Expression of Clostridium thermocellum Xylanase(XynX) in Escherichia coli and Protease-deficient Bacillus subtilis

Nguyen Dinh Phuong The Graduate School Sunchon Nation Universty 2006 국내박사

B. subtilis는 생산된 단백질의 세포 외분비 능력 때문에 산업적으로 많이 이용되고 있다. 최근에 이들의 특성을 향상시키기 위해서 분자생물학적 방법이 도입되어 많은 연구가 진행되어져 있으며 특히, B. subtilis 내의 단백질분해효소를 제거 하는 연구도 많이 진행되고 있다. 단백질분해효소를 불활성화 시킨 B. subtilis를 이용하여 Clostridium thermocellum 유래의 섬유소분해효소나 xylan분해효소의 발현에 대한 연구도 많이 되어져 있다. 본 논문은 Clostridium thermocellum 유래의 내열성 XynX를 E. coli 숙주세포와 단백질분해효소를 불활성화 시킨 B. subtilis 숙주세포에 형질전환 시킨 후 생산되는 단백질의 특성에 대하여 비교 하였다. XynX는 Clostridium thermocellum ATCC 27405로부터 높은 열안정성을 가진 xylan분해효소로 이미 클로닝 되어졌고, 염기서열 분석 결과 multidomain의 구조를 가지고 있다. 본 논문은 E. coli 숙주세포와 protease를 불활성화 시킨 Bacillus subtilis 숙주세포에 형질전환 후 발현되는 XynX에 관하여 연구하였다. XynX 유전자 중에서 CD domain을 갖는 플라즈미드 pKM10을 E. coli에서 발현시켜4-methylumbelliferyl-β-D-cellobioside를 기질로 사용하여 활성 염색한 결과, 약 40 kDa에서 활성 밴드를 볼 수 있었다. 이 xylan분해효소의 정제는 CHT-Ⅱ 컬럼으로 수행하였다. XynX 전체 유전자를 갖는 E. coli (pCX33)에서 발현된 XynX는 활성염색 결과 4개의 활성 밴드(120, 110, 85, 60 kDa)를 볼 수 있었으며, 비활성 밴드의 제거는 High-Q와 CHT-Ⅱ 컬럼을 사용하였다. 단백질분해효소를 불활성화 시킨 B. subtilis에서 발현된 XynX는 배양액의 활성염색 결과 잘려진 활성 밴드를 보였으며, 이는 숙주세포로 사용된 B. subtilis의 단백질분해효소에 의해 잘려진 것으로 판단된다. B. subtilis WB600 (pJX33)과 WB700 (pJX33) 의 활성밴드는 40 kDa, 50 kDa 으로 같았다. 그러나 WB600보다 wprA 유전자(단백질분해효소생산)가 하나 더 제거된 WB700이 더 많은 xylan분해효소를 생산하는 것으로 나타났다. WB700보다 vpr 유전자(단백질분해효소)가 하나 더 제거된 WB800은 120, 85 kDa 의 크기가 증가된 활성밴드를 보였고 활성은 비슷하였다. 이로부터 완전한 전체효소를 얻을 수 있었다. 이런 숙주 시스템과 발현 시스템을 활용하면 외래단백질 생산의 효율을 증가시킬 수 있을 것이다. XynX, a highly thermostable xylanase from Clostridium thermocellum ATCC 27405, was previously cloned, sequenced and characterized to have a multi-domain structure [22]. In this study, the expression of XynX was investigated in Escherichia coli and protease-deficient Bacillus subtilis. When expressed in E. coli, the CD domain of XynX, previously cloned in plasmid pKM10, showed single active band of 40 kDa on SDS-PAGE gel containing 4-methylumbelliferyl- -D-cellobioside as the substrate. The xylanase active peptide was purified by hydroxyapatite chromatography. When the entire ORF of the XynX was expressed in E. coli (pCX33), four distinctive active bands corresponding to 120, 110, 85, and 60 kDa were observed due to the cleavage of the full length XynX. These cleaved bands were separated by ion exchange and hydroxyapatite chromatography. Due to its ability to secrete a large amount of protein directly into the culture medium, B. subtilis has become an organism of industrial interest. Recently, extensive research on this bacterium helped to improve genetics and molecular cloning techniques in the field of expression of heterologous gene products. The deletion of protease genes has been investigated to decrease the cleavage of foreign proteins in B. subtilis. Protease-deficient B. subtilis has been used for the expression of cellulase and xylanase genes from the thermophilic anaerobic bacterium C. thermocellum. In this study, XynX, a highly thermostable xylanase from C. thermocellum was expressed in protease-deficient B. subtilis and the cleavage pattern in the B. subtilis was compared to that in E. coli. When XynX was expressed in protease-deficient B. subtilis, truncated active bands were found from the extracellular medium. The cleavage phenomenon was minimized by the deletion of some proteases in the B. subtilis host cell. Two distinct bands, 40 and 50 kDa, were detected when XynX was expressed both in B. subtilis WB600 (pJX33) and WB 700 (pJX33). However, deletion of the wprA protease in B. subtilis WB700 resulted in higher yield of xylanase in the culture supernatant than in WB 600. One more deletion of the vpr protease in WB800 produced two bands with higher molecular weight, 120 and 85 kDa. This demonstrated that the cleavage phenomenon of XynX when expressed in B. subtilis was caused by the presence of the protease genes of the host cell. Overall, this engineered expression systems are potentially applicable for production foreign proteins.

Biomedical Applications of Nanoparticle based on Low Molecular Water-soluble Chitosan : 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 생물 의학적 응용

김동곤 The Graduate School Sunchon Nation Universty 2006 국내석사

본 논문은 천연자원으로부터 얻어진 키토산으로부터 새로운 방법으로 개발된 유리 아민기를 가진 저분자량 수용성 키토산(Low molecular water-soluble chitosan)을 이용하여 화장품 분야와 제약 분야의 응용성에 관한 연구 내용을 기술하였다. 키토산은 천연 양이온성 고분자로 강한 양전하와 무독성, 생분해성 때문에 21세기 생체활성 소재로서 사용되고 있다. 역시 천연 양이온성 다당류인 키토산은 제약산업이나 화장품 산업에 약물전달체로 추천되고 있다. 그러나 키토산은 현재의 응용에 있어서 낮은 용해도 때문에 제한되고 있다. 그러므로 키토산은 초산이 포함된 물에 녹여 사용하고 있다. 여기에 사용된 초산은 항암제나 유전적인 물질, 단백질제제등에 생체활성에 영향을 주게 된다. 이러한 문제를 해결하기 위해 우리는 초산이 없이 물에 녹일 수 있는 LMWSC을 개발하였다. 본 연구에는 이 LMWSC을 이용하여 종양 억제 약물로 사용되는 레티노익산(All-trans retinoic acid(atRA))과 콜라겐 생성을 촉진하여 주름살 제거제로 화장품에 이용되는 레티놀(retinol)을 봉입하여 나노입자를 만들었다. 첫 번째, atRA와 LMWSC를 이용하여 이온 복합체에 기초하여 새로운 형태의 나노입자를 제조하였다. atRA를 LMWSC에 봉입하는 이유는 atRA는 산성을 띠고 있고 인체에 반감기가 짧고 빛에 의해 분해가 일어나기 때문에 이런 단점을 보완하고자 LMWSC에 봉입하였다. FT-IR 스펙트럼에서 1690cm^(-1) 부근에서의 atRA의 carbonyl group의 특성피크가 LMWSC와 이온 결합에 의해 특성피크가 사라졌다. ^(1)H-NMR 스펙트럼에서 atRA의 특성피크가 LMWSC와 복합체를 이루어 나노입자를 만들었을 때 나노입자를 NMR용매인 D_(2)O에 녹여 분석하면 atRA의 특성피크는 나타나지 않고 LMWSC 피크만 나타난다. 그러나 NMR용매인 D_(2)O와 DMSO를 부피비로 1:3으로 섞어서 분석하면 LMWSC의 특성피크와 atRA의 특성피크를 모두 확인할 수 있었다. 이것은 atRA가 LMWSC와 이온결합을 할 때 전혀 손상 없이 봉입되었다는 것을 보여준다. 그리고 XRD 패턴에서는 강한 결정성 약물인 atRA의 결정성이 나노입자가 되었을 때 결정성을 찾을 수가 없었다. NMR 과 XRD 결과로부터 atRA은 키토산에 의해 싸여진 형태로 존재한다는 것을 알 수 있다. 또한 TEM 사진에서와 같이 atRA가 봉입된 LMWSC 나노입자는 구형의 형태를 갖고 있고, 입자크기가 200nm라는 것을 알 수 있다. atRA가 봉입된 LMWSC 나노입자는 봉입효율이 90% 이상이고, 방출실험 결과 2주일 정도 서서히 방출되는 것을 알 수 있다. in vitro 세포 독성 실험에서 atRA은 강한 독성을 나타내는 반면 atRA가 봉입된 나노입자는 낮은 독성을 나타냈다. 두 번째로 LMWSC을 이용하여 retinol이 봉입된 LMWSC 나노입자를 만들어 화장품 분야와 제약 분야에 응용하고자 하였다. retinol이 봉입된 LMWSC는 TEM 사진에서 보는 바와 같이 구형의 형태를 갖고 있고 입자의 크기는 50-200nm이다. 나노입자의 크기는 retinol의 양에 따라 증가 하였다. retinol의 용해도는 LMWSC에 의해 1600배 이상 증가하였다. retinol이 LMWSC과 이온결합에 의해 복합체를 형성한 것은 FT-IR 스펙트럼에 의해 확인할 수 있었다. retinol의 특성피크인 1720cm^(-1)은 낮은 농도에서는 나타나지 않았지만 높은 농도에서는 증가하였다. ^(1)H-NMR스펙트럼에서는 retinol이 봉입된 LMWSC는 NMR용매인 D_(2)O와 DMSO에 녹였을 때 retinol의 특성피크를 확인할 수 없었으며, D_(2)O와 DMSO혼합용액에 녹였을 때는 LMWSC와 retinol의 특성피크를 확인할 수 있었다. 이것은 LMWSC가 retinol을 봉입하고 있기 때문이라고 할 수 있다. 역시 XRD 패턴에서 보는 바와 같이 결정성 약물인 retinol이 LMWSC에 봉입되었을 때 retinol의 결정성이 사라지는 것을 볼 수 있다. 이 결과 또한 LMWSC에 retinol을 봉입하였기 때문이다. 이상의 결과로부터 LMWSC는 제약분야 뿐만아니라 화장품 분야에 약물전달체로 가능성을 보여주었다. This article was documented with the study to investigation the potential as biomedical material, biomedical application of low molecular water-soluble chitosan (LMWSC) with free amine group. We developed novel nanoparticles based on polyion complex formation between LMWSC and all-trans retinoic acid (atRA) for pharmaceutical application. LMWSC nanoparticles encapsulating atRA based on polyion complex ware prepared by mixing of atRA into LMWSC aqueous solution using ultra-sonication. At FT-IR spectra, carbonyl group of atRA characterized around 1690cm^(-1) disappeared or decreased when ion complexes were formed between LMWSC and atRA. At ^(1)H NMR spectra, specific peaks of atRA disappeared when atRA-encapsulated LMWSC nanoparticles were reconstituted into D_(2)O while specific peaks of atRA and LMWSC appeared at D_(2)O/DMSO (1/3, v/v) co-solvent. XRD patterns also showed that crystal peaks of atRA disappeared because atRA was completely encapsulated into LMWSC nanoparticles. LMWSC nanoparticles encapsulating atRA have spherical shapes with particle size below 200nm. The mechanism of encapsulation of atRA into LMWSC nanoparticles was thought to be an ion complex formation between LMWSC and atRA. LMWSC nanoparticles showed high atRA loading efficiency over 90% (w/w). AtRA was continuously released from nanoparticles over 10 days. In in vitro cell cytotoxicity test, free atRA was showed high cytotoxic effect against CT 26 colon carcinoma cell line on 1 day. Furthermore, an LMWSC nanoparticle was similar to free atRA against CT 26 cells on 2 day. Based on these results, it is possible to introduction of the LMWSC nanoparticles into various biomedical fields such as drug delivery. Also, We encapsulated retinol into low molecular water-soluble chitosan(LMWSC) nanoparticles and reconstituted them into aqueous solution. Retinol-encapsulated LMWSC nanoparticles were prepared for application of cosmetic and pharmaceutical applications. Retinol-encapsulated LMWSC nanoparticles has a spherical shapes and its particle size was around 50-200nm according to the drug contents. Particle size was increased according to the increase of drug contents. It was suggested that retinol was encapsulated into LMWSC nanoparticles by hydrogen bonding in results of FT-IR spectra. Specific peaks of LMWSC were splited double let to single let at low drug contents and increased according to the increase of drug contents when retinol was encapsulated into LMWSC nanoparticles. At ^(1)H NMR spectra, specific peaks of retinol were disappeared when retinol-encapsulated LMWSC nanoparticles were reconstituted into D_(2)O while specific peaks of retinol and LMWSC was appeared at D_(2)O/DMSO (1/4, v/v) co-solvent. XRD patterns also showed that crystal peaks of retinol were disappeared by encapsulation of retinol into LMWSC nanoparticles. Retinol-encapsulated nanoparticle were completely reconstituted into aqueous solution as same as original aqueous solution and zeta potential of reconstituted LMWSC nanoparticles was similar to their original solution.

A Study on Design of ebXML Messaging for B2B Electronic Commerce : B2B 전자 상거래를 위한 ebXML 메세징 설계에 관한 연구

Bugude Nagireddy Sudhakar The Graduate School Sunchon Nation Universty 2005 국내박사

본 논문에서는 기업간 전자상거래를 위한 ebXML(electronic business eXtensible Markup Language: 전자 상거래 확장 마크 업 언어) 어플리케이션을 소개하였다. 이것을 소위 "Business-to-Business eCommerce."라고 불린다. 그리고 ebXML 의 프레임워크에 대한 설명과 함께 전자 상거래 간에 발생하는 거래를 수립하기 위한 완성된 프레임워크를 제공하고 ebXML를 설계하였다. 아울러 전자 상거래 간의 통신과 거래를 확립하기 위한 신뢰할 수 있는 메시징 시스템을 제공하는 ebXML 메시징 서비스를 설계하였다. 끝으로 ebXML MSH(Message Service Handler: 메시지 서비스 처리기)를 설계하여 전자 상거래간의 거래 확립을 위한 ebXML 개발 전략, 테스트 시나리오 그리고 ebXML 메시징 기본 상호 호환성에 필요한 테스트 셋을 제공한다. 본 논문의 주요 논제들은 아래와 같다. ㆍ 메시징 모델과 특징(ebMS/MSH) ㆍ 보안 ㆍ 양질의 서비스(신뢰성) ㆍ 후 방위 시스템과의 통합 The first part of this thesis is introduction about application of ebXML (electronic business eXtensible Markup Language) for electronic business between companies. It is called "Business-to-Business eCommerce." The second part of this thesis concentrates on framework of ebXML (electronic business eXtensible Markup Language), which provides a complete framework for setting up electronic business-to-business transactions and explains about ebXML terminology. The third part of this thesis centralizes on ebXML Messaging Service, which provides a reliable messaging system for setting up electronic business-to-business communications/transactions. And finally, the fourth part of this thesis explains about ebXML MSH (Message Service Handler), which provides an ebXML development strategy, Test Scenarios, and ebXML Messaging Basic Interoperability Test Suite for setting up electronic business-to-business transactions. The main topics in this thesis are: ㆍ Messaging model and features (ebMS/MSH) ㆍ Security ㆍ Quality of service (Reliability) ㆍ Integration with back-end systems.

Taxonomic Study of Genus Bryoria(Lichenized Ascomycota, Parmeliaceae) from the Sino-Himalays : Sino-Himalaya 지역에서의 Bryoria 속 지의류의 분류학적 연구

Wang, Li-Song The Graduate School Sunchon Nation Universty 2006 국내박사

Sino-Himalaya 지역에서 Bryoria 속에 속하는 20종을 기록하여 보고하였다. 그 중에서 Bryoria fastigiata Li S. Wang과 B. flocculosa Li S. Wang를 신종으로 보고하며, B. himalayana var. sorediata Li S. Wang은 새로운 변종으로 보고하며, B. nadvornikiana, B. trichodes subsp. trichodes와 B. tenuis종은 중국에서 최초로 보고하며, B. trichodes subsp. americana와 B. furcellata는 Sino-Himalaya 지역에서 최초로 보고하며, B. asiatica, B. himalayana와 B. poeltii는 신장자치구 지역에서 B. divergescens, B. lactinea, B. nitidula와 B. variabilis는 사천성 지역에서, B. bicolor는 신장과 사천성 지역, B. furcellata는 사천성과 운남성 지역에서 최초로 보고한다. 각 종에 대한 이차대사산물을 분석한 결과, usnic acid와 lobaric acid를 본 속에서 최초로 보고 하였다. 각 종에 대한 분류키와 형태, 서식처 및 분포에 대하여 기술하였다. Twenty taxa of the genus Bryoria were recognized and recorded in the Sino-Himalayas. Among them, Bryoria fastigiata Li S. Wang and B. flocculosa Li S. Wang are new species, B. himalayana var. sorediata Li S. Wang is a new variety; Bryoria nadvornikiana, B. trichodes subsp. trichodes and B. tenuis are new to China; B. trichodes subsp. americana and B. furcellata are new to the Sino-Himalayas; B. asiatica, B. himalayana and B. poeltii are new to Xizang; B. divergescens, B. lactinea, B. nitidula and B. variabilis are new to Sichuan; B. bicolor is new to Sichuan and Xizang; B. furcellata is new to Sichuan and Yunnan. Secondary chemical products were studied for each taxon. Among them, usnic and lobaric acids were first reported in the genus. A key to the species and notes on morphology, habitat and distribution are given. One of specimen was collected from the type locality of B. divergescens (Li-S. Wang 04-23413, in KUN-L), which was selected as an epitype of this species, because of the fragmental nature of the holotype (H-Nyl. 35972).