형질전환식물체 세대 간 항암단일항체 발현안정성

송미라(Mira Song),고기성(Kisung Ko) 한국원예학회 2007 원예과학기술지 Vol.25 No.3

본 실험은 형질전환된 담배로부터 세대가 거듭되더라도 항암 항체 유전자의 전달과 단백질의 발현에 변화가 없음을 확인하고자 수행되었다. 항암 항체 mAb CO17-1A를 발현하는 형질전환담배로부터 지속적인 자가수정을 통하여 얻은 씨앗에서 발아한 3세대와 4세대의 식물을 이용하였다. 형질전환된 담배 씨앗(3세대와 4세대)이 kanamycin이 포함된 배지에서 100% 발아 및 생장하는 것을 확인하였다. 이로써 3세대와 4세대 식물이 kanamycin에 내성이 있음을 알 수 있었으며, homozygous line임을 확인할 수 있었다. 약 16주 정도 키운 후 3세대와 4세대의 잎으로부터 genomic DNA를 추출하여 PCR을 수행한 결과 3세대 및 4세대의 식물에서 mAb CO17-1A의 중쇄(1.4kb)와 경쇄(0.7kb) 유전자가 모두 증폭됨을 관찰하였다. 즉, 세대가 거듭되더라고 유전자가 변이되지 않으며 안정하게 전이됨을 확인할 수 있었다. 또한 세대 번식을 통한 항체 단백질의 발현량을 확인하고자 3세대 및 4세대 식물의 잎으로부터 단백질을 추출하여 immunoblot을 수행한 결과 3세대 및 4세대 식물에서 중쇄(50kDa) 단백질이 동일한 density를 보였다. 이를 통해 세대가 거듭되더라도 항체를 생산하는 발현량에는 변화가 없음을 알 수 있었다. 위의 모든 결과를 바탕으로 형질전환 된 식물의 self-fertilization을 통하여 homozygous line의 세대번식이 이루어지며, 세대번식이 지속되더라도 그 유전자 및 발현량에는 변화가 없음을 확인할 수 있었다. Recent plant biotechnology and advanced molecular immunology have established plant biopharming system as an alternative way to produce immunotherapeutic monoclonal antibodies. This plant production system is considered to have several advantages in safety and economical issues compared to other production systems. In this study, we confirmed stable gene insertion and expression of anti-cancer monoclonal antibody (mAb CO17-1A) in transgenic plants through subsequent generation. T₃ and T₄ generation of transgenic seeds were obtained by self-fertilization of homozygous transgenic line of T₂ and T₃ generation, respectively. T₃ and T₄ seedlings showed 100% of germination and survival rate in MS media containing kanamycin whereas non-transgenic seedlings did not survive. PCR analysis showed that stable gene insertion of heavy and light chains of mAb CO17-1A in T₃ and T₄ transgenic plants. Immunoblot with densitometric analysis confirmed stable expression of mAb CO17-1A in both T₃ and T₄ transgenic plants. These results suggested that transgenes and expression of anti-cancer mAb CO17-1A are stably transferred and expressed in transgenic plants through subsequent generation by self fertilization, which is applicable to generate seed bank of homozygous transgenic line.

형질전환 식물체에서의 복합 단일 항체 단백질 생산

안미현(Mi-Hyun Ahn),오은이(Eun-Yi Oh),송미라(Mira Song),Zhe Lu,김현순(HyunSoon Kim),정혁(Hyouk Joung),고기성(Kisung Ko) 한국생명과학회 2009 생명과학회지 Vol.19 No.1

식물 생명공학 기술을 이용해 인간에게 유용한 치료단백질 및 백신을 생산하는 것은 최근에 각광받고 있는 연구 분야이다. 식물을 이용한 유용 단백질 생산은 다른 시스템에 비하여 경제적일 뿐만 아니라 병원성 인자에 대한 안전성이 있어서 유용하다고 할 수 있다. 암세포 표면에 특이적으로 발현하고 있는 분자 와 당 구조를 각각 인지할 수 있는 두 종류의 항체를 동시에 투여하는 면역 치료는 질병의 치료를 유도하는 데 있어서 효과적일 수 있다. 본 연구는 기존에 본 연구팀에서 확보하고 있었던 두 종류의 항체 단백질(mAb CO17-1A, mAb BR55) 생산 형질전환 식물체를 이용하여 상호교배를 통하여 한 식물에서 두 종류의 항체 단백질을 모두 생산하는 식물발현 시스템 구축에 관한 연구이다. 각기 다른 유전자를 갖고 있는 식물체로부터 수분을 유도하여 씨앗을 얻고 이 씨앗을 배양하여 완벽한 식물 개체로 성장시켰으며, 그 식물체로부터 DNA, RNA, 단백질을 분리하여 형질전환 유전자를 포함하고 있는지 여부를 확인하였다. 그 결과, 개체에 차이는 있지만, 한 식물에서 두 항체 유전자를 갖고 있음을 확인할 수 있었고, 이 유전자는 식물체 내에서 안정적으로 transcription 되었음을 확인하였다. 또한, 두 종류의 항체를 동시 생산하는 식물체에서 분리한 단백질은 한 종류의 항체 단백질만 생산하는 식물체에 비하여 수용성 단백질 단위당 항체 발현률이 높게 나타나는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구를 통하여 식물을 이용한 유용 단백질 생산 효율을 높일 수 있는 시스템을 확립하였으며 앞으로 추가적으로 생산한 항체의 생물학적 활성 및 항암 효능, 당 구조 분석 등에 대한 연구를 수행한다면, 식물생명공학적 방법을 통한 항체 생산에 대한 새로운 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. Production of highly valuable immunotherapeutic proteins such as monoclonal antibodies and vaccines using plant biotechnology and genetic engineering has been studied as a popular research field. Plant expression system for mass production of such useful recombinant therapeutic proteins has several advantages over other existing expression systems with economical and safety issues. Immunotherapy of multiple monoclonal antibodies, which can recognize multiple targeting including specific proteins and their glycans highly expressed on the surface of cancer cells, can be an efficient treatment compared to a single targeting immunotherapy using a single antibody. In this study, we have established plant production system to express two different targeting monoclonal antibodies in a single transgenic plant through crossing fertilization between two different transgenic plants expressing anti-colorectal cancer mAbCO17-1A and anti-breast cancer mAbBR55, respectively. The F1 seedlings were obtained cross fertilization between the two transgenic parental plants. The presence, transcription, and protein expression of heavy chain (HC) and light chain (LC) genes of both mAbs in the seedlings were investigated by PCR, RT-PCR, and immunoblot analyses, respectively. Among all the seedlings, some seedlings did not carry or transcribe the HC and LC genes of both mAbs. Thus, the seedlings with presence and transcription of HC and LC genes of both mAbs were selected, and the selected seedlings were confirmed to have relatively stronger density of HC and LC protein bands compared to the transgenic plant expressing only each mAb. These results indicate that the F1 seedling plant with carrying both mAb genes was established. Taken together, plant crossing fertilization can be applied to generate an efficient production system expressing multiple monoclonal antibodies for immunotherapy in a single plant.

핵산지문법을 이용한 새삼屬의 종(種) 식별에 관한 연구

진영준(Young Joon Jin),박상원(Sang Won Park),권용웅(Young Woong Kwon),이상재(Sang Jae Lee),문병철(Beyung Chul Moon),신중두(Joung Du Shin),고기성(Kisung Ko) 韓國雜草學會 2009 Weed&Turfgrass Science Vol.29 No.4

본 연구는 지역별로 수집한 우리나라에서 분포하는 새삼(C. japonica), 실새삼(C. australis), 개실샛삼(C. chinensis) 및 외래종인 미국실새삼(C. pentagona)을 대상으로 RAPD를 이용한 종 특이적 마커를 탐색하고 종식별을 위한 기초자료로 사용하기 위하여 실시 되었다. 41개의 Operon과 12개의 URP primer를 이용하고 PCR에서 새삼류 4종의 DNA를 증폭한 결과, 새삼류 4종에서 36개의 primer가 다형성을 보였고, 그 중 18개의 primer가 종 특이적 밴드 부분을 증폭시켜 동일 지역에서 수입된 개체간의 변이를 조사한 결과 같은 종내 변이는 크지 않은 것으로 확인되었다. 지역별로 수집된 새삼류 4종의 유연관계를 조사한 결과 4개의 그룹으로 구분할 수 있었는데, 남원, 대전, 전주에서 수집된 C. pentagona와 화순에서 수집된 C. chinensis가 속하는 그룹 A와 담양1, 담양2, 천안, 양평, 칠곡, 수원에서 수집된 C. pentagona 및 여수에서 수집된 C. australis가 속하는 그룹 B로 구분할 수 있었다. 그리고 여수, 영주, 중국에서 수집된 C. japonica의 그룹 C와 중국에서 수집된 C. reflexa가 속하는 그룹 D로 구분되었다. 13개의 primer를 이용하여 C. japonica, C. chinensis, C. reflexa 및 C. pentagona에서 각각 7, 5, 7, 2개의 종식별을 위한 특이적 마커를 찾을 수 있었으며, OPS08과 OSP09가 종식별에 가장 효율적인 Primer이었다. Dodder (Cuscuta spp.) is a very important holoparasitic weed in plant quarantine and weed control. In Korea, C. japonica, C. australis and C. chinensis are spontaneous and weed control. In Korea, C. japonica, C. australis and C. chinensis are spontaneous, but recently, C. pentagona, exotic species, was found. Correct identification of the dodder species by morphological characteristics of seed in quarantine is very difficult. Also, species identification of dodders growing in fields is delayed until dodder plants flower. Objective of this experiment was conducted to develop a reliable method of DNA fingerprinting for species identification with seeds and seedlings. The results are summarized as follows. Seeds of five dodders, i.e., C. australis, C. chinensis, C. japonica, C. pentagona and C. reflexa were used for species identification by DNA fingerprinting. Forty one Operon primers and TakaRa Taq DNA Polymerase (5U ㎕-1) were used to be tested. Consequently 36 primer’s showed polymorphism in dodder accessions and 18 primers generated the species-specific bands. For the individual variation within a species in dodder seeds the plant samples were collected from the same area was low except for C. pentagona. Thirteen primers among the 18 primers were used for analysis of inter-specific variation. Overall it was considered that the tested accessions were classified into 4 groups; group A of C. pentagona (Namwon, Daejeon, Jeonju) and C. australis (Hwasun), group B of C. pentagona (Damyang1, Damyang2, Chonan, Yangpyong, Chilgok, Suwon) and C. chinensis (Yeosu), group C of C. japonica (Yeosu, Yongju, China), and group D of C. reflexa (China). The C. japonica-specific 7 bands, the C. chinensis-specific 5 bands, the C. reflexa-specific 7 bands and the C. pentagona-specific 2 babds were identified. As a results, two Operon primers, OPS08 and OPS09, showed sufficient availability for species identification of different dodders.

식물 및 곤충세포 발현시스템을 이용한 암 진단 및 치료용 항체 생산

이정환(Jeong-Hwan Lee),김득수(Deuk-Su Kim),이재혁(Jaehyouk Lee),명순철(Soon-Chul Myung),황경아(Kyung-A Hwang),추영국(Young-Kug Choo),고기성(Kisung Ko) 대한비뇨기종양학회 2012 대한비뇨기종양학회지 Vol.10 No.2

Therapeutic proteins can prevent or treat wide ranges of diseases from cancer and viral or bacterial infections. Production of the therapeutic proteins has been well established mainly in mammalian and bacterial cells including transgenic organisms by recombinant DNA techniques. Recent plant and insect biotechnology and advanced molecular immunology have established molecular biofarming system as an alternative way to produce recombinant pharmaceutical proteins such as immunotherapeutic monoclonal antibodies (mAb). The plants and insects as an expression system have several advantages, which include the lack of animal pathogenic contaminants, low cost of production, and ease of agricultural scale-up compared to other currently available systems. Thus, the paradigm of plant is being shifted as a food source to so-called plant bioreactor for production of therapeutic proteins. Currently, we have successfully developed a plant and insect cell expression system for production of anti-cancer and anti-virus monoclonal antibodies. The effective heterologous production system for recombinant therapeutics requires the appropriate expression machinery with optimal combination of transgene expression regulatory conditions such as control of transcriptional and post transcriptional events. In this paper, the possibility of targeting proteins to the ER and possibly storing them to the protein storage vacuoles with glycosylation modification are discussed in plant and insect cells.