대량 모근 시료 DNA 분리 체계 확립과 11 microsatellite maker를 사용하는 한우 생산이력제로의 적용가능성 검증

임현태,이상호,유채경,선두원,조인철,윤두학,양대용,정일정,이정규,전진태 경상대학교 농업생명과학연구원 2010 농업생명과학연구 Vol.44 No.6

한우 이력추적제에 적용되는 11개의 MS marker (TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115, TGLA126, TGLA122, ETH3, ETH225, BM1824 and INRA23)와 성감별을 위한 2개의 sexing primer로 조합된 하나의 Multiplex PCR set를 이용하여 모근에서 추출한 genomic DNA를 이용해 3510두의 대량 시료를 분석한 결과 3.93%의 genotyping 실패율로 성공적인 분석결과를 얻었다. 무작위교배집단으로 가 정 시 동일개체출현확률 (PI)은 1.31×10-23, 반형매교배집단으로 가정 시 동일개체출현확률 (PIhalf-sibs)은 2.52×10-16 그리고 전형매교배집단으로 가정 시 동일개체출현확률 (PIsibs)은 1.09×10-6으로 나타나 현재 사용 중인 11종의 MS marker는 범용적으로 사용하여도 무방할 것으로 재확인 되었다. 또한 생산 및 사 육단계의 생우의 경우 모근을 이용하여 DNA를 추출하는 것은 시료 채취 시 소에게 주어지는 스트레스를 최소화 시킬 수 있을 뿐만 아니라 대립유전자형 분석에 있어서 시간적, 경제적인 효율성을 높일 수 있었 다. 또한 모근 채취 부위 중 등, 배, 꼬리상부와 꼬리하부를 이용하여 검정한 결과 꼬리하부의 모근을 이 용하여 5~13가닥을 사용했을 때 최적의 분석결과를 보였다. 최종적으로 한우의 사육단계 대량 유전자형 분석에 적용 가능한 96 well 단위를 기본으로 하는 모근 DNA분리 체계를 확립하였다. We used a multiplex PCR primer set composed of 11 microsatellite (MS) markers and two sexing markers for gender detection. Genomic DNA extracted from hair roots of 3,510 Hanwoo were genotyped. Based on the 11MS markers, no animals had identical genotypes(TGLA227, BM2113, TGLA53, ETF10, SPS115, TGLA122, ETH3, ETH225, BM1824 and INRA23). The expected probability of identity among genotypes of random individuals (PI), the probability of identity among genotypes from random half-sibs (PIhalf-sibs) and among genotypes of random individuals, and the probability of identity among genotypes from random sibs (PIsibs) were estimated as 1.31×10 -23 , 2.52×10 -16 and 1.09×10 -6 , respectively using the API-CALC program, version 1.0. We successfully completed the genotype analysis of 3,510 Hanwoo with a 3.93% genotyping failure rate. It was revealed that extracting DNA from the hair root was a time-efficient and cost-effective method to collect specimens for DNA isolation from live animals. This method also minimized stress for the animals during specimen collection. Among the hair roots from the back, belly, upper tail and lower tail, 5~13 hair roots of the lower tail led to the best genotype analysis results. Finally, we established a 96-well-format method of DNA preparation applicable for high- throughput genotype analysis.

흑피부색 돼지의 착색 원인 규명을 위한 MC1R , KIT 및 ASIP 유전자 분석

박경옥,정은지,이재봉,박희복,유채경,이정규,임현태 경상대학교 농업생명과학연구원 2013 농업생명과학연구 Vol.47 No.1

일반적으로 돼지는 어떤 종류의 모색을 가지든 피부는 연분홍색을 띄는 것으로 알려져 있으나, 경 남 김해 H 육가공회사로 출하된 개체 중 흑모색에 검은색 피부를 가진 돼지가 발견되었다. 그 원인 을 규명하고자, 모색과 연관되어 있다고 알려진 MC1R, KIT 유전자와 피부색과 연관되어 있다고 알 려진 ASIP 유전자의 특징을 살펴보았다. MC1R의 sequencing 분석 결과, 아미노산 67, 68번째 자 리의 6개 염기 C(CCC CCC)는 Hampshire와 동일한 ED2/ED2 유전자형인 것으로 밝혀졌고, KIT의 경우 qOLA_CNV, Pyro_Splice 및 sequencing 분석한 결과, Duroc의 i/i 유전자형과 같은 유전자형 으로 밝혀졌다. ASIP의 경우 염기서열을 분석한 결과, 모든 종에서 차이가 없는 것으로 확인되었다. 유연관계 분석을 위해 Phase software와 network 분석을 실시한 결과, MC1R은 Hap22와 Hap23 이, KIT는 Hap22, Hap43과 유색종과 유연관계를 형성하는 것으로 확인되었다. 반면에 ASIP는 Hap04, Hap09이 야생멧돼지와 중국재래돼지를 제외한 품종들과의 유연관계를 확인할 수 있었다. 더 나아가 각 품종 간 유사성 분석을 위해 PCA를 실시한 결과, MC1R은 Berkshire, KIT는 Berkshire와 Hampshire가 유사성을 가지는 것으로 밝혀졌고, ASIP는 Berkshire 와 Duroc의 유사 성을 관찰할 수 있었다. In general, the skin color of pig is known as light pink regardless of its coat color. However, we found a black coat colored pig with black skin color. To investigate the genetic background of the black skin color, we extracted genomic DNA from the muscle tissue sample of the black skin colored pig and performed molecular genetic analysis using MC1R, KIT, and ASIP. As for MC1R, sequence analysis together with identified amino acid of 67, 68 codons revealed that the genotyping of MC1R was ED2/ED2, which is the same genotype as Hampshire. As for KIT, qOLA_CNV, Pyro_Splice, and sequence analysis revealed that the genotyping of KIT is i/i, which is same genotype of Duroc. As for ASIP, sequence analysis revealed that no difference was found in all breeds. Results of the Phase program and network analysis showed that MC1R had the haplotype of Hap22 and Hap23, and KIT had the haplotype of Hap22 and Hap43. These genes have formed a relationship of colored trait. On the other hand, ASIP had the haplotype of Hap04 and Hap09, all breeds except for Korean wild boar and Chinese native pig have been formed a relationship. Furthermore, the result of the principal component analysis for sequence similarity of each breed, the MC1R sequence of the black skinned pig was similar to the sequence of the Berkshire and KIT sequence of the black skinned pig was found to be similar to Berkshire and Hampshire. but no similarity was found in ASIP. Therefore, no specific sequence variation between MC1R, KIT, and ASIP genes was observed in relation to the black skinned pig.

돼지 개체식별 및 친자감별을 위한 13 microsatellite marker와 37 single nucleotide polymorphism marker 간의 효율성 비교

이재봉,유채경,정은지,이정규,임현태 경상대학교 농업생명과학연구원 2012 농업생명과학연구 Vol.46 No.5

Allele information from the analysis of the 13 microsatellite (MS) markers, were classified into the F0, F1 and F2 generations, and probabilities of the same individual emergency in each generation was calculated. As a result, the 13 MS markers showed an estimate of 3.84 × 10-23 on the premise of the randomly mated group of F2, which implies that the same individuals may emerge by the use of 37 kinds of SNP markers. In this study, the experimental pigs were intercross between only 2 breeds (Korean native pig and Landrace). In addition, the success rate of paternity tests was analyzed on the whole group, by the use of the 13 MS markers and 37 SNP markers. As regards the exclusionary power of the second parent (PEpu), MS markers and SNP markers showed 0.97897 and 0.99149, respectively. In relation to the parent exclusion power of both parent (PE), MS markers and SNP markers showed 0.99916 and 0.99949, respectively. In the case of the estimate to identify parental candidates that had the highest probability (PNEpp), the two showed 1.00000 all. The Korean pig industry tends to mass produce hogs with limited numbers of alleles in limited parents. Such being the case, there is a need to organize a marker, for which it is imperative to find markers with high efficiency and high economic feasibility of the characteristics of DNA markers, sample size, the accuracy and expenses of genotyping cost, the manageability of data and the compatibility among analysis systems. 13종의 초위성체 마커를 이용해 분석한 대립유전자형을 F0, F1 그리고 F2로 세대 간 구분 하여 동일한 개체 출현확률 값을 추정한 결과 F2의 무작위교배집단으로 가정한 경우 13종의 초위성체 마커는 3.84 × 10-23의 추정치를 나타내 37개의 SNP 마커를 이용할 경우와 유사한 동일개체 출현확률 추정치를 유추할 수 있었다. 본 연구에 사용한 실험축군은 2품종 상호교배로 만들어졌다. 친자감정확률 추정치를 전체집단을 대상으로 13종의 초위성체 마커와 37개의 SNP 마커를 이용하여 분석한 결과 부모를 동시에 찾을 수 있는 추정치인 PEpu의 경우 초위성체 마커는 0.97897이고 SNP 마커는 0.99149였으며, 한쪽 부모를 찾을 수 있는 추정치인 PE의 경우 초위성체 마커는 0.99916이고 SNP 마커는 0.99949로 나타났다. 또한 가능한 후보 부모들로부터 가장 확률이 높은 부모를 찾을 추정치인 PNEpp의 경우는 초위성체 마커와 SNP 마커 둘 다 1.00000으로 추정 되었다. 한정된 부모집단 내 한정된 대립유전자형을 통해 대량의 비육돈이 생산되는 국내의 양돈산업의 경우 DNA 마커의 특성, 분석집단의 크기, 유전자형 분석의 정확도와 비용, 분석된 자료 관리의 용이성 및 기존 분석 시스템과의 호환성 등을 고려하여 효율성과 경제성이 높은 마커를 선정해 마커 조합을 만드는 것이 필요할 것으로 사료된다.

대량 모근 시료 DNA 분리 체계 확립과 11 microsatellite maker를 사용하는 한우 생산이력제로의 적용가능성 검증

임현태,유채경,선두원,정일정,이정규,전진태,이상호,조인철,윤두학,양대용 경상대학교 농업생명과학연구원 2010 농업생명과학연구 Vol.44 No.6

한우 이력추적제에 적용되는 11개의 MS marker (TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115, TGLA126, TGLA122, ETH3, ETH225, BM1824 and INRA23)와 성감별을 위한 2개의 sexing primer로 조합된 하나의 Multiplex PCR set를 이용하여 모근에서 추출한 genomic DNA를 이용해 3510두의 대량 시료를 분석한 결과 3.93%의 genotyping 실패율로 성공적인 분석결과를 얻었다. 무작위교배집단으로 가정 시 동일개체출현확률 (PI)은 1.31×10-23, 반형매교배집단으로 가정 시 동일개체출현확률 (PIhalf-sibs)은 2.52×10-16 그리고 전형매교배집단으로 가정 시 동일개체출현확률 (PIsibs)은 1.09×10-6으로 나타나 현재 사용 중인 11종의 MS marker는 범용적으로 사용하여도 무방할 것으로 재확인 되었다. 또한 생산 및 사육단계의 생우의 경우 모근을 이용하여 DNA를 추출하는 것은 시료 채취 시 소에게 주어지는 스트레스를 최소화 시킬 수 있을 뿐만 아니라 대립유전자형 분석에 있어서 시간적, 경제적인 효율성을 높일 수 있었다. 또한 모근 채취 부위 중 등, 배, 꼬리상부와 꼬리하부를 이용하여 검정한 결과 꼬리하부의 모근을 이용하여 5~13가닥을 사용했을 때 최적의 분석결과를 보였다. 최종적으로 한우의 사육단계 대량 유전자형 분석에 적용 가능한 96 well 단위를 기본으로 하는 모근 DNA분리 체계를 확립하였다.

Genome scan linkage analysis identifies a major quantitative trait loci for fatty acid composition in longissimus dorsi muscle in an F2 intercross between Landrace and Korean native pigs

박희복,한상현,유채경,이재봉,김지향,백광수,손준규,심상민,임현태,조인철 아세아·태평양축산학회 2017 Animal Bioscience Vol.30 No.8

Objective: This study was conducted to locate quantitative trait loci (QTL) influencing fatty acid (FA) composition in a large F2 intercross between Landrace and Korean native pigs. Methods: Eighteen FA composition traits were measured in more than 960 F2 progeny. All experimental animals were genotyped with 165 microsatellite markers located throughout the pig autosomes. Results: We detected 112 QTLs for the FA composition; Forty seven QTLs reached the genome-wide significant threshold. In particular, we identified a cluster of highly significant QTLs for FA composition on SSC12. QTL for polyunsaturated fatty acid on pig chromosome 12 (F-value = 97.2 under additive and dominance model, nominal p-value 3.6×10–39) accounted for 16.9% of phenotypic variance. In addition, four more QTLs for C18:1, C18:2, C20:4, and monounsaturated fatty acids on the similar position explained more than 10% of phenotypic variance. Conclusion: Our findings of a major QTL for FA composition presented here could provide helpful information to locate causative variants to improve meat quality traits in pigs.

순종 랜드레이스의 10주령 체중 형질에 영향을 미치는 후보유전자 탐색을 위한 전장유전체 분석

강호찬,이재봉,유채경,최태정,임현태 강원대학교 동물자원공동연구소 2019 동물자원연구 Vol.30 No.3

According to Livestock Inspection Standards, the piglets enter the feedlot at approximately 30 kg, and the inspection starts after the preliminary feeding period. The reason for applying the preliminary feeding period is to select inspection piglets with no diseases after the complete growth of the internal organs until 10 weeks of age. Furthermore, the age of 10 week is the time when the muscle fibers grow to their maximum size and the piglets are prepared for fat deposition at the later fattening period. In the study, a genome-wide association study (GWAS) was performed through the mlma command of the genome-wide complex trait analysis (GCTA) program with 703 purebred Landrace population, and the candidate genes associated with the weight of 10 week were searched. The GWAS identified 3 single nucleotide polymorphism (SNP) markers, which have a significant genome-wide suggestive level, on chromosome 6 (DIAS0002615; p value=1.62×10-6, MARC0083933; p value=4.94×10-6, ASGA0028717; p value=5.40×10-6). The 2 genes (Ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 4; UBR4, WD and tetratricopeptide repeats 1; WDTC1) in which these 3 SNP markers are located are positional candidate genes of the weight of 10 week of the purebred Landrace population. 2 candidate genes have been reported to be associated with fattening. Therefore, the positional candidate genes in this study, UBR4 and WDTC1, are expected to be usable as genes for traits associated with the weight of 10 week weight and fattening through additional experimental research with other population 가축검정기준(Livestock Inspection Standards)에 따르면 약 30 kg에 입식을 하여 예비사육기간 이후 검정을 시작한다. 이는 10주령 시기까지 체내 기관의 온전한 성장과 질병에 문제가 없는 검정자돈을 선발하기 위함이며, 또한 10주령 시기는 근섬유의 크기가 최대치로 증가하고 이후 비육시기의 지방 침착을 위해 준비하는 시기이다. 이에 본 논문은 순종 랜드레이스 집단 703두와 genome-wide complex trait analysis(GCTA) 프로그램의 mlma command를 통한 전장유전체 연관성 분석(genome-wide association study, GWAS)을 수행하여 10주령 체중과 연관된 후보유전자를 탐색하였다. 전장유전체 연관성 분석 결과 genome-wide suggestive level의 유의성을 가지는 single nucleotide polymorphism(SNP) marker가 6번 염색체에서 3개 동정되었다(DIAS0002615; p value=1.62×10-6, MARC 0083933; p value=4.94×10-6, ASGA0028717; p value=5.40× 10-6). 이 3개의 SNP marker가 위치한 2개의 유전자(Ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 4; UBR4, WD and tetratricopeptide repeats 1; WDTC1)들은 순종 랜드레이스 집단의 10주령 체중의 위치상 후보 유전자이며, 두 개의 후보유전자는 비육과 연관된 유전자로 보고되어 있다. 따라서 본 연구의 위치상 후보유전자인 UBR4, WDTC1은 타 집단과 추가적인 실험 연구를 통해 10주령 체중과 비육 연관 형질의 유전자로서 이용이 가능할 것으로 생각된다.

GWAS를 이용한 간경화 수치와 후보유전자 BCL11B의 관련성 분석

이재봉,김범모,유채경,박희복,신준호,홍준기,임현태 경상대학교 농업생명과학연구원 2014 농업생명과학연구 Vol.48 No.4

혈청 내 존재하는 효소 중 Glutamic pyruvic transaminase(GPT)는 근육이나 간세포의 손상에 대한임상 화학적 지표로 사용 된다. 본 연구는 Landrace와 한국재래돼지의 F2 교잡 축군(N=1,105)에 대해Porcine SNP 60K beadchip을 사용하여 유전자형 분석을 실시하고, GPT 형질과의 관련성을 검증하기위해 Genome-Wide Association Study(GWAS)를 수행하였다. F2 교잡축군의 가계구조를 보정한GWAS를 수행하기 위하여 혼합모형과 회귀분석을 조합한 GRAMMAR방법을 관련성 분석에 사용 하였다. 유의성 있는 SNP 표지들은 Sus scrofa chromosome(SSC) 6, 7, 그리고 13에서 동정되었다. 이들유의성 있는 SNP marker들에 가장 근접한 염색체상 위치의 유전자를 그 유전자의 기능을 고려하여SSC7에서 2개의 위치후보유전자(BCL11B, AHNAK2)를 선정하였다. Pyrosequencing법을 통하여 이 들유전자 내에 존재하는 4개 SNP 표지들의 유전자형을 분석하여 GPT 형질간의 관련성 분석에 이용하였다. 관련성 분석결과, BCL11B g.267 T>C에서 nominal P=7.23×10-8 과 AHNAK2 g.1439 C>T에서nominal P=5.64×10-6, g.1736 C>A에서 nominal P=3.51×10-6의 결과를 얻었다. 이 들 중 가장 유의한 결과를 얻은 BCL11B 유전자의 g.267 T>C SNP 표지는 추가 연구를 통하여 혈청 GPT 변이에 영향을 미치는 위치상 후보 유전자 표지로 사용 되어 질 수 있을 것이라 사료되어진다. Serum glutamic pyruvic transaminase(GPT) levels can be used as an indicator of muscle andliver cell damage affecting health status. In this study, a genome-wide association study(GWAS)was performed to detect significant single nucleotide polymorphisms(SNPs) affecting serum GPTlevels in a large F2 intercross between Landrace and Korean native pigs (N=1,105) using theporcine 60K chip, and a mixed-effects model approach accounting for familial relationshipsbetween individuals in this intercross. The significant SNPs were identified on Sus scrofachromosome(SSC) 7. Two positional candidate genes on SSC7, BCL11B and AHNAK2, were subsequently selected and further investigated. Within these positional candidate genes, fourSNPs were identified and genotyped using the pyrosequencing. The results revealed that theSNP(g.267 T>C, nominal P=7.23×10-8) in the BCL11B, and SNPs(g.1439 C>T, nominalP=5.64×10-6; g.1736 C>A, nominal P=3.51×10-6) in the AHNAK2 gene were associated withserum GPT levels, respectively. Based on its statistical significance, the BCL11B can be used asa promising candidate gene for further functional investigations.

Association of a missense mutation in the positional candidate gene glutamate receptor-interacting protein 1 with backfat thickness traits in pigs

이재봉,박희복,유채경,김희성,조인철,임현태 아세아·태평양축산학회 2017 Animal Bioscience Vol.30 No.8

Objective: Previously, we reported quantitative trait loci (QTLs) affecting backfat thickness (BFT) traits on pig chromosome 5 (SW1482–SW963) in an F2 intercross population between Landrace and Korean native pigs. The aim of this study was to evaluate glutamate receptor-interacting protein 1 (GRIP1) as a positional candidate gene underlying the QTL affecting BFT traits. Methods: Genotype and phenotype analyses were performed using the 1,105 F2 progeny. A mixed-effect linear model was used to access association between these single nucleotide polymorphism (SNP) markers and the BFT traits in the F2 intercross population. Results: Highly significant associations of two informative SNPs (c.2442 T>C, c.3316 C>G [R1106G]) in GRIP1 with BFT traits were detected. In addition, the two SNPs were used to construct haplotypes that were also highly associated with the BFT traits. Conclusion: The SNPs and haplotypes of the GRIP1 gene determined in this study can contribute to understand the genetic structure of BFT traits in pigs.

QTL Analysis of Teat Number Traits in an F2 Intercross between Landrace And Korean Native Pigs

박희복,한상현,유채경,이재봉,조상래,조인철 사단법인 한국동물생명공학회 2016 한국동물생명공학회지 Vol.31 No.4

The aim of this study was to identify quantitative trait loci (QTLs) influencing teat number traits in an F2 intercross between Landrace and Korean native pigs (KNP). Three teat number traits (left, right, and total) were measured in 1105 F2 progeny. All experimental animals were genotyped with 173 informative microsatellite markers located throughout the pig genome. We detect that seven chromosomes harbored QTLs for teat number traits: genome regions on SSC1, 3, 7, 8, 10, 11, and 13. Six of fourteen identified QTL reached genome-wide significance. In SSC7, we identified a major QTL affecting total teat number that accounted for 5.6 % of the phenotypic variance, which was the highest test statistic (F-ratio = 61.1 under the additive model, nominal P = 1.3×10-14) observed in this study. In this region, QTL for left and right teat number were also detected with genome-wide significance. With exception of the QTL in SSC10, the allele from KNP in all 6 identified QTLs was associated with decreased phenotypic values. In conclusion, our study identified both previously reported and novel QTL affecting teat number traits. These results can play an important role in determining the genetic structure underlying the variation of teat number in pigs.

전장유전체 관련성 분석을 통한 순종 랜드레이스 생시체중 형질의 위치상 후보유전자 탐색

강호찬,이재봉,유채경,최태정,임현태 경상대학교 농업생명과학연구원 2018 농업생명과학연구 Vol.52 No.3

돼지의 생시체중은 생존율과 폐사율에 밀접한 관련이 있어 양돈산업에서 자돈 관리와 직결된 중요한 경제형질이다. 본 연구는 Genome-Wide Association Study(GWAS) 분석을 통해 순종 랜드레이스의 생 시체중과 관련된 위치상 후보유전자 탐색을 실시하였다. 생시체중의 유의적 관련 분석 결과, genomewide suggestive level에서 유의성 있는 single nucleotide polymorphism(SNP) marker는 3번 염색체 (ASGA0098921, P=2.41×10-5)와 4번 염색체(H3GA0013451, P=2.47×10-5)에서 각각 1개씩 동정되었다. 이들 SNP marker가 위치한 3개의 유전자(LOC110260055, LOC100156472, LOC100157689)들은 순종 랜드레이스 생시체중의 위치상 후보 유전자이며, 이들 유전자 정보를 이용해서 순종 랜드레이스 생시 체중을 선발할 수 있는 기초 연구 자료가 될 것으로 사료된다. Birth weight represents an important trait that has an economic value because it is closely associated with survival and mortality. This study aimed to identify positional candidate genes associated with birth weight of purebred Landrace pigs using genome-wide association study(GWAS). Based on the analysis of genes significantly associated with birth weight, a single nucleotide polymorphism(SNP) marker that is significant at genome-wide suggestive level was identified on chromosome 3(ASGA0098921, P=2.41×10-5) and 4(H3GA0013451, P=2.47×10-5), respectively. These three genes(LOC110260055, LOC100156472, LOC100157689) containing each SNP marker individually are positional candidate genes associated with birth weight of purebred Landrace pigs. Therefore, the results of this study can be used for fundamental studies required to select an optimal birth weight range for the purebred Landrace pigs.