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Niranjan Parajuli 선문대학교 대학원 2004 국내박사
The main objective of the present study was genome analyses of Streptomyces peucetius ATCC 27952. We have determined the genome sequence of 8.7 Mb chromosome of organism, which produces clinically important anthracyline chemotherapeutic agents of the polyketide class of antibiotics, daunorubicin and doxorubicin. The cytochrome P450 (CYP) superfamily is represented by 19 sequences in the S. peucetius. CYP252A1 is the new family found in S. peucetius, which shares 38% identity to CYP51 from Streptomyces coelicolor A3 (2). Although two ferredoxins and four ferredoxin reductases have been identified so far, only one ferredoxin reducatse was found in cluster of CYP147F1 in S. peucetius. CYP105P2 (cytochrome P450) from S. peucetius was cloned and expressed in E. coli. In our best knowledge, cis-5,6,7,8,9-pentahydroxycinnamic acid is a novel compound, which was isolated by enzymatic reaction by CYP105P2 with 7-ethoxycoumarin. Other hydroxylated derivatives of cinnamic acid, benzoic acid and salicylic acid were also isolated using the same enzyme upon respective substances. Effect of CYP105P2 on durg metabolism was also studied. Several regulatory genes are analysed from S. peucetius. These include afsR, afsK, abaA, abaB, adsA, vbrA, pknG and rarA. We also analyzed other genes from this genome, which have ability to enhance secondary metabolites production. These include SAM (S-adenosylmethionine synthetase), ppGpp and sodN. afsR, global regulatory gene (2.9 kb) was cloned and expressed in Streptomyces species under the control of ermE* promoter. Actinorhodin production was found to increase by 3 fold in S. lividans GIBR (transfromant of afsR in S. lividans TK24) with respect to S. lividans IBR (Control, transfromant of pIBR25 in S. lividans TK24). For the first time, the conserved regions of afsR from S. achromogens (rubradirin producer), and S. clavuligerous (clavulinic acid producer) were cloned and sequenced. S. peucetius genome shows the homologue gene clusters of some notable polyketide sysnthases (PKSs) including filpin, actinonycin, amphotericin, spinosad, nystatin, oleandomycin, aureothin, vicenistatin, pristinamycin and virginiamycin. We have also compared the daunorubicin and doxorubicin (DNR/DXR) biosynthetic gene cluster of two strains (29050 and 27952). Our sequence analyses revealed that dpsF is clustered with dpsE, dpsA and dpsB in contrast to biosynthetic pathway proposed by Hutchison et al. We also extended our study to dTDP-L-rhamnose biosynthetic gene cluster from Thermus caldophilus GK24. Thermophilic glucose-1-phosphate thymidylyltransferase (stRmlA), encoding 356 amino acids with a calculated molecular weight 38 kDa was expressed under the control of the tac promoter in E. coli. The expressed enzyme, stRmlA is thermostable up to 70°C and apparently retained its activity even up to 90°C. stRmlA showed its thermal activity up to 90°C only in the presence of dTTP and dTMP, thermal activity being the highest at 70°C. Unlike other mesophilic counterparts, it showed catalytic activity on a wide range of pH (2-13), and separately, in the presence of various metal ions. In an attempt to characterize peculiar thermal behavior of stRmlA, we compared codon sequence, nucleotide frequency, secondary structure, and tertiary structure with various other mesophilic counterparts. The future perspectives of this study are discussed in each chapter. 본 학위논문은 Streptomyces peucetius ATCC 27952 지놈분석 관련 연구이다. 의약품으로 중요한 polyketide 계열 항암제로서 anthracycline 화학요법 치료제인 doxorubicin 과 daunorubicin 을 생산하는 균주로서, 균주의 8.7 Mb chromosome 에 해당하는 지놈을 염기서열분석 하였다. cytochrome P450 (CYP) superfamily 가 S. peucetius 에서 19 개의 염기서열이 분석되었다. 그 중 CYP252A1 은 S. peucetius 에서 발견된 새로운 유형이며, Streptomyces coelicolor A3 (2)에 있는 CYP51 과는 38% 의 유사성이 있다 . 두개의 ferrodoxin 과 ferodoxin reductase 유사 유전자가 아직 반응성은 확인되지 않았지만 , 그 중에 하나는 CYP147F1 과 집단으로 있다. CYP105P2 (cytochrome P450 )는 재조합하여 E. coli 에서 발현되었다. 발현된 CYP105P2 는 7-ethoxycoumarin 과 반응하여 효소의 반응성을 확인하였으며, 반응 결과물은 아직까지 보고되지 않은 cis-5,6,7,8,9-pentahydroxycinnamic acid 로 분석되었다. 그 외에 cinnamic acid, benzoic acid 및 salicyclic acid 도 반응하여 벤젠링에 모두 hydroxylation 되는 같은 결과를 얻었다. Drug metabolism 에 대한 CYP105P의 반응성도 역시 조사했다. 여러개의 조절기작 유전자가 S. peucetius 에서 분석되었다. 이들은 afsR, afsK, abaA, abaB, adsA, vbrA pknG 및 rarA 와 유사성이 있는 유전자들이며, 이들 유전자 외에 이차대사물질 생산에 영향을 주는 다른 유전자들도 분석 되었다. 이들은 SAM synthetase, ppGpp 및 sodN 등과 유사성이 있는 유전자들을 찾았다. 조절기작 유전자인 afsR (2.9 kb) 는 ermE* promoter 에 조절되는 방선균 벡터에 재조합하여 발현하였다. S. lividance 에 afsR 재조합 벡터를 전이된 균주인 S. lividance GIBR 3 배정도의 actinorhodin 생산량이 증가하였다. 기존에 알려져 있는 afsR 유전자를 비교하여 유사성이 높은 영역으로부터 디자인된 primer 를 제작하여 PCR 방법으로 S. achromogenes (rubradirin 생산균주 ) 및 S. clavuligerous (clavulinic acid 생산균주 ) 로 부터 afsR 유사 유전자를 클론하여 염기서열분석하여 afsR 유사 유전자를 확보 할 수 있다. S. peucetius 지놈에는 filipin, actinonycin, amphotericin, spinosad, nystatin, oleandromycin, aureothin, vicenistatin, pristinamycin 및 virginiamycin 을 포함해서 여러개의 새로운 polyketide synthase (PKS)의 유사 유전자 집단들이 있다. 특히 S. peucetius 계열의 균주인 ATCC 29050 및 ATCC 27952 에 있는 daunorubicin (DNR) 및 doxorubicin (DXR) 생합성 유전자 집단을 비교하였다. ATCC 27952 에서 분석된 결과는 Hutchinson 그룹에서 발표된 생합성 유전자 집단과는 달리 dpsF 가 dpsE, dpsA 및 dpsB 와 함께 집단화 되어 있다. Thermus caldophilus GK24 로부터 dTDP-L-rhamnose 생합성 유전자 집단을 연구하였다. 열적 안정 효소인 glucose-1-phosphate thymidylytransferase (stRmlA) 는 356 개의 아미노산으로 구성되어 있고, 분자량은 38 kDa 으로 E. coli 에서 tac promoter 를 가진 벡터에서 발현하였다. 발현된 stRmlA 는 70℃ 이상 열적으로 안정성을 보여주고 있으며, 90℃이상에서도 여전히 반응성이 남아 있다. stRmlA 은 단지 dTTP 및 dTMP 존재할 때 90℃에서 열적 안정성을 보여주고 있다. 다른 일반적인 온도에 작용하는 효소들과 달리, 이 효소는 pH 가 2 에서 13 까지 넓은 영역에서도 효소의 반응성을 보여주고 있으며, 여러 금속 이온에서도 같은 반응성을 갖는다. stRmlA 의 특별한 열에 안정한 이유를 분석하기 위해, 여러 가지 다른 mesophilic 효소와 함께 코돈 분석비교, 핵산빈도 (nucleotide frequency), 이차구조 및 삼차구조를 비교하였다.
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