다약제내성 발현 암세포에서 99mTc-sestamibi와 99mTc-tetrofosmin 섭취의 비교

유정아,정신영,서명랑,곽동석,안병철,이규보,이재태 대한핵의학회 2003 핵의학 분자영상 Vol.37 No.3

목적 : 다약제내성이 유발된 암세포에서 ^99mTc-sestamibi와 ^99mTc-tetrofosmin의 암세포 내 섭취정도를 비교하고 다약제내성 극복제로 잘 알려진 verapamil 과 cyclosporin A 처리에 의한 두 방사성 의약품의 암세포 내 섭취정도를 비교해 보았다. 재료 및 방법 : Doxorubicin으로 다약제내성이 유발된 HCT15/CL02 대장암 세포와 doxorubicin과 vincristine으로 다약제내성을 유발시킨 K562(Adr)과 K562(Vcr) 백혈병 세포를 사용하였다. 다약제내성의 발현은 RT-PCR로 증명하였으며, vetapamil은 1, 10, 50, 100, 200 ㎛의 농도로, cyclosporin A는 0.1, 1, 10, 50, 100 ㎛의 농도로 각각 사용하였다. MIBI와 tetrofosmin의 암세포내 섭취는 37℃에서 1 × 10_6 cell/㎖ 농도의 단일세포 부유상태에서 1, 15, 30, 45, 60분 간격으로 배양하여 각 시간대별로 상층액과 침전물을 분리하여 각각의 방사능을 감마 계수기로 측정하였다. 결과 : 다약제내성이 발현된 암세포에서는 모세포에 비하여 MIBI와 tetrofosmin의 섭취가 감소되었다. 두 방사성약품의 섭취정도는 HCT15/CL02세포와 K562(Adr)세포에서는 유의한 차이가 없었으나, K562(Vcr)세포에서는 MIBI가 tetrofosmin보다 다소 높았다. Verapamil과 cyclosporin A를 처리하였을 때 MIBI와 tetrofosmin의 섭취율은 기저치보다 모두 증가하였고, verapamil에 의한 MIBI와 tetrofosmin의 섭취율(30분)을 기저치(30분)와 비교해 본 결과 HCT15/CL02세포에서 (100㎛)는 각각 11.9배와 6.8배, K562(Adr)세포에서(50 ㎛)는 각각 14.3배와 8배, K562(Vcr)세포에서(10㎛)는 각각 7배와 5.7배 증가하였다. Cyclosporin A에 의한 MIBI와 tetrofosmin의 섭취율(30분)을 기저치(30분)와 비교해 본 결과 HCT15/CL02세포에서(50 ㎛)는 각각 10배와 2.4배, K562(Adr)세포에서(50 ㎛)는 각각 44배와 13배, K562(Vcr)세포에서(10㎛)는 각각 18.8배와 11.8배 증가하여, MIBI의 섭취율이 tetrofosmin보다 1.2배에서 4배정도 높게 나타났다. 결론 : 이러한 결과로 보아 MIBI와 tetrofosmin은 다약제내성의 발현을 평가할 수 있는 방사성의약품으로 판단되며, 다약제내성 극복제의 효능평가에는 MIBI가 tetrofosmin보다 더 우수할 것으로 사료되나, 세포주에 따른 차이가 있을 수 있으므로 보다 많은 세포주에서의 추가적인 연구가 필요할 것이다. Purpose : Cellular uptakes of ^99mTc-sestamibi(MIBI) and ^99mTc-tetrofosmin into cancer cell lines expressing multidrug resistance(MDR) were investigated and compared. The effects of verapamil and cyclosporin A, well-known multidrug resistant reversing agents, on cellular uptake of both tracers were also compared. Materials and Methods : Doxorubicin-resistant HCT15/CL02 human colorectal cell and doxorubicin-resistant K562(Adr) and vincristine-resistant K562(Vcr) human leukemic cells were studied. RT-PCR analysis was used for the detection of mdr1 mRNA expression. MDR-reversal effects with verapamil and cyclosporine A were evaluated at different drug concentrations after incubation with MIBI and tetrofosmin for 1, 15, 30, 45 and 60 min, using single-cell suspensions at 1×10_6 cell/㎖ incubated at 37℃. Radioactivity in supernatants and pellets were measured with gamma well counter. Results : The cellular uptakes of MIBI and tetrofosmin in K562(Adr) and K562(Vcr) were lower than those of parental J562 cell. In HCT15/CL02 cells and K562(Adr) cells, there were no significant difference in cellular uptakes of both tracers, but cellular uptake of MIBI was higher than that of tefrofosmin in K562(Vcr) cells. Coincubation with verapamil resulted in a increase in cellular uptakes of MIBI and tetrofosmin. Verapamil increased cellular uptakes of MIBI and tetrofosmin by HCT15/CL02 cell by 11.9- and 6.8-fold, by K562(Adr) cell by 14.3- and 8-fold and by K562(Vcr) cell by 7- and 5.7-fold in maximum, respectively. Cyclosporin A increased cellular uptakes of MIVi and tetrofosmin by HCT15/CL02 cell by 11.9- and 6.8-fold, by K562(Adr) cell by 14.3- and 8-fold and by K562(Vcr) cell by 7- and 4.7-fold in maximum, respectively. Cyclosporin A increased cellular uptakes of MIBI and tetrofosmin by HCT15/CL02 cell by 10- and 2.4-fold, by K562(Adr) cell 44- and 13-fold and by K562(Vcr) cell by 18.8- and 11.8-fold in maximum, respectively. Conclusion : Taking together, MIBI and tetrofosmin are considered as suitable radiopharmaceuticals for detecting multidrug resistance. However, MIBI seems to be a better tracer than tetrofosmin for evaluation MDR reversal effect of the modulators. Since cellular uptakes of both tracers might differ in different cell types, further experiments regarding differences in cellular uptakes between cell types should be explored.

Dimethylnitrosamine 유발 급성 간 손상 흰쥐에서 ^(99m)Tc-Lactosylated Serum Albumin을 이용한 간 기능의 평가

정신영,이재태,서명랑,유정아,배진호,안병철,황재석,정재민,하정희,이규보 대한핵의학회 2003 핵의학 분자영상 Vol.37 No.6

목적: ^(99m)Tc-lactosylated serum albumin (^(99m)Tc-LSA)은 간세포에 특이적으로 결합하는 간수용체 영상용 방사성의약품으로 새로이 합성되었다. 간섬유화를 유발하는 dimethylnitrosamine (DMN)을 투여한 간 손상 휜쥐 모델에서 ^(99m)Tc-LSa의 역동학적인 간섭취를 조사하고 간효소치의 변화와 조직학적 소견을 비교하여, LSA의 간섭취가 간기능의 변화를 반영하는지를 연구하였다. 대상 및 방법: SD계 흰쥐에 DMN를 27 mg/kg으로 복강 내 주사하여 급성 간손상을 유도하고 대조군과 비교하였다. DMN을 주사한 흰쥐를 3일(DMN-3), 8일(DMN-8), 21일(DMN-21)에 ^(99m)Tc=LSA (1,665 mg/kg) 29 MBq를 정맥 주사하여, 30분 동안 동적 영상을 획득하고 간과 신장부위에 관심영역을 설정하여 간과 심장부위의 시간방사능 곡선을 얻었다. 간기능 평가를 위해 시간방사능 곡선을 이용하여 간섭취지수와 혈중제거지수를 구하였고 곡선 최적화를 시행하였다. DMN 투여군과 대조군의 간효소치의 변화와 간조직의 광학현미경 소견을 비교하였다. 결과: 대조군에서는 ^(99m)Tc-LSA가 빠르게 간에 섭취되고 혈중에서 제거되었으나 DMN을 처리한 군에서는 간섭취가 낮았다. 간섭취지수의 비교에서 대조군에 비해 DMN 처리군에서 유의하게 간섭취지수가 낮았다(DMN-3: 0.842, DMN-8: 0.898, DMN-21: 0.91, 대조군: 0.96, p<0.05). 혈중제거지수의 비교에서도 대조군에 비해 DMN 처리군에서 혈중제거지수가 유의하게 높았다(DMN-3: 0.731, DMN-8: 0.654, DMN-21: 0.604, 대조군: 0.473, p<0.05). 비선형 회귀분석에서 R_(2) 값은 0.9이상으로 좋은 일치를 보였고, 대조군에ㅓ K값이 DMN처리군에 비해 크고(DMN-3: 0.28, DMN-8: 0.41, DMN-21: 0.46, 대조군: 0.97, p<0.05), T_(1/2)값은 작았다(DMN-3: 2.5, DMN-8: 1.7, DMN-21: 1.5, 대조군: 0.7, p<0.05). 간효소치의 변화는 DMN-3군에서는 대조군에 비해 상승하였으나 DMN-8, DMN-21군에서는 간효소치의 상승이 관찰되지 않았다. 간조직 소견의 경우 DMN-3군에서 중심정맥 주위에 괴사가 관찰되었으나 DMN-8군, DMN-21군에서는 미약한 정도의 염증세포 침윤만이 관찰되었다. 결론: ^(99m)Tc-LSA 간신티그래피의 간섭취 정도는 간손상과 반비례하였으며 간섭취의 변화는 조직학적 손상이 심한 정도와 간손상후 회복되는 과정을 반영하여 주었다. ^(99m)Tc-LSA 간신티그래피가 간손상을 평가하고 간손상후 회복되는 과정을 추적하는 간수용체 영상용 방사성 의약품으로 사용될 수 있을 것으로 생각된다. Objects: ^(99m)Tc-lactosylated human serum albumin(LSA) is a newly synthesized radiopharmaceutical that binds to asialoglycoprotein receptors, which are specifically presented on the hepatocyte membrane. Hepatic uptake and blood clearance of LSA were evaluated in rat with acute hepatic injury induced by dimethylnitrosamine(DMN) and results were compared with corresponding findings of liver enzyme profile and these of histologic changes. Materials and Methods: DMN (27 mg/kg) was injected intraperitoneally in Sprague-Dawley rat to induce acute hepatic injury. At 3(DMN-3), 8(DMN-8), and 21(DMN-21) days after injection of DMN, LSA injected intravenously, and dynamic images of the liver and heart were recorded for 30 minutes. Time-activity curves of the heart and liver were generated from regions of interest drawn over liver and heart area. Degree of hepatic uptake and blood clearance of LSA were evaluated with visual interpretation and semiquantitative analysis using parameters (receptor index : LHL3 and index of blood clearance : HH3), analysis of time-activity curve was also performed with curve fitting using Prism program. Results: Visual assessment of LSA images revealed decreased hepatic uptake in DMN treated rat, compared to control group. In semiquantitative analysis, LHL3 was significantly lower in DMN treated rat group than control rat group (DMN-3:0.842, DMN-8: 0.898, DMN-21: 0.91, Control: 0.96, p<0.05), whereas HH3 was significantly higher than control rat group (DMN-3: 0.731, DMN-8: 0.654, DMN-21: 0.604, Control: 0.473, p<0.05). AST and ALT were significantly higher in DMN-3 group than those of control group. Centrilobular necrosis and infiltration of inflammatory cells were most prominent in DMN-3 group, and were decreased over time. Conclusion: The degree of hepatic uptake of LSA was inversely correlated with liver transaminase and degree of histologic liver injury in rat with acute hepatic injury.

MRT발현 인체 비소세포 폐암 A549에서 Tc-99m MIBI와 Tc-99m Tetrofosmin 섭취의 비교

유정아,정신영,서명랑,배진호,안병철,이규보,최상운,이병호,이재태 대한핵의학회 2003 핵의학 분자영상 Vol.37 No.6

목적: 인체 비소세포 폐암 A549세포에서 MRP발현을 조사하고, A549세포와 종양에서 Tc-99m MIBI와 tetrofosmin의 섭취정도를 비교하여 MRP추적자로서의 성능을 알아보고자 하였다. 재로 및 방법: A549세포의 MRP발현은 MRPr1항체에 대한 western blot analysis와 면역조직화학 검사로 확인하였다. 세포내 섭취는 37℃에서 100 μM의 verapamil (Vrp), 50 μM의 cyclosporin A (CsA)와 25 μM의 butoxysul-foximide (BSO)가 전 처리된 1×10^(6)개/ml 농도의 단일세포 부유 상태에서MIBI와 tetrofosmin을 30분과 60분 동안 반응시킨 후 상층액과 침전물로 분리하여 각각의 방사능을 감마계수기로 측정하였다. 체내 실험은 누드마우스에 A549세포를 이종이식하여 4군으로 나누었다. Gr1과 Gr3은 MIBI와 tetrofosmin을 각각 주사한 군들이며, Gr2와 Gr4는 CsA를 70mg/kg으로 MIBI와 tetrofosmin투여 1시간 전에 처리한 군들이다. MIBI와 tetrofosmin은 각각 370KBqdydfid으로 꼬리정맥 주사하고 10분, 60분, 240분 후에 동물들을 희생시켜 종양조직내의 두 방사성의약품의 장기섭취율(%ID/gm)로 계산하여 비교하였다. 결과 : MRPr1 항체(clone MRPr1)를 이용하여 western blot analysis결과 A549세포는 약 190 kDa에 해당하는 MRPr1 밴드를 나타내었으며, 면역조직화학 염색검사에 의한 종양조직에서도 MRP가 발현되었음을 관찰할 수 있었다. A549세포에서 세포내 MIBI와 tetrofosmin의 섭취는 배양시간이 지남에 따라 증가하였으며 그 섭취정도는 MIBI가 tetrofosmin보다 높았다. MRP역전제들에 의한 MIBI와 tetrofosmin의 섭취정도를 각각의 60분 대조군과 비교하면 Vrp(100μM) 처리에 의하여 각각 623%와 427%, CsA(50 μM)에 의해서는 각각 763%와 629%, BSO (25 μM)에 의해서는 각각 219%와 140%로 증가하여 모든 역전제에서 MIBI의 섭취증가 정도가 tetrofosmin보다 높았다. 체내에서 Gr1과 Gr3에서 두 방사성의 약품의 섭취정도는 유사하였다. Gr2와 Gr4에서 CsA (70mg/kg)에 의한 섭취정도는 각각의 대조군에 비교하여 MIBI는 10분에 114%, 60분에 257%, 240분에 396%로 증가하였으며, tetrofosmin은 10분에 110%, 60분에 205%, 240분에 410%로 증가하였다. 결론 : 본 연구의결과로 보아 인체 비소세포 폐암 A549세포와 종양에서 MIBI와 tetrofosmin은 MRP발현을 측정할 수 있는 방사성의약품으로 사료되며, MRP억제제들에 의한 MIBI와 tetrofosmin의 섭취증가 정도는 시포실험에서는 MIBI가 tetrofosmin보다 높았으나 동물실험에서는 유사하였다. Purpose: Uptakes of Tc-99m MIBI(MIBI) and Tc-99m tetrofosmin (tetrofosmin) in human non-small cell lung cancer A549, multidrug-resistance associated protein (MRP) expressing cell, were investigated in vitro and in vivo. Materials and Methods: Western blot analysis and immunohistochemistry were used for detection of MRP in A549 cells with anti-MRPr1 antibody. Cellular uptakes of two tracers were evaluated at 100 μM of verapamil (Vrp), 50 μM of cyclosporin A (CsA) and 25 μM of butoxysulfoximide(BSO) after incubation with MlBl and tetrofosmin for 30 and 60 min at 37℃, using single cell suspensions at 1×10^(6) cell/ml. Radioactivities in supernatants and pellets were measured with gamma well counter. A549 cells were inoculated in each flanks of 24 nude mice. Group 1(Gr1) and Gr3 mice were treated with only MlBl or tetrofosmin, and Gr2 and Gr4 mice were treated with 70mg/kg of CsA i.p. for 1 hour before injection of 370KBq of MlBl or tetrofosmin. Mice were sacrificed at 10, 60 and 240 min. Radioactivities of organs and tumors were expressed as percentage injected dose per gram of tissue(%ID/gm). Results: Western blot analysis of the A549 cells detected expression of MPRr1 (190 kDa) and immunohistochemical staining of tumor tissue for MPRr1revealed brownish staining in cell membrane but not P-gp. Upon incubating A549 cells for 60 min with MlBl and tetrofosmin, cellular uptake of MlBl was higher than that of tetrofosmin. Coincubation with modulators resulted in an increase in cellular uptakes of MlBl and tetrofosmin. Percentage increase of MlBl was higher than that of tetrofosmin with Vrp by 623% and 427%. CsA by 753% and 629% and BSO by 219%and 140%, respectively. There was no significant difference in tumoral uptakes of MlBl and tetrofosmin between Grl and Gr3. Percentage increases in MlBl (114% at 10 min, 257% at 60 min. 396% at 240 min) and tetrofosmin uptake (110% at 10 min, 205% at 60 min, 410% at 240 min) were progressively higher by the time up to 240 min with CsA. Conclusion: These results indicate that MlBl and tetrofosmin are suitable tracers for imaging MRP-mediated drug resistance in A549 tumors. MlBl may be a better tracer than tetrofosmin for evaluating MRP reversal effect of modulators.

수종의 암세포에서 Verapamil이 Tc-99m MIBI와 Tetrofosmin의 섭취에 미치는 영향

김대현 ( Kim Dae Hyeon ),유정아 ( Yu Jeong A ),서명랑 ( Seo Myeong Lang ),배진호 ( Bae Jin Ho ),정신영 ( Jeong Sin Yeong ),안병철 ( An Byeong Cheol ),이규보 ( Lee Gyu Bo ),이재태 ( Lee Jae Tae ) 대한핵의학회 2004 핵의학 분자영상 Vol.38 No.1

목적: 다약제내성(MDR) 극복제 verapamil은 MDR이 발현된 암세포에서 Tc-99m MIBI(MIBI)와 tetrofosmin(TF)의 섭취를 증가시키는 것으로 알려져 있으나, 세포의 종류에 따라서는 MIBI와 TF의 섭취를 감소시킬 수 있다는 보고가 있다. 본 연구는 암세포의 종류에 따라 verpamile이 MIBI와 TF의 섭취에 미치는 영향이 세포에 따른 차이가 있는지를 알아보고, 이러한 차이가 세포독성이나 PKC효소의 발현에 따른 차이인가를 알아보았다. 방법: 백혈병세포 K562세포와 유방암세포 MCF7, 난소암세포 SK-OV-3은 세포 및 MDR이 유발된 K562(Adr)세포를 배양하였다. 시험관에서 1×10^(6) cells/㎖ 농도의 single-cell suspension 상태로 분주하고 verapamil을 1, 10, 50, 100, 200 μM의 농도로 처리한 후 MIBI와 TF를 배양한 후, 37℃에서 1, 15, 30, 45, 60분 동안 반응시킨 후 pellet과 supernatant의 방사능 치를 감마계수기로 측정하여 투여한 방사능 치에 대한 세포내 섭취백분율로 표시하였다. Verapamil의 세포독성은 MTT assay로 측정하였고, 세포내의 PKC isotypes의 변화는 western blotting analysis로 평가하였다. 결과: 4종류의 세포 모두에서 MIBI와 TF의 섭취는 1, 15, 30, 45, 60분 배양 시간에 따라 증가하였다. verapamil을 처리시 다약제 내성이 유발된 K562(Adr)세포에서 100 μM의 농도까지는 MIBI와 TF 섭취가 증가하였고, 최대 50 μM에서 10배 증가하였다. 그러나 K562세포를 verapamil 1 μM로 처리하였을 때는 기저치와 유사하였으나, verapamil의 농도가 증가함에 따라 MIBI와 TF의 세포섭취는 모두 감소하였다. K562세포의 60분 MIBI 섭취율은 79%(10 μM), 47%(50 μM), 29%(100 μM), 60%(50μM), 42%(100 μM), 2.7%(200 μM)로 감소하였다. MCF7, SK-OV-3세포에서는 verapamil 10 μM까지는 MIBI와 TF의 섭취가 기저치와 유사하거나 소량 증가하였으나 50 μM이상의 용량에서는 감소하여 100 μM에서는 각각 40%와 5%만 섭취되었다. MTT assay상 K562(Adr)세포에서는 verapamil 100 μM 이상에서는 유의하게 낮았으나 다른 세포는 200 μM까지에도 차이가 없었다. PKC 아형의 분석상 PKC ε이 K562(Adr)세포에서 많이 발현되었으나, K562와 K562(Adr)세포에서는 verapamil처리에 따른 PKC 아형의 변화는 없었다. 결론: Verapamil은 암세포의 종류에 따라 MIBI와 TF의 섭취를 감소시켰고, 고용량에는 MDR 세포의 섭취도 감소시켰으며 이러한 현상은 세포독성이나 PKC효소 아형과는 관련이 없었다. 그러므로 MDR의 진단시 verapamil을 처치에 따른 MIBI와 TF의 섭취 정도를 기준으로 하는 경우에는, verapamil의 농도와 세포의 종류에 따라 현저한 차이가 있을 수 있다는 점을 생각하여야 한다. Purpose: Cellular uptake of ^(99)mTc-sestamibi (MIBI) and ^(99)mTc-tetrofosmin (TF) is low in cancer cells expressing multidrug resistance(MDR) by p-glycoprotein(Pgp) or multidrug related protein(MRP). Verapamil is known to increase cellular uptake of MlBl in MDR cancer cells, but is recently reported to have different effects on tracer uptake in certain cancer cells. This study was prepared to evaluate effects of verapamil on cellular uptake of MlBl and TF in several cancer cells. Materials and Methods: Cellular uptakes of Tc-99m MlBl and TF were measured in erythroleukemia K562 cell, breast cancer MCF7 cell, and human ovarian cancer SK-OV-3 cells, and data were compared with those of doxorubicin-resistant K(562(Ad) cells. RT-PCR and Western blot analysis were used for the detection of mdrl mRNA and Pgp expression, and to observe changes in isotypes of PKC enzyme. Effects of verapamil on MlBl and TF uptake were evaluated at different concentrations upto 200 μM at 1×10^(6) cells/^(㎖) at 37℃. Radioactivity in supernatant and pellet was measured with gamma counter to calculate cellular uptake ratio. Toxicity of verapamil was measured with MTT assay. Results: Cellular uptakes of MlBl and TF were increased by time in four cancer cells studied. Co-incubation with verapamil resulted in an increase in uptake of MlBl and TF in K562(Adr) cell at a concentration of 100 μM and the maximal increase at 50μM was 10-times to baseline. In contrast, uptakes of MlBl and TF in K562, MCF7, SK-OV3 cells were decreased with verapamil treatment at a concentration over 1μM. With a concentration of 200μM verapamil, MlBl and TF uptakes in K562 cells were decreased to 1.5% and 2.7% of those without verapamil, respectively. Cellular uptakes of MlBl and TF in MCF7 and SK-OV-3 cells were not changed with 10μM, but were also decreased with verapamil higher than 10μM, resulting 40% and 5% of baseline at 50μM. MTT assay of four cells revealed that K562, MCF7, SK-OV3 were not damaged with verapamil at 200μM. Conclusion: Although verapamil increases uptake of MlBl and TF in MDR cancer cells, cellular uptakes were further decreased with verapamil in certain cancer cells, which is not related to cytotoxicity of drug. These results suggest that cellular uptakes of both tracers might differ among different cells, and interpretation of changes in tracer uptake with verapamil in vitro should be different when different cell lines are used.