식물에서의 상동재조합을 이용한 효율적인 진타겟팅 시스템

권용익,이효연 한국식물생명공학회 2015 식물생명공학회지 Vol.42 No.3

The plant breeding technology was developed with genetic engineering. Many researchers and breeders have turned from traditional breeding to molecular breeding. Genetically modified organisms (GMO) were developed via molecular breeding technology. Currently, molecular breeding technologies facilitate efficient plant breeding without introducing foreign genes, in virtue by of gene editing technology. Gene targeting (GT) via homologous recombination (HR) is one of the best gene editing methods available to modify specific DNA sequences in genomes. GT utilizes DNA repair pathways. Thus, DNA repair systems are controlled to enhance HR processing. Engineered sequence specific endonucleases were applied to improve GT efficiency. Engineered sequence specific endonucleases like the zinc finger nuclease (ZFN), TAL effector nuclease (TALEN), and CRISPR-Cas9 create DNA double-strand breaks (DSB) that can stimulate HR at a target site. RecQl4, Exo1 and Rad51 are effectors that enhance DSB repair via the HR pathway. This review focuses on recent developments in engineered sequence specific endonucleases and ways to improve the efficiency of GT via HR effectors in plants.

웅성불임 제초제저항성 들잔디 (JG21-MS)의 임성 특성 평가

권용익,최정근,배태웅,강홍규,박기웅,이효연 한국육종학회 2013 한국육종학회 심포지엄 Vol.2013 No.07

현재 작물에서 분자육종학의 기술은 1994년 미국 칼젠사 (Calgene)가 개발한 숙성과정 중 물러지지 않는 토마토, Flavr Savr라는 상품을 개발하여 일반인들에게도 많이 알려지며 관심을 갖는 분야가 되었다. 그 이후 미국 몬산토 (Monsanto)에서 개발한 Round up ready 라는 제초제저항성 콩을 상품으로 발표하면서 외래형질을 도입한 작물에 대한 위해성의 논란이 야기되어, 이를 잠재울 만한 기술 및 방법들이 연구되어 지고 있다. 형질전환 작물, 다시 말하여 유전자변형생물 (GMO, genetically modified organism) 의 위해성의 논란의 하나인 외래유전자가 도입된 형질전환체의 유전자가 야생으로 이동하여 의도치 않은 유전자의 이동에 관한 것이다. 본 연구는 선행 연구에서 제초제저항성을 보이는 잔디, JG21(Jeju Green 21)에 방사선 (감마선)을 처리하여 얻은 여러 형질 중 화분에 이상을 보이는 (웅성불임) 라인을 선발하여 JG21-MS (Male Sterility)라고 명명된 웅성불임 들잔디 화분을 조사하였다. 그 결과 외형적으로 Wild-type, JG21의 정상적인 둥근 공 모양의 형태를 보이는 것에 비해 JG21-MS의 화분은 찌그러진 형태가 관찰되었고, 화분의 활성을 확인할 수 있는 Alexander 염색법을 이용하여 관찰한 결과 JG21-MS의 화분은 대부분 염색되지 않았다. 또한 실제적으로 JG21-MS의 화분이 발아하여 화분관 신장의 가능성을 확인하기 위해 화분관 발아배지를 이용하여 화분관을 유도하였으나 Wild-type, JG21에서 비슷한 수준으로 화분관이 신장된 것에 비해 JG21-MS는 0%의 화분관 신장를 보였다. JG21-MS의 화분은 Wild-type의 화분에 비해 양이 상당히 적고 모양 또한 찌그러진 형태로 유전자 이동의 가능성이 있는 화분관 신장을 보이지 않아 GM 작물의 안정성의 문제를 해소할 수 있을 것이다. 하지만 들잔디의 생육 환경에 따라 화분의 활성에 영향을 미칠 수 있어 이를 명확히 할 필요가 있으며, 한 해의 결과로 속단하기 이르므로 본 연구의 결과를 바탕으로 다음 세대 및 다양한 조건에서의 추가 연구가 필요하다.

들잔디(Zoysia japonica Steud.)의 상동재조합 효율 분석

홍민지,김재훈,이효연,권용익 한국육종학회 2015 한국육종학회 심포지엄 Vol.2015 No.07

Gene targeting (GT)은 식물체 내로 삽입하려는 donor DNA와 식물체 내의 endogenous DNA 간의 상동재조합(Homologous recombination)의 원리를 이용하여, plant genome내의 목표 유전자를 특수한 목적으로 만들어진 modified donor DNA로 교체하는 기술이다. 식물에서는 비상동재조합 (Non-Homologous End Joining)이 homologous recombination보다 높은 비율로 일어나기 때문에 GT의 효율이 동물에 비해 현저하게 낮다. 이를 해결할 수 있는 방안으로 1) 형질전환 효율을 향상시키거나 2) 상동재조합의 효율을 높이는 것 또는 3) 선별 체계의 정확도를 높이는 것이 있는데, 그 중 상동재조합의 효율을 증가시키는 방법에 double strand breaks (DSB)가 큰 영향을 주는 것으로 보고된 바 있다. 따라서 본 연구에서는 Agrobacterium 형질전환을 이용해 한국 잔디인 들잔디 (Zoysia japonica Steud.) 캘러스에 상동재조합이 일어났음을 확인할 수 있는 marker인 pGU.C.USB를 삽입하고, southern blot과 GUS assay를 통해 자연 상태에서 일어나는 들잔디 본래의 상동재조합 효율을 측정하였다. 추후 DSB를 유도하여 향상된 상동재조합의 효율을 측정할 것이다.

제초제저항성 GM들잔디 유래 초형개선 신품종 잔디(JG21-MJ) 계통의 분자생물학적 특성 평가

정하나,좌지방,선현진,권용익,강홍규,이효연 한국육종학회 2015 한국육종학회 심포지엄 Vol.2015 No.07

잔디는 스포츠 경기장, 골프장, 조경분야, 공원, 묘지, 사방건설, 개인주거지 등 광범위하게 활용되고 있는 고부가가치의 경제성 작물이다. 본 연구는 제초제저항성 들잔디 JG21의 화분(pollen)과 금잔디(Z. meliloti) 암술(carpel)의 종간 인공수분을 통해 육성된 제초제저항성 교배종 잔디 계통(JG21-MJ)의 분자생물학적 특성을 평가하기 위해 수행되었다. genomic Southern blot분석에서 제초제저항성 교배종 잔디들은 모두 bar 유전자가 확인되었고, JG21과 동일한 혼성화 패턴(hybridization pattern)을 보여 주었다. PCR을 이용하여 교배종 가운데 제초제저항성이 없는 대조군 품종과 제초제저항성 품종에서 도입유전자 주변염기서열을 분석하였다. 이 실험은 들잔디(JG21)와 금잔디의 교배(F1)와 자가수분(F2) 과정에서 도입유전자 삽입위치 주변의 염기서열에서 상동재조합이 발생하였는가를 조사하기 위해 수행하였다. 제초제저항성 교배종의 도입유전자 주변염기서열은 JG21과 동일하였고, 제초제저항성이 없는 대조군의 삽입위치 주변의 염기서열은 금잔디의 염기서열과 동일하였다.

한국 들잔디에서의 β-1,3-glucanase 유전자의 cloning

강소미,강지남,강홍규,선현진,권용익,고석민,이효연 한국육종학회 2015 한국육종학회 심포지엄 Vol.2015 No.07

한국형 잔디는 다른 병에 비해 진전 속도가 빠르고 주로 뿌리에서부터 발병하여 잔디를 고사시키고 발병 후 구제하기 매우 어려운 라이족토니아잎마름병(라지패취)이 큰 문제로 대두되고 있다. 라이족토니아잎마름병(라지패취)은 Rhizoctonia solani AG2-2(Ⅳ)병원균에 의해 발생하는데, 이 병원균에 강한 내병성 들잔디를 개발하기 위해 식물방어반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PR-Protein 중 하나인 β-1,3-glucanase를 들잔디로부터 cloning 하였다. β-1,3-glucanase는 바이러스나 균의 감염으로 인해 식물조직이 과민반응을 일으킬 때 세포내에서 생성되고 세포외로 분비되어 세포 사이 공간에서 주로 기능을 하는 것으로 알려져 있다. β-1,3-glucanase의 기능분석이 되어있는 단자엽식물 중 옥수수, 밀, 보리, 벼의 염기서열에서 공통으로 보존되어 있는 부분을 이용해 degenerate PCR을 수행하고 얻어낸 sequence를 통해 3` RACE와 5` RACE를 진행하였다. 그 결과 1,228 bp, 399개의 아미노산으로 구성된 ZJGlu1과 1,179 bp, 340개의 아미노산으로 구성된 ZJGlu2의 Full-sequence 얻어냈다. ZJGlu1과 ZJGlu2와의 염기서열 상동성은 76%이며, ZJGlu1의 경우 VISESGWPSAG서열을 보존하고 있고 ZJGlu2의 경우 VSESGWPSA서열을 보존하고 있어 glycosyl hydrolase motif(LGIVISESGWPSAG)와 비교해 봤을 때 상당부분 일치하는 것을 보였다. ZJGlu1과 ZJGlu2 유전자의 기능을 해석하기 위해 각각의 유전자를 도입한 식물형질전환용 벡터를 제작하여 모델식물인 애기장대와 잔디 형질 전환체는 현재 진행 중에 있으며, E.coli over-expression을 수행하여 목표 단백질을 정제하고 in vitro 활성을 측정할 예정이다.

교배육종기술을 이용한 제초제 저항성 왜성 잔디(탐라그린) 개발

송인자,배태웅,정옥철,선현진,권용익,강홍규,고석민,이효연 한국육종학회 2014 한국육종학회 심포지엄 Vol.2014 No.07

잔디는 우리 생활에 없어서는 안 될 매우 중요한 유전자원 중의 하나로 최근 급격한 수요 증가와 더불어 잔디와 관 련된 사업규모가 확대되고 있다. 지금까지 잔디는 전통적인 육종방법을 이용하여 개발되어 왔으며, 전통적 육종 기술로 개발할 수 없는 형질들은 분자생물학적 방법을 이용하여 신품종 잔디를 개발하고 있다. 본 연구에서는 소 비자의 요구에 맞는 잔디 신품종을 개발하기 위하여 분자생물학적기법을 이용하여 개발된 제초제저항성 잔디에 전통적 교배육종 기술을 도입하여 잔디 육종기술의 한계점을 극복하고자 하였다. 제초제저항성 들잔디(JGJ21)의 경우 포복경의 생장 및 증식이 빠르고, 토양활착 능력이 우수할 뿐만 아니라 제초제저항성 기능이 있기 때문에 도 로의 법사면 및 경사지에 적합하다. 그러나 공원 및 정원 등의 조경용으로 사용하기 위해서는 보다 키가 작고 밀도 가 높은 잔디형질이 요구된다. 그러므로 본 연구에서는 JG21의 단점을 보완하기 위해서 금잔디와 교배육종을 수 행함으로써 초고 및 초장이 짧고, 잔디 직립경의 생육밀도가 높은 계통을 선발하였으며, 그 중 가장 우수한 계통은 탐라그린3으로 명명하여 특허출원하였다(국내출원번호 10-2014-0025262). 탐라그린3은 공원 및 정원 등에 사용 하여 잔디 재배시 문제가 되고 있는 예초 및 잡초방제에 따른 노동력을 절감할 수 있으며, 농약의 과다사용으로 인 한 환경오염 문제를 해소할 수 있는 고부가가치 경제작물이 될 것이다.

제초제저항성 웅성불임 GM들잔디(JG21-MS)의 분자생물학적 특성 평가

강홍규,김보화,선현진,권용익,이효연 한국육종학회 2013 한국육종학회 심포지엄 Vol.2013 No.07

잔디는 비식용, 비사료용 작물이지만 스포츠공간용, 조경용, 지피용 등으로 전 세계적으로 가장 보편적으로 활용되는 작물이며, 경제성이 매우 높은 작물이다. 본 연구의 목적은 상업적 재배를 위해 개발된 제초제저항성 웅성불임 GM들잔디의 분자생물학적 특성을 평가하는 것이다. JG21-MS 웅성불임계통은 최초 선발된 해로부터 현재까지 6여 년 동안 제초제저항성 뿐만 아니라 웅성불임성을 잘 유지 하고 있다. BAR 유전자카세트와 T-DNA 삽입점에서 좌,우 1kb 정도의 주변 염기서열의 동등성 및 BAR유전자 발현의 동등성에서 모본과 차이를 보이지 않았다. T-DNA 삽입특성을 조사한 실험에서, T-DNA 오른쪽 경계(RB)의 삽입은 특이한 DNA단편의 첨가 또는 소실 없이 들잔디 DNA와 연결되어 있지만, hygromycin 저항성 유전자(HPH)가 위치한 왼쪽 경계(LB)의 삽입은 삽입과정에서 HPH 유전자의 4/5 정도가 소실되어 유전자의 기능을 상실하였다. 또한 왼쪽 끝 부분과 연결된 들잔디 DNA 쪽도 620bp가 소실되었다. T-DNA는 Ty1-copia retrotransposon-like 유전자 영역에 삽입 된 것으로 확인되었다. Ty1-copia retrotransposon은 식물 종에 조금 차이가 있지만 전체게놈의 10~50% 정도를 차지하는 것으로 알려져 있다. 또한 retrotransposon-like 유전자는 식물고유기능의 유전자가 아니므로 본 이벤트에서 T-DNA는 비유전자영역에 삽입된 것으로 간주할 수 있을 것으로 사료된다. 결국, JG21과 JG21-MS는 HPH 유전자가 소실되어 기능을 상실하였으므로 목표 유전자인 BAR 만 single copy로 존재하는 것으로 확인되었다. 차세대바이오그린21 GM작물실용화사업단에서 지원하는 GM작물 이벤트의 분자생물학적 특성의 최소기준은 단일복제수(single copy), 항생제마커 없이 목표유전자 도입(target gene only), 비유전자 내 삽입을 장려하고 있고, JG21와 JG21-MS 계통의 제초제저항성 들잔디는 이러한 기본조건을 만족시키고 있는 것으로 평가되었다.

노화지연 GM 들잔디 (Zoysia japonica Steud.)의 제조

박미영,선현진,송인자,강홍규,고석민,권용익,이동희,이효연 한국육종학회 2014 한국육종학회 심포지엄 Vol.2014 No.07

들잔디(Zoysia japonica Steud.)는 난지형 잔디로 우리나라를 포함한 동아시아 지역에 자생하고 있다. 내한성이 강 해 국내에서는 전국 어디서나 잔디밭으로 쉽게 조성할 수 있으며, 더불어 내건성, 내서성도 강해 일반 정원용으로 사용되는 경우 자연강우만으로도 생육이 가능하다. 또한 내답압성 뿐만 아니라 심근성이어서 묘소, 공원, 골프장, 경사면 녹화 등 여러 가지 목적으로 이용되고 있다. 최근에는 잔디의 이용범위가 확대되면서 한계점이 있는 전통 육종법 대신 분자육종에 의한 신품종 개발이 활발하게 진행되고 있다. 이 분자육종법을 이용하여 신품종 잔디를 개발하기 위해서 먼저 배양이 쉬운 성숙종자 유래의 캘러스를 유도하고, 이 중 재분화 효율이 높은 캘러스 라인만 을 선발하여 Agrobacterium을 이용한 형질전환을 수행하였다. 본 연구에서는 형질전환 효율을 높일 수 있는 몇가 지 요인들을 조사하여 노화지연 GM 들잔디를 제조하였다. 들잔디의 완숙종자에서 유도/증식하여 선발한 재분화 효율이 높은 배발생 캘러스를 노화지연의 표현형적 특징을 나타내는 애기장대 유래의 AT-hook 유전자들 (ATPG3, ATPG4)을 도입한 Agrobacterium (OD600=0.1)에 24시간 동안 감염하고, 3일간 공동배양, 신초유도 및 선발, 뿌리유 도 및 선발 과정을 거쳐 증식하여 각각 약 20개체씩의 형질전환 식물체를 생산하였다. 확보한 ATPG3, ATPG4 유전 자가 도입된 형질전환식물은 순화/증식하여 분자생물학적 특성 분석, 표현형적 특성 분석, 기능분석 등을 수행하 고 있다.

Agrobacterium법을 이용한 고온건조스트레스 저항성 잔디의 개발

송인자,홍민지,박미영,선현진,김우남,신현숙,권용익,고석민,강홍규,이효연 한국육종학회 2014 한국육종학회 심포지엄 Vol.2014 No.07

잔디는 전 세계적으로 재배되고 있는 중요한 단자엽 식물중의 하나이며, 세계 4대 작물 중 하나인 옥수수 다음으로 큰 시장을 보유하고 있다 (Lee. 1996). 잔디는 도로, 하천, 비행장의 토양 침식 방지에서부터 주택, 공원, 정원, 골프 장, 스포츠 경기장 등으로 널리 이용되고 있어 매년 잔디조성 면적이 전 세계적으로 증가되고 있는 추세이다. 이러 한 잔디는 주로 전통적인 육종방법에 의하여 신품종이 개발되어져 왔으나 현대의 다양한 소비자의 요구를 완전히 충족시키지 못하고 있다. 그러므로 최근 유전자조작기술을 이용하여 소비자 요구에 맞는 다양한 신품종 개발이 시도되고 있다. 특히 급격한 기후변화로 인한 작물의 생리장해를 극복하기 위하여 다양한 유전자(내염성, 내건성, 내한성, 녹기연장, 음지내성 등)를 이용한 biotic 및 abiotic 스트레스 저항성을 갖는 기능성 형질전환잔디 개발에 많 은 투자를 하고 있다. 본 연구에서는 환경스트레스에 관여하는 유전자 중 벼 유래의 OsWRKY11유전자를 크리핑 벤트그라스와 들잔디에 도입함으로써 고온 및 건조스트레스에 저항성이 있는 잔디를 개발하고자 하였다. 들잔디 와 크리핑 벤트그라스의 완숙종자로부터 배발생 callus를 유도 및 증식하여 OsWRKY11유전자가 도입된 Agrobacterium에 24시간 감염 하였다. 그 후 공동배양, shoot 유도 및 선발, root 유도 및 선발 과정을 거쳐 형질전환 식물체를 생산하였으며, 확보된 형질전환 식물체는 분자생물학적 검증을 수행하였다.

복강경 충수 절제술과 개복 충수 절제술의 비교 연구

권수인,강용익 世宗醫學硏究所 1993 世宗醫學 Vol.10 No.2