Characterization of Ovarian Cytochrome $P450_{C17}$ (17 ${\alpha}-hydroxylase$/17,20-lyase) in Rana dybowski

강해묵,Kang, Hae-Mook The Korean Society of Developmental Biology 2006 발생과 생식 Vol.10 No.2

스테로이드 합성효소 중 $17\;{\alpha}-hydroxylase/17,20-lyase(P450_{C17})$는 progesterone을 $17\;{\alpha}-hydroxyprogesterone$을 거쳐 androstenedione으로 변환을 담당하는 효소이다. 양서류 난소에서 스테로이드 합성의 분자적 조절과정의 연구에 사용할 목적으로 북방산 개구리(Rana dybowskii) 난소에서 $P450_{C17}$ cDNA를 클로닝 하였다. 북방산 개구리 난포세포의 cDNA library 검색을 통해 분리된 약 2.5kb의 cDNA는 529개의 아미노산을 가진 단일 번역틀을 가지고 있었다. 개구리 $P450_{C17}$의 아미노산 서열은 Xenopus와는 76%, 닭과는 63%, 그리고 사람과는 약 45%의 동일성을 보여 주였고, 동시에 진화적으로 척추동물에서 매우 잘 보존된 아미노산 서열을 가지고 있었다. 노던 분석에서 개구리의 $P450_{C17}$ 전사체는 난소에서만 2.5kb와 3.6kb 크기의 두 종류가 발견되었다. 그리고 개구리 Rana $P450_{C17}$ cDNA는 비스테로이드 합성 세포인 COS-1세포에서 분명한 $17\;{\alpha}-hydroxylase/17,20-lyase$ 활성을 주었다. 따라서 클로닝된 개구리 $P450_{C17}$ 유전자는 양서류의 난소에서 스테로이드 합성의 분자적 기작을 연구하는데 매우 유용할 것으로 사료된다. [ $17\;{\alpha}-hydroxylase/17,20-lyase(P450_{C17})$ ] is the key enzyme mediating the conversion of progesterone to $17\;{\alpha}-hydroxyprogesterone$, ultimately to androstenedione during steroidogenesis. R. dybowskii's ovarian $P450_{C17}$ cDNA was cloned to understand the regulatory mechanism of ovarian steroidogenic pathway at the molecular level in amphibian. A 2.5kb cDNA clone encoding a single open-reading frame with a 519 deduced amino acid was isolated with the screening of ovarian cDNA library. This sequence contained the three highly conserved domains as seen in $P450_{C17}$ of other species. The comparison of amino acid sequence of Rana $P450_{C17}$ with other animal's $P450_{C17}$ showed relatively high identity with 76% in Xenopus, 63% in chicken, 60% in rainbow trout, and 45% in human. Phylogenic analysis also indicated that Rana $P450_{C17}$ gene was evolutionary well conserved among vertebrate. Northern analysis indicated that the two different sizes of $P450_{C17}$ transcripts with approximately 2.5 and 3.6kb were detected in ovary tissue, but not in other tissues. The expression vector of Rana $P450_{C17}$ clearly showed the $17\;{\alpha}-hydroxylase$ activity converting the exogenous progesterone into $17\;{\alpha}-hydroxyprogesterone$ in the nonsteroidogenic COS-1 cells. Therefore, Rana $P450_{C17}$ cDNA is very useful to investigate the molecular mechanism of the ovarian steroidogenesis in amphibian.

Zygotic Expression of c-myc Gene in Mouse Early Embryos: Functional Role of c-myc Promoter

박기수,강해묵,심찬섭,선웅,김재만,이영기,김경진,Park, Ki-Soo,Kang, Hae-Mook,Shim, Chan-seob,Sun, Woong,Kim, Jae-man,Lee, Young-Ki,Kim, Kyung-jin The Korean Society for Integrative Biology 1995 동물학회지 Vol.38 No.4

c-myc proto-oncogene은 여러 세포들의 분화와 형질전화에 뿐만 아니라 정상세포의 분열조절에도 관여한다고 알려져왔다. 특히 생쥐의 초기배아에서 c-myc mRNA가 발현되고 antisense c-myc oligomer의 미세주입에 의해 배발생이 억제된다는 연구결과는 c-myc이 초기배아의 발생 및 분열에 관여하는 것을 시사한다. 그러나 최근까지 초기배아에 존재하는 c-myc promoter의 기능적 활성화에 관한 연구는 미진하였다. 이를 위하여, c-myc promoter와 대장균의 lacZ 유전자를 결합시킨 두 종류의 vector(pcmyc-Gall, pcmyc-Ga12)를 만들어 수정란의 전핵에 미세주입한 후, 배 발생에 따른 c-myc promoter의 활성화를 lacZ 유전자의 산물인 $\beta$-galactosidase 에 의한 X-gal 염색으로 조사하였다. 미세주입된 초기 배아는 2세포기 배아를 포함하는 여러 발생단계에서 $\beta$-galactosidase 의 활성을 보였다. 이는 c-myc 유전자가 배아의 게놈유전자로부터 발현되며, 또한 궁극적으로 초기 배아의 발생과정에 중요한 역할을 하고 있음을 시사하고 있다. The c-myc proto-oncogene is Involved In the control of normal cell proliferation and differentiation of many cell lineages. Although it has heen suggested that c-myc may play an important role in the mammalian early development, it Is unclear whether the embryonic c-myc mRNA is originated from zygotic gene expression or stored maternal message. Thus, we have construded expression vectors, In which the 5, flanking sequences including c-myc promoter region and a large non-coding exon I are fused 'sith E. coli lacZ gene that encedes $\beta$-galactosldase as a reporter. As c-myc exon I contains a modulatory sequence, we designed t, vo types of vectors (pcmyc.Gall and pcmyc-Ga12) to examine the role of exon I in c-myc expression. The former contains the complete exon I and the later has a deletion in 40 bp of modulator sequence located In the exon I of c-myc These vectors were microInjected into fertilized one-cell embryos and $\beta$-galactosidase activity was examined by X-gal staining during early embryogenesis. $\beta$-galactosidase activity derived from c-myc promoter was decreased at two-cell stage. The expression level directed by pcmyc- Ga12 was similar to that of pcmyc-Gal1, indicating that the medulatory sequence in exon I may not be Involved at least In the regulation of embryonic c-myc expression. In summary, the present study indicates that the c-myc promoter is functional at the early stage embryo, and the regulation of c-myc expression is under the control of "zygotic" clock of preimplantation mouse embryos.e embryos.

Circadian Expression of Cryptochrome in Rat Brain and Muscle

Kang, Hae Mook 청주대학교 산업과학연구소 2006 産業科學硏究 Vol.23 No.2

포유류의 일주기 조절에는 두 종류의 cryptochrome(Cry1과 Cry2)이 관여하는 것으로 알려져 있다. 흰쥐에서 Cry1과 Cry2 유전자의 일주기적인 발현을 suprachiasmatic nucleus(SCN)조직과 근육 조직에서 real-time PCR로 조사하였다. SCN 조직에서 Cry1과 Cry2의 발현 정도는 밤낮의 변화에 따른 일주기적인 리듬을 보여주고 있다. 근육 조직 또한 SCN과는 약간 다르지만 분명하게 Cry1과 Cry2의 일주기적인 발현을 하고 있다. 따라서 이 결과는 Cry1과 Cry2가 SCN 조직에서 중추적인 생체시계와 근육조직에서 말단 생체시계의 역할을 하고 있음을 강력히 시사하고 있다. In mammals, two types of cryptochrome (Cry1 and Cry2) are known to involve in the regulation of circadian rhythm. Circadian expression of rat Cry1 and Cry2 mRNA was examined in suprachiasmatic nucleus (SCN) and muscle tissues by real-time PCR. The expression level of Cry1 and Cry2 mRNA in SCN showed circadian rhythm with a peak at the time of day/night transition. Muscle also exhibited the circadian pattern of the expression of Cry1 and Cry2 mRNA at slightly different with that of SCN. It is, therefore, strongly suggested that Cry1 and Cry2 play an important role in central clock of SCN and peripheral clock in muscle.

형광단백질이 첨부된 GABAB 수용체의 제조 및 발현

강해묵 청주대학교 2007 産業科學硏究 Vol.25 No.1

GABAB receptors are the G-protein coupled receptors for the main inhibitory neurotransmitters in the brain, and require 2 distinct subunits for functioning. This atypical receptor structure is a barrier for investigating the regulation of receptor assembly and trafficking, and elucidating the action mechanism of neuronal modulation in the neuron. It needs to develop a proper GABAB receptor expression vector for persuade the heterogenous dimerlization in the inside of neurons. Thus, the living fluorescent protein, super-ecliptic pHluorin (SEP) tagged GABAB receptor cDNA expression vector was constructed and showed it's successful expression in the COS cells.

Cloning of cyclin cDNA involved in control of cell cycle in amphibian

Kang, Hae Mook 청주대학교 산업과학연구소 1998 産業科學硏究 Vol.16 No.-

세포주기 연구를 위한 한 모델로에서 양서류 난자성숙과정은 많이 얀구되어 왔다. 본 연구는 독특한 난자성숙 기작을 보여주는 북방산 개구리 (Rana dybowskii) 난자에서 MPF의 분자적 특성을 밝히고자, 먼저 MPF의 한 성분인 cyclin B1 유전자를 클로닝 하였다. 이미 밝혀진 척추동물의 cyclin B 유전자의 보존된 염기서열에 기초하여 올리고염기를 제작하여 RT-PCR를 북방산 개구리의 개놈 DNA 라이버리에서 행하였다. 그 결과 약 300bp의 DNA 조각을 얻었고, 이의 염기서열을 결정하고 분석한 결과 사이클린 B1 유전자임 밝혀졌다. Northern 분석 결과 cyclin B1 유전자의 전사크기는 약 1.6 kb인 것으로 추정되고, 주로 난소나 정소와 같은 생식소에서 발현되는 것을 알수가 있었다. 이상의 연구 결과 북방산 개구리의 난자에 MPF가 존재함을 추정할 수가 있고, 이는 계절적인 번식을 하는 동물의 세포주기를 밝힐 수 있는 분자적 단서를 제공하는 것으로 사료된다. To understand the mechanism of meiotic maturation as a model of cell cycle study, it needs the characterization of MPF and regulation mechanism of MPF activation in R. dybowskii. To clone a cyclin cDNA from R. dybowskii ovary cDNA library, polymerase-chain reaction (PCR) was performed with degenerate oligonucleotides based on the conserved sequence of vertebrate cyclin B genes. As a result of PCR, about 300 bp DNA fragment was amplified Sequencing and Blast search indicated that it encodes of cyclin Bl gene of Rana. Northern blot showed that a single band of 1.6 kb was detected in both of ovary and testis tissues. It, therefore, indicate that a partial fragment of cyclin Bl cDNA was cloned, and mainly expressed in gonadal tissues in Rana dybowskii. It Is also feasible to reveal the character and molecular structure of MPF involved control of cell cycle in seasonal breeding amphibian.

Comparative Study on the Molecular Evolution of GnRH Gene in Amphibia

Kang, Hae Mook 청주대학교 산업과학연구소 2000 産業科學硏究 Vol.18 No.1

양서류에서 GnRH 유전자의 분자적 진화과정을 연구하기 위해, 북방산 개구리 (Rana dybowsku)와 황소개구리 (Rana catesbeiana)에서 GnRH 전구체의 유전자를 클로닝하였다. 북방산 개구리의 GnRH cDNA는 90개의 아미노산을 가진 약 500 bp였다. 추정된 GnRH 분자는 8번째 아미노산이 tryptophane인 새로운 형태의 GnRH였다. 황소개구리의 GnRH cDNA는 약 648 bp로 구성되어 있으며, 270 bp로 된 하나의 open-reading frame을 가지고 있다. 추정된 황소개구리의 GnRH 분자는 포유류의 GnRH와 동일하였다. 이들 개구리의 GnRH 전구체들은 서로 높은 동질성을 보여주고 있으며, 반면에 다른 척추동물의 GnRH 분자와의 동질성은 낮았다. 따라서 양서류 GnRH는 어류에서 진화되었음을 알 수가 있었다. To study the molecular evolution of GnRH cDNA in amphibian, cDNAs encoding the GnRH precursors were isolated from Korean name frog (Ram dybowsku) and bullfrog (Rana catesbeiana). The GnRH cDNA of R dybowsku consists of 506 bp and contains an open-reading frame of 270 nucleotides, encoding the GnRH precursor. The GnRH gene encodes a GnRH peptide ([Trp8]GnRH) in which tryptophan is substituted for arginine of mammalian GnRH. The bulfrog GnRH cDNA consists of 648 bp and contains an open-reading frame of 270 nucleotides, encoding the GnRH precursor Both types of frog GnRH precursor have a similar molecular architecture as observed in other GnRH precursors, consisting of a signal peptide, followed by the GnRH decapeptide, a conserved carboxy-terminal amidation and proteolytical processing site, and a GnRH-associated peptide (GAP). Molecular phylogenic analysis reveals that the cloned frog GnRH precusors clearly belongs to the hyptothalamic GnRH Frog GnRH precusors shows a relatively high homology among them, but a less homology with other vertebrates.

Molecular Characterization of Amphibian Cryptochrome cDNA as A Clock Gene

Kang, Hae Mook 청주대학교 산업과학연구소 2002 産業科學硏究 Vol.20 No.1

Cryptochrome은 DNA photolyase/flavoprotein 중 하나로 최근 사람을 포함하는 모든 동식물의 24시간 생체주기를 조절하는 광수용체로 알려졌다. 본 논문에서는 양서류에서 Cryptochrome(CRY) cDNA를 클로닝하여 특성을 분석하였다. 먼저 황소개구리의 뇌에서 RNA를 추출한 후 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성한 후 Cryptochrome 유전자의 degernerate primer들을 사용하여 442 bp크기의 cry2 cDNA 단편을 증폭시켰다. 이 cDNA 단편을 probe로 사용하여 황소개구리 뇌의 cDNA library screening을 한 결과 완전한 크기의 Rana cry2 cDNA를 분리하였다. 클론된 Rana cry2는 1916bp로 염기서열에 기초한 추정된 아미노산 서열은 534개였다. 다른 종의 CRY 단백질과 비교한 결과 약 70% 이상의 높은 동일성을 보여주었다. 따라서 양서류의 cry2 유전자는 성공적으로 클로닝 되었음을 알 수가 있었고, 앞으로 개구리와 같은 야생동물의 24시간 생체주기와 관련된 생리적인 특성을 규명하는 데 이 유전자는 매우 유용할 것으로 사료된다. Cryptochromes (CRY), members of the DNA photolyase/cryptochrome flavoprotein family, regulate the circadian clock in animals and plants. Recently, two cryptochromes, called CRY1 and CRY2, have been isolated in human and mouse. In this paper, to study circadian rhythm in amphibian, cry cDNA in bullfrog (Rana catesbeiana) has been identified and characterized. Firstly, a size of 1916 bp cDNA of Rana cry2 were isolated from bullfrog's brain cDNA library by screening with a partial cry cDNA probe of 442 bp, which obtained by PCR amplification with degenerate primers. The cloned bullfrog cryptochrome cDNA has a complete single open reading frame composed of 543 amino acid. The Blast-search of the deduced amino acid sequence exhibited high homology more than 70 % in human, mouse, and zebrafish CRY2. Taken together, Rana cry2 cDNA has been successfully cloned and it will be very helpful to study the clock genes and the circadian rhythm in wild animal.

Effect of Estrogen on the Gestational Profiles in Gene Expression of Placental Lactogen Ⅰ,Ⅱand Pit-1 in the Rat Placenta

Jeong, Jin Kwon,Kang, Sung Goo,Kang, Hae Mook,Lee, Byung Ju 한국동물학회 1996 동물학회지 Vol.39 No.1