 segment (L, M, S)의 전체 염기서 열을 결정하고 기존에 보고된 TSWV 분리주와 계통분석을 한 결과, 당귀 TSWV 분리주(NS-AG-28)는 논산지역의 머위 분리주 (TSWV-NS-BB20)와 가장 유사한 것으로 나타났다. TSWV는 넓 은기주범위를가지고있고특히고추,토마토등가지과작물 에 큰 피해를 주고 있기 때문에, 당귀가 TSWV의 중간기주로서 작용하지 않도록 주의하고, 당귀의 바이러스병 피해를 예방하 기 위하여 지속적인 모니터링이 요구된다. In June 2019, Angelica acutiloba plants showing virus-like symptoms such as chlorotic local lesion and mosaic on the leaves were found in a greenhouse in Nonsan, South Korea. To identify the causal virus, we collected 6 symptomatic A. acutiloba leaf samples and performed reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis using specific detection primers for three reported viruses including tomato spotted wilt virus (TSWV). RT-PCR results showed that five symptomatic samples were positive for TSWV. Mechanical sap inoculation of one of the collected TSWV isolate (TSWV-NS-AG28) induced yellowing, chlorosis and mosaic symptoms in A. acutiloba and necrotic local lesions and mosaic in Solanaceae species. Phylogenetic analysis based on the complete genome sequences showed that TSWV-NS-AG28 had a maximum nucleotide identity with TSWV- NS-BB20 isolated from butterbur in Nonsan, South Korea. To our knowledge, this is the first report of TSWV infection in A. acutiloba.

2015-2017년 국내 스마트 공중 포집기에 포획된 벼 주요 멸구류의 밀도 변동 및 보독충률 조사

최지은,곽해련,김미경,정태우,서장균,김정수,최홍수,Choi, Ji-Eun,Kwak, Hae-Ryun,Kim, Mi-Kyeong,Jeong, Tae-Woo,Seo, Jang-Kyun,Kim, Jeong-Soo,Choi, Hong-Soo 한국식물병리학회 2018 식물병연구 Vol.24 No.3

본 연구에서는 2015년-2017년 사이에 실시간 예찰 장비인 스마트 공중 포집기(SSNT)에 의해 포획된 멸구류 3종, 애멸구, 흰등멸구, 벼멸구의 비래 밀도를 분석하였으며, 각 멸구류가 전염하는 바이러스에 대하여 보독충률을 조사하였다. 중국과 가까운 충남, 전남, 전북과 경기도의 서해안 지역의 경우, 비래 밀도는 각각 27.5%, 17.2%, 15.3% 및 10.9%로 충남의 비래 밀도가 가장 높았고, 남해안 지역인 경남 지역의 비래 밀도는 15.9%였다. 그러나 경북과 강원도 지역의 동남부 지역에서 비래 밀도는 6.9%, 4.7%로 상대적으로 낮았으며, 충북의 내륙지역에서 비래 밀도는 1.6%로 가장 낮았다. 2015년부터 3년간 멸구류의 월별 대량 비래 시기는 애멸구는 7월, 흰등멸구와 벼멸구는 7-8월이었다. 2016년 이동성 멸구류 3종의 일별 대량 비래는 7월 중 하순에 7월 15일, 21일, 27일로 3회였으며, 2017년은 5월 28일, 6월 7일 및 7월 8일로 3회였다. 이 시기의 기후도는 중국과 필리핀 부근에서 형성된 고기압 사이로 우리나라를 향해 이동하는 저기압 골이 형성되었다. 2015-2017년 SSNT에 포획된 비래 멸구류의 바이러스 보독충률 조사는 RSV 등 5종의 벼 바이러스에 대하여 RT-PCR 유전자 진단을 하였다. 애멸구 1,185마리를 대상으로 RSV와 RBSCV를 검정한 결과 RSV는 검출되지 않았고, RBSDV는 0.4%의 보독충률을 보였다. 흰등멸구 898마리를 검정한 결과 SRBSDV를 보독 한 개체는 없었으며, 벼멸구 33마리를 대상으로 검정한 결과 RRSV와 RGSV를 보독한 개체는 없었다. Major viruses infecting rice are transmitted by planthoppers such as small brown planthopper (SBPH), brown planthopper (BPH) and white-backed planthopper (WBPH). In this study, we investigated planthoppers captured during 2015 to 2017 by a smart sky net trap (SSNT) system installed in 40 areas in Korea, which is an automatic, rapid and real-time insect surveillance system. The average rates of captured migration plnathoppers was 27.5%, 17.2%, 15.3% and 10.9% in Chungcheongnamdo, Jeollanamdo, Jeollabukdo and Gyeonggido, orderly. The highly migrated month was July for SBPH, July to August for WBPH and August for BPH. To investigate the viruliferous rates of planthoppers of rice during 2015 to 2017, we performed RT-PCR using specific primers for each rice virus. RBSDV was detected from 0.4% in SBPH, while no viruses were detected in BPH and SBPH. Rice planthoppers exist all around in Asia. They can move long distance by wind from southern countries to Korea. Monitoring the migration of rice planthoppers and their viruliferous rates is important to prevent the outbreaks of rice virus diseases.

고추약한모틀바이러스 병원형 P1,2 및 P1,2,3 생물검정을 통한 저항성 고추유전자원 선발

허온숙(On-Sook Hur),곽해련(Hae-Ryun Kwak),노나영(Na-Young Ro),Choi(Yumi Choi),이수경(Sukyeong Lee),황애진(Aejin Hwang),김빛샘(Bichsaem Kim),김성훈(Seong-Hoon Kim),한범수(Bum-Soo Hahn) 한국육종학회 2022 한국육종학회지 Vol.54 No.2

Pepper mild mottle virus (PMMoV), a member of the genus Tobamovirus, is one of the most threatening pathogens affecting commercial pepper production, and it is classified into pathotypes P1,2 and P1,2,3. As chemical and physical treatments show limited success in controlling PMMoV, resistant pepper varieties are considered the most effective means of disease control. Two hundred pepper germplasms, including 167 accessions of Capsicum chinense and 5 reference accessions known as resistant L alleles, were assessed using a bioassay to select germplasms resistant to PMMoV. Six accessions, including IT261210, were resistant to both PMMoV pathotypes P1,2 and P1,2,3 as they developed necrotic local lesions only on inoculated leaves, whereas no symptoms were observed on the upper leaves. Moreover, RT-PCR results of the upper leaves of these accessions were also negative. Thus, the identified accessions may be a novel source of genetic resistance against present or emerging new pathotypes and may be useful for differentiating L alleles.

국내의 토마토 주요 바이러스 진단을 위한 역전사중합반응법용 프라이머 세트

신준성,한정헌,신유주,곽해련,최홍수,김정수,Shin, Jun-Sung,Han, Jung-Heon,Shin, Yu-Ju,Kwak, Hae-Ryun,Choi, Hong-Soo,Kim, Jeong-Soo 한국식물병리학회 2017 식물병연구 Vol.23 No.2

국내의 토마토에서 발생하는 주요 바이러스는 Tomato chlorosis virus (ToCV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Cucumber mosaic virus (CMV), Pepper mottle virus (PepMoV), Tomato mosaic virus (ToMV)이다. 이들 바이러스를 진단하기 위해 프라이머 세트와 반응액을 포함하는 역전사중합반응(RT-PCR)법의 조건을 조사하였다. 공시한 바이러스에 특이적인 염기서열로부터 모두 46개 프라이머 세트를 설계하고, 이를 이용해 주형을 넣지 않은 RT-PCR에서 비특이 반응을 조사하였다. 이들 가운데 16개 조합을 건전한 토마토 RNA에 적용한 결과 프라이머 세트와 RT-PCR 반응액 간의 친화성이 비특이 반응 감소에 영향을 주었다. cDNA 합성과 관련된 인자와 RT-PCR 반응액 사이의 조합을 근거로 ToCV 진단을 위한 두 종류의 반응액을 선발하였다. ToCV 진단 시 수립된 조건을 나머지 바이러스 진단에 적용했을 때, 특이성이 높은 프라이머 세트 C029 (ToCV), C072 (TSWV), C070 (CMV), C048 (PepMoV), C065 (ToMV)를 선발할 수 있었다. 이들 프라이머 세트는 공시한 바이러스를 특이적으로 진단하는 데 유용할 것으로 판단된다. Major tomato viruses in Korea are Tomato chlorosis virus (ToCV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Cucumber mosaic virus (CMV), Pepper mottle virus (PepMoV), and Tomato mosaic virus (ToMV). RT-PCR conditions for the viruses were examined, especially in primer set and RT-PCR mixture. Total 46 primer sets from the unique sequence of the viruses were tested for nonspecific background products in a RT-PCR mixture without template. Among them 16 primer sets were applied to healthy tomato RNA, resulting the compatibility between RT-PCR mixture and primer set influenced RT-PCR to reduce nonspecific background products. Based on the combinations among cDNA synthesis parameters and RT-PCR mixtures, two reaction mixtures were finally selected for ToCV detection. The condition allowed to determine more specific primer sets; C029 (ToCV), C072 (TSWV), C070 (CMV), C048 (PepMoV), and C065 (ToMV). These primer sets are expected to be of use to specific detection of the major viruses in tomato plants.

CABYV 감염 멜론의 황화증상에 따른 생리적인 특성

이희주(Hee Ju Lee),김미경(Mi-Kyeong Kim),이상규(Sang Gyu Lee),최장선(Chang Sun Choi),최홍수(Hong-Soo Choi),곽해련(Hae Ryun Kwak),최국선(Gug Seoun Choi),전창후(Changhoo Chun) 한국원예학회 2015 원예과학기술지 Vol.33 No.2

최근 멜론 재배지에서 확산되고 있는 멜론 황화엽 증상의 발생 원인을 구명하고자 황화엽 발생개체와 정상 개체간의 생육과 바이러스 이병 여부를 평가하였다. 그 결과 황화증상을 보이는 멜론 잎에 대해 전자현미경 검경 및 국내 보고된 박과 감염 8종에 대해 RT-PCR한 결과 바이러스가 진단되지 않았다. 국내 미보고된 바이러스로 의심되어 차세대유전체염기서열분석(NGS)를 이용하여 진단한 결과 박과진딧물바이러스(CABYV)로 판정되어 CABYV 특이프라이머를 이용하여 RT-PCR 한 결과 모두 CABYV 감염이 확인되었다. 광합성 능력은 정상엽의 경우 12.36μ㏖·m<SUP>-2</SUP>·s<SUP>-1</SUP>였고, 황화엽은 4.09μ㏖·m<SUP>-2</SUP>·s<SUP>-1</SUP>로 황화엽이 정상엽의 1/3 수준으로 낮았다. 뿌리의 활력도 정상적인 생육을 보인 멜론에서는 0.48㎎·g<SUP>-1</SUP>이었으나 황화증상이 발생한 개체에서는 0.28㎎·g-1로 황화증상 개체의 뿌리 활력이 정상 개체보다 2배 정도 낮았다. 잎의 무기성분은 모든 성분에서 정상엽이 황화엽보다 2배 이상 유의성 있게 높게 나왔고, 특히 철분의 함량은 20배 정도의 차이를 보였다. 정상 개체와 황화증상 개체의 세포조직을 관찰한 결과, 울타리조직이나 해면조직은 모두 정상적인 모양을 보여 황화증상이 잎의 세포조직에는 영향을 미치지 않는 것으로 사료되었지만 다만, 황화증상 개체의 잎은 통도조직의 주변을 중심으로 전분이 많이 축적되어 있는 것으로 나타나 동화양분의 전류가 되지 않은 것으로 추정되었다. 따라서 최근에 국내의 멜론재배지에서 급속하게 발생하고 있는 황화엽 증상은 생리적인 원인보다는 진딧물에 의한 바이러스 이병에 의한 원인이 더 큰 것으로 판단되며 황화엽 증상의 피해와 확산을 줄이기 위해서는 바이러스 매개충인 진딧물을 사전에 방제하는 것이 좋을 것으로 판단된다. Melon leaves showing yellowing symptoms were analyzed using electron microscopy and RT-PCR for major cucurbit-infecting-viruses (CMV, MNSV, CGMMV, SqMV, WMV, KGMMV, PRSV and ZYMV) reported in Korea, but these viruses were not detected. As the result of further analysis by next-generation sequencing (NGS), the virus was identified as Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV), and then confirmed by RT-PCR using CABYV-specific primers. When photosynthetic capacity was measured based on chlorophyll fluorescence yield (ChlFY), the leaves of the diseased plants showed 4.09 μ㏖•m<SUP>-2</SUP>•s<SUP>-1</SUP>, which was one-third of the readings observed for unaffected normal plants (12.36 μ㏖•m<SUP>-2</SUP>•s<SUP>-1</SUP>). The root functions of plants affected by leaf yellowing symptoms (LYS) was 0.28 ㎎•g<SUP>-1</SUP>, about half that measured for the normal unaffected plants (0.48 ㎎•g<SUP>-1</SUP>). Cytological observations revealed that there were no morphological differences in the palisade parenchyma and mesophyll spongy cells of the leaves between the diseased and the normal plants. However, the same leaf cells of the affected plants contained more starch granules compared to those of the normal, unaffected plants. We conclude that the LYS of muskmelon is not merely a physiological disorder but a viral disease caused by CABYV and spread by aphids.

멜론의 황화엽 발생원인과 생육에 미치는 영향

이희주(Hee Ju Lee),김미경(Mi-Kyeong Kim),이상규(Sang Gyu Lee),최홍수(Hong-Soo Choi),최국선(Gug Seoun Choi),최장선(Chang Sun Choi),곽해련(Hae Ryun Kwak),전창후(Changhoo Chun) 한국원예학회 2014 한국원예학회 학술발표요지 Vol.2014 No.10