두종의 Bacillus thuringiensis 내독소단백질 유전자의 융합에 의한 발현

諸蓮鎬,金尙賢,金祜山,柳鏞萬,徐淑才,姜錫權,趙鏞涉 한국잠사학회 1993 한국잠사곤충학회지 Vol.35 No.1

Expression of insecticidal protein by fusion product of truncated HD-1 [CryIA(a)] N-terminal and HD-73 [CryIA(c)] C-terminal fragment of Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki was investigated. Immunological analysis of transformants by using polyclonal antisera raised against the whole-crystal protein of HD-1 revealed that SK4 and SK5 were observed cross-reaction with polypeptides of 77-kDa and 105-kDa, respectively. Bioassay of the transformant pSK5 to Plutella maculipennis and Heliothis assulta were 96% and 97%, respectively.

Construction of a Novel Recombinant Baculovirus Producing Polyhedra with a Bacillus thuringiensis Cry1Ac Crystal Protein

제연호(Yeon Ho Je),진병래(Byung Rae Jin),노종열(Jong Yul Roh),장진희(Jin Hee Jang),강석권(Seok Gwon Kang) 대한바이러스학회 1999 Journal of Bacteriology and Virology Vol.29 No.3

We have now constructed a novel recombinant baculovirus Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) producing polyhedra with Bacillus thuringiensis (Bt) CryIAc crystal protein. The recombinant polyhedra produced by the recombinant baculovirus, Btrus, in insect cells was characterized. The recombinant baculovirus has two independent transcription units in opposite orientations with two promoters, p10 or polyhedrin gene promoter each initiating transcription of either native polyhedrin or fusion protein with polyhedrin and Bt CrylAc crystal protein. Surprisingly, this recombinant baculovirus stably produced recombinant polyhedra which were nearly similar to those of wild-type AcNPV. The immunogold staining experiment showed that the recombinant polyhedra were assembled with polyhedrin and Bt Cry1Ac crystal protein, and contained virus particles. Insecticidal toxicity of recombinant polyhedra of Btrus to the faU webworm, Hyphantria cunea, was strikingly improved in comparison with the wild-type AcNPV.

국내에서 분리한 누에핵다각체병바이러스의 유전적 계통에 따른 게놈 염기서열 비교 분석

허원일,최재방,배성민,신태영,이준범,제연호,진병래,우수동 한국응용곤충학회 2012 한국응용곤충학회 학술대회논문집 Vol.2012 No.05

누에핵다각체병바이러스 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)는 나 비목 곤충을 감염시키는 대표적인 핵다각체병바이러스 중 하나이다. 이 바이러스 는 1970년대 말 증식이 가능한 배양세포계가 확립되고 유전공학의 발달에 의해 분 자유전학적 연구가 활발히 진행되고 있으나 국내에서는 유전자 분석에 대한 연구 가 미미한 실정이다. 그리하여 본 연구에서는 국내에서 분리된 BmNPV-K1, K4, K5 strain의 전체 염기서열을 분석하고 바이러스 간의 근연관계를 알아보았다. 그 결과, BmNPV-K1의 전체 염기서열은 126,747 bp로 이루어져 있었고 131개의 open reading frame (ORF)를 가지는 것으로 예측되었다. 반면, BmNPV-K4와 K5 는 각각 128,618 bp, 127,554 bp로 이루어졌고 134개, 133개의 ORF를 가지는 것으 로 예측되었다. 대부분의 ORF는 높은 상동성을 보였으나, 흥미롭게도 baculovirus repeated ORFs (bro) gene의 보유에 따라 전체 ORF의 수가 다르게 나타났다. 또한, 근연관계를 알아보기 위해 계통분석을 수행한 결과 가까운 근연관계를 보였으나, BmNPV-K1, K4, K5는 같은 지질학적 위치나 곤충 기주를 가지고 있는 바이러스 임에도 불구하고 다른 유전형을 가지는 것으로 확인되었다.

곤충바이러스를 이용한 돼지 생식기호흡기증후군바이러스 항원단백질의 발현 특성

오정미,배성민,구현나,최재영,이광식,노종열,제연호,진병래,유성식,김재수,김영인,윤인준,우수동 한국응용곤충학회 2009 한국응용곤충학회 학술대회논문집 Vol.2009 No.05

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)는 당단백질(GP)2, 3, 4, 5, 및 막단백질(M), 그리고 뉴클레오캡시드(N) 등 6개의 구조단백질을 내포하고 있 으며 이들은 각각 ORF2-7 으로부터 암호화된다. 본 연구에서는, 누에 핵다각 체병 바이러스(BmNPV)의 다각체 단백질 프로모터와 6개의 히스티딘 단편이 부착된 새로운 전이벡터인 pBmKSK4를 제작하여 각각의 구조단백질을 발현 시켰다. 목적유전자와 재조합된 전이벡터는 Bm5 세포에 bBpGOZA와 cotransfection 시킨 후, 순수 재조합 바이러스를 정제하여 사용하였다. 발현된 각각의 단백 질은 SDS-PAGE 분석 및 항-히스티딘 항체와 PRRSV 항체를 사용한 Western blot 분석으로 확인하였다. 그 결과, N 단백질만이 SDS-PAGE 상에서 발현이 가능하였고 나머지 구조 단백질은 항체수준에서만 발현을 확인할 수 있었다. 그러나 GP5는 다른 단백질에 비해 발현이 매우 저조하게 나타났는데, 그 이 유는 GP5 단백질의 Bm5 세포에 대한 독성으로 추정되었다. 각 단백질 발현 율의 향상을 위해 SUMO 유전자를 도입한 결과, 항원단백질의 발현율이 기존 보다 높아짐을 알 수 있었다. 이와 같이, 베큘로바이러스를 이용한 각 구조단 백질의 높은 발현은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 효과적인 백신 개발 가능성을 시사해준다.

베큘로바이러스 발현계를 이용한 돼지콜레라 바이러스의 항원유전자 gE2의 발현 특성

배성민,오정미,구현나,최재영,이광식,노종열,제연호,진병래,유성식,김재수,김영인,윤인준,우수동 한국응용곤충학회 2009 한국응용곤충학회 학술대회논문집 Vol.2009 No.05

돼지 콜레라 바이러스(CSFV)는 Flaviviridae과, Pestivirus속으로 세가지 구조 유전자인 gE0, gE1 및 gE2 그리고 비구조 유전자로 이루어져 있다. 본 연구에 서는 세가지 구조유전자 중 표면항원으로써 기능이 가장 좋아 백신으로써 많 은 개발이 이루어지고 있는 gE2의 구조분석 및 베큘로바이러스를 이용하여 그 발현을 확인하였다. CSFV로부터 gE2를 클로닝 하고 염기서열 및 아미노산 서열을 분석한 결과, 기존에 보고된 돼지콜레라 바이러스의 다른 계통과 약 96%이상의 비교적 높은 상동성을 나타내었다. AcNPV 전이벡터를 이용하여 gE2를 가진 재조합 바이러스를 제작하고 SDS-PAGE 및 Western blot 분석으로 그 발현을 확인한 결과, 목적단백질은 Western blot 분석에서만 접종후 3일째 부터 발현이 확인되어 5일째 최대 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 발현 수준을 향상시키기 위하여 목적단백질의 발현 환경 조건인 세포주와 세 포배지를 교체하였을 때 어떠한 양상을 나타내는지 조사하였다. 그 결과 High-Five 세포에서 가장 높은 발현 수준을 나타내었고 배지에서는 혈청 배지 인 TC-100 곤충배지와, Grace's Insect Media에서 가장 높은 발현 수준을 나타 내었다. 이와 같이, 베큘로바이러스를 이용한 각 구조단백질의 발현은 돼지 콜레라 바이러스의 효과적인 백신 개발 가능성을 시사해준다.

베큘러바이러스 다각체 단백질과 부분 융합에 의한 돼지 써코바이러스 2형 구조단백질의 재조합 발현

이준범,배성민,김희정,최재방,신태영,제연호,진병래,우수동 한국응용곤충학회 2012 한국응용곤충학회 학술대회논문집 Vol.2012 No.05

돼지 써코바이러스 2형(porcine circovirus type 2)은 단일가닥 원형DNA바이러 스이며 돼지에 심각한 질병을 일으키는 돼지이유자돈전신성소모성 증후군의 주요 한 인자로 알려져 있다. 돼지 써코바이러스 2형은 2개의 주요한 ORF를 가지고 있 으며 ORF1은 바이러스의 복제, ORF2는 캡시드단백질의 형성에 관여한다. 이 중, ORF2의 해독에 의해 생성된 캡시드단백질은 바이러스의 구조형성 뿐만 아니라 항 원단백질로써 알려져 있으며, 이에 따라 본 연구에서는 베큘러바이러스 다각체 단 백질과 부분 융합에 의한 돼지 써코바이러스 2형 구조단백질의 재조합 발현을 확 인하였다. 발현된 단백질은 SDS-PAGE 상에서 분석하였고, 항-돼지 혈청, 항 -PCV2 ORF2 단일항체 그리고 히스텍 항체를 사용하여 Western blot 분석으로 확 인하였다. 그 결과 재조합 단백질은 재조합 바이러스 접종 후 2일째부터 발현이 나 타나며 4일째 최대 발현하는 것을 확인하였다. 또한 다각체 단백질과 부분 융합한 바이러스는 비융합 바이러스보다 재조합 단백질 생산이 증대 되었으며, 이는 다각 체 단백질과 부분 융합을 이용한 돼지 써코바이러스 2형 구조단백질 ORF2의 발현 을 향상 시킬 수 있음을 보여준다.

국내에서 분리한 미국흰불나방 과립병바이러스의 전체 게놈 염기서열 분석

최재방,허원일,배성민,신태영,이준범,제연호,진병래,우수동 한국응용곤충학회 2012 한국응용곤충학회 학술대회논문집 Vol.2012 No.05

미국흰불나방은 가로수에 커다란 피해를 주고 있는 해충으로, 우리나라에서는 연간 2회 발생한다. 우리나라 곤충바이러스 연구는 1974년 미국흰불나방 (Hyphantria cunea)에서 베큘로바이러스(baculovirus)를 분리하여 병원성이 높은 것을 확인하면서 해충 종합적 방제를 위해 연구가 시작되었다. 본 연구에서는 미국 흰불나방 자연 사충으로부터 과립병바이러스(granulovirus)를 분리하고 바이러스 의 특성을 이해하기 위해 게놈 분석을 시행하였다. 미국흰불나방 과립병바이러스 의 전체염기서열의 분석은 454 pyrosequencing 방법을 이용하였고, 크기는 114.556bp 로 판명되었다. 또한 G+C 함량은 전체염기서열의 39.30 %를 차지하였 고, 130개의 open reading frame (ORF)를 갖는 것으로 나타났다. 130개의 ORF 중 106개의 ORF가 기존에 보고된 베큘로바이러스와 상동성을 갖는 것으로 확인되었 다. 기존에 전체염기서열이 분석된 다른 베큘로바이러스들과 계통분석을 수행한 결과, 과립병바이러스 중 씨자무늬거세미방나방 과립병바이러스와 근연관계를 갖는 것으로 확인되었다.

형질전환체, Bacillus thuringiensis PT0529 내에서 세가지 내독소 단백질 유전자들의 발현 특성

박현우,제연호,진병래,서숙재,강석권 한국잠사학회 1995 한국잠사곤충학회지 Vol.37 No.2

To characterize expression and formation of three type crystal proteins in transformant, Bacillus thuringiensis PT0529 was analysed by transmission electron microscope and SDSPAGE according to growth. The results showed that the introduced crystal protein genes, cryIVD and cytA, were well expressed at earlier stage than resident crystal protein gene of B. thuringiensis NT0423, and the formation of three-type crystal proteins were also expressed with their own morphology. However, resident crystal protein of B. thuringiensis PT0529 was smaller than that of wild type B. thuringiensis NT0423, suggesting that resident crystal protein production was interfered with introduced two type crystal protein genes.

Bombyx mori 세포주와 Spodoptera frugiperda 세포주의 분자생물학적 표식자

진병래,제연호,강석권 한국잠사학회 1996 한국잠사곤충학회지 Vol.38 No.1

To investigate the molecular biological marker in insect sells, BmN-4 and Sf-9 cells were analysed by SDS-PAGE and random amplification of polymorphic DNA. The results showed that the pattern of total cell protein and random amplification of polymorphic DNA were distinguished between BmN-4 and Sf-9 cell, suggesting that the unique major bands were useful as molecular biological marker in BmN-4 and Sf-9 cells.

Parasitism of Cotesia spp. Enhances Susceptibility of Plutella xylostella to Other Pathogens

정성채,제연호,김용균,권민,최재영 한국응용곤충학회 2006 Journal of Asia-Pacific Entomology Vol.9 No.3

Two endoparasitoids, Cotesia plutellae and C. glomerata, parasitize the diamondback moth, Plutella xylostella, and induce significant host immunosuppression. This study analyzed the susceptibility changes of the parasitized P. xylostella against other pathogens using an entomopathogenic bacterium, Xenorhabdus nematophila (Xn), and a viral pathogen, Autographa californica nucleopolyhedrosis virus (AcNPV). The P. xylostella parasitized by either C. plutellae or C. glomerata exhibited higher susceptibilities to both microbial pathogens than the nonparasitized. To determine the parasitism factors inducing the enhanced susceptibility, three polydnaviral genes so far successfully cloned were selected from C. plutellae bracovirus (CpBV). CpBV-lectin and CpBV15α/β were inserted into AcNPV under a CpBV promote and analyzed in their pathogenicities against P. xylostella larvae. Two AcNPVs recombined with CpBV15α/β were more potent than the control AcNPV recombined with an enhanced green fluorescent protein gene or the AcNPV recombined with CpBV-lectin. These results suggest that the wasp parasitization enhances other pathogen susceptibilities by inducing host immunosuppression, in which the symbiotic polydnavirus can play significant role in the enhanced susceptibility.